本研究描述了一种利用T7系统在单个质粒上共表达多个基因的方法 大肠杆菌 使用 pMGX 质粒系统。
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方法文章
可诱导的T7 RNA聚合酶介导的多基因表达系统，pMGX
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
多蛋白共表达在合成生物学、蛋白质-蛋白质复合物研究以及生物合成途径的表征与利用中正变得日益重要。本文描述了一种高效系统的应用，该系统可用于构建由可诱导T7 RNA聚合酶调控的多基因合成操纵子。此系统能够实现单个质粒上多个基因的同时表达。本文公开了一组四种相关的载体：pMGX-A、pMGX-hisA、pMGX-K 和 pMGX-hisK，它们分别携带氨苄青霉素或卡那霉素抗性筛选标记（A 和 K），并可选择是否含有N端六组氨酸标签（his）。文中提供了利用该载体系统构建合成操纵子的详细实验方案及相关数据，结果表明，基于pMGX的系统可轻松构建包含五个基因的表达体系，并在大肠杆菌（Escherichia coli）中成功表达全部五种编码蛋白。该系统与实验流程使研究人员能够常规地在大肠杆菌（E. coli）中表达复杂的多组分模块和代谢途径。
引言
多种蛋白质的共表达正变得日益重要，尤其在合成生物学应用中，需要同时表达多个功能模块1；在研究蛋白质-蛋白质复合物时，其表达与功能通常依赖于共表达2,3；以及在表征和利用生物合成途径时，通路中的每个基因都必须表达4,5,6,7,8。目前已开发出多种用于共表达的系统，尤其是在实验室重组蛋白表达的常用宿主生物Escherichia coli中9。例如，可使用带有不同可筛选标记的多个质粒，通过大量不同的表达载体分别表达各个蛋白质10,11。用于多蛋白表达的单质粒系统则可采用多种策略：使用多个启动子分别调控各基因的表达10,12；采用合成操纵子，将多个基因编码....
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方案
1. 获取目的基因
- 设计合成基因。
- 优化基因序列以适用于 E. coli 表达。
- 从序列中去除任何有问题的限制性酶切位点（AvrII、NdeI、EcoRI 和 XbaI）。
- 引入用于克隆的限制性酶切位点；建议使用 5′-NdeI 位点和 3′-EcoRI 位点。如有必要，也可使用其他位点；请参考所选质粒的多克隆区域（图 S1-S4）。如需要，可加入 5′ 或 3′ 编码标签以用于 Western 印迹检测。
- 将设计好的基因进行商业合成订购。
- 根据制造商说明书，使用平末端克隆试剂盒将基因平末端克隆至平末端载体中；或设计引物扩增该基因（然后进入步骤 1.2.2）；或在基因两端添加额外的 5′ 和 3′ 末端以便直接克隆至 pMGX 质粒，并进入步骤 2。本文代表性结果来自将目标基因进行平末端克隆。
- 扩增目标基因（来自已设计并优化的合成基因，或含有目标基因的模板 DNA）15。
- 设计带有克隆用限制性酶切位点的引物；建议使用 5′-NdeI 位点和 3′-EcoRI 位点。如有必要，也可使用其他位点；请参考所选....
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结果
本研究旨在从单个质粒中共同表达五种蛋白质。编码N端或C端六组氨酸标签的五段密码子优化的合成基因片段通过商业途径购得。通过PCR扩增合成基因，并分别克隆至PCR-blunt载体中进行测序。为构建多顺反子质粒，首先将五个目的基因依次克隆至合适的pMGX质粒（pMGX-A）中。 图2 显示 PCRBlunt-yfg1 和 PCRBlunt-yfg2 除了用 NdeI + EcoRI 消化的 pMGX-A 外（见步骤 2）。为了将前两个基因克隆到 pMGX-A 中，将质粒用 NdeI + EcoRI 消化（图2）。将目的基因克隆至 pMGX-A 载体后，新构建的质粒命名为 pMGX-yfg1 和 pMGX-yfg2用 AvrII + XbaI 进行酶切消化，以确认获得成功的克隆，结果如所获得的 1.1-kb 和 1.3-kb 条带所示 图3
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讨论
多个基因的共表达正变得日益重要，特别是在表征和重建复杂的多基因代谢通路方面3,4,5。pMGX系统使在E. coli中进行多基因共表达成为常规操作6,7,8，并为不同研究者提供了便捷的工具。本研究展示了利用pMGX-A单个质粒系统可同时表达五种目标蛋白。目前许多可用的共表达系统仅允许插入两个基因，从而构建双顺反子质粒，例如pET Duet载体12。若需引入更多基因，则必须使用带有不同筛选标记的多个双顺反子载体。与其他多基因表达系统相比，pMGX系统可轻松将多个基因克隆至同一质粒中，并能够在无需不同供体质粒或去除基因内部多个限制性酶切位点的情况下重复使用限制性酶切位点1.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 酶 | |||
| 小牛肠碱性磷酸酶（CIP） | New England Biolabs | M0290S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | |
| Herculase II 融合 DNA 聚合酶 | Agilent Technologies | 600677 | |
| T4 DNA 连接酶 | New England Biolabs | M0202S | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 试剂 | |||
| 1 kb DNA 标准分子量标记 | New England Biolabs | N3232L | |
| 4-20% Mini-PROTEAN TGX 免染蛋白凝胶 | Bio-Rad | 456-8095 | |
| 50x TAE 缓冲液 | Fisher Thermo Scientific | BP1332-4 | |
| 琼脂 | Fisher Thermo Scientific | BP1423-500 | |
| 琼脂糖 | Fisher Thermo Scientific | BP160-500 | |
| 氨苄青霉素 | Sigma-Alrich | A9518-5G | |
| BL21 (DE3) 化学感受态细胞 | 实验室自制感受态细胞 | ||
| B-PER 细菌蛋白提取试剂 | Fisher Thermo Scientific | PI78243 | |
| dNTP 混合物 | Agilent Technologies | 随聚合酶提供 | |
| 凝胶回收试剂盒 | Omega | D2500-02 | E.Z.N.A 凝胶回收试剂盒，由 VWR 提供，货号：CA101318-972 |
| 甘氨酸 | Fisher Thermo Scientific | BP381-1 | |
| His 标签抗体 [HRP]，单克隆抗体，小鼠来源 | GenScript | A00612 | |
| Immobilon Western 化学发光 HRP 底物 | EMD Millipore | WBKLS0100 | |
| IPTG | Sigma-Alrich | 15502-10G | |
| LB 培养基 | Fisher Thermo Scientific | BP1426-500 | |
| 甲醇 | Fisher Thermo Scientific | A411-20 | |
| 巴氏杀菌脱脂奶粉 | 本地杂货店 | 普通杂货店品牌奶粉即可满足要求 | |
| 硝酸纤维素膜 | Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) | 10600007 | PT 型膜，孔径 0.45 µm，尺寸 200 mm × 4 m，由 VWR 提供，货号：CA10061-086 |
| 质粒 DNA 提取试剂盒 | Omega | D6943-02 | E.Z.N.A 质粒 DNA 小量提取试剂盒 I，由 VWR 提供，货号：CA101318-898 |
| pMGX | Boddy 实验室 | 请联系 Boddy 实验室获取，邮箱：cboddy@uottawa.ca | |
| 引物 | Integrated DNA Technologies | 根据目标基因设计所需引物 | |
| 合成基因 | Life Technologies | 根据需要进行设计和优化 | |
| 厚型印迹滤纸 | Bio-Rad | 1703932 | |
| Tris 碱 | BioShop | TRS001.1 | |
| Tween-20 | Sigma-Alrich | P9416-50ML | |
| XL1-Blue 化学感受态细胞 | 实验室自制感受态细胞 | ||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 设备 | |||
| BioSpectrometer | Eppendorf | RK-83600-07 | |
| 凝胶电泳槽 - PAGE | Bio-Rad | 1658005 | Mini-PROTEIN Tetra 垂直电泳槽 |
| 凝胶成像系统 | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| 恒温培养箱（烘箱） | Fisher Thermo Scientific | 11-690-650D | Isotemp |
| 摇床培养箱 | Fisher Thermo Scientific | SHKE6000-7 | MaxQ 6000 |
| Personna 剃刀 | Fisher Thermo Scientific | S04615 | |
| 电源模块 | Bio-Rad | S65533Q | FB300 |
| 透射紫外灯 | VWR International | M-10E,6W | |
| 热循环仪 | Eppendorf | Z316091 | Mastercycler Personal，由 Sigma 提供 |
| 紫外面罩 | 18-999-4542 | ||
| 水浴锅 | Fisher Thermo Scientific | 15-460-2SQ | |
| Western 转膜装置 | Bio-Rad | 1703935 | Mini-Trans Blot 转膜槽 |
参考文献
- Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
- Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.<....
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重印与许可
