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方法文章

可诱导的T7 RNA聚合酶介导的多基因表达系统，pMGX

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DOI：

10.3791/55187

⸱

2017年6月27日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biomolecular Sciences, University of Ottawa, 2School of Biosciences, The University of Nottingham Malaysia Campus

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究描述了一种利用T7系统在单个质粒上共表达多个基因的方法 大肠杆菌 使用 pMGX 质粒系统。

摘要

多蛋白共表达在合成生物学、蛋白质-蛋白质复合物研究以及生物合成途径的表征与利用中正变得日益重要。本文描述了一种高效系统的应用，该系统可用于构建由可诱导T7 RNA聚合酶调控的多基因合成操纵子。此系统能够实现单个质粒上多个基因的同时表达。本文公开了一组四种相关的载体：pMGX-A、pMGX-hisA、pMGX-K 和 pMGX-hisK，它们分别携带氨苄青霉素或卡那霉素抗性筛选标记（A 和 K），并可选择是否含有N端六组氨酸标签（his）。文中提供了利用该载体系统构建合成操纵子的详细实验方案及相关数据，结果表明，基于pMGX的系统可轻松构建包含五个基因的表达体系，并在大肠杆菌（Escherichia coli）中成功表达全部五种编码蛋白。该系统与实验流程使研究人员能够常规地在大肠杆菌（E. coli）中表达复杂的多组分模块和代谢途径。

引言

多种蛋白质的共表达正变得日益重要，尤其在合成生物学应用中，需要同时表达多个功能模块1；在研究蛋白质-蛋白质复合物时，其表达与功能通常依赖于共表达2,3；以及在表征和利用生物合成途径时，通路中的每个基因都必须表达4,5,6,7,8。目前已开发出多种用于共表达的系统，尤其是在实验室重组蛋白表达的常用宿主生物Escherichia coli中9。例如，可使用带有不同可筛选标记的多个质粒，通过大量不同的表达载体分别表达各个蛋白质10,11。用于多蛋白表达的单质粒系统则可采用多种策略：使用多个启动子分别调控各基因的表达10,12；采用合成操纵子，将多个基因编码在同一转录本中2,13；或在某些情况下，使用单个基因编码一条多肽链，随后通过蛋白水解加工产生成熟的目标蛋白质14。

双顺反子构建图解，DNA 酶切，基因克隆的连接过程，质粒载体。
图 1：pMGX 工作流程展示多顺反子载体的构建。 pMGX 系统提供了一种灵活且易于使用的策略，用于在可诱导的 T7 启动子控制下构建合成操纵子。请点击此处查看该图的放大版本。

本研究描述了一种高效系统的使用方法，该系统用于在可诱导的T7 RNA聚合酶控制下构建多基因合成操纵子（图1）。该系统能够在单个质粒上同时表达多个基因。该系统基于一种最初称为pKH22的质粒系统，已在多种不同应用中成功使用6,7,8。本文进一步扩展了该质粒系统，新增四种相关载体：pMGX-A，一种无C端或N端标签、带有氨苄青霉素抗性标记的表达载体；pMGX-hisA，一种编码N端六聚组氨酸标签、带有氨苄青霉素抗性标记的表达载体；pMGX-K，一种无C端或N端标签、带有卡那霉素抗性标记的表达载体；以及pMGX-hisK，一种编码N端六聚组氨酸标签、带有卡那霉素抗性标记的表达载体。本研究展示了利用pMGX系统（特别是pMGX-A）构建包含五个基因的多顺反子载体的方法，并在大肠杆菌（Escherichia coli）中成功实现了各个蛋白质的独立表达。

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方案

1. 获取目的基因

  1. 设计合成基因。
    1. 优化基因序列以适用于 E. coli 表达。
    2. 从序列中去除任何有问题的限制性酶切位点（AvrII、NdeI、EcoRI 和 XbaI）。
    3. 引入用于克隆的限制性酶切位点；建议使用 5′-NdeI 位点和 3′-EcoRI 位点。如有必要，也可使用其他位点；请参考所选质粒的多克隆区域（图 S1-S4）。如需要，可加入 5′ 或 3′ 编码标签以用于 Western 印迹检测。
    4. 将设计好的基因进行商业合成订购。
    5. 根据制造商说明书，使用平末端克隆试剂盒将基因平末端克隆至平末端载体中；或设计引物扩增该基因（然后进入步骤 1.2.2）；或在基因两端添加额外的 5′ 和 3′ 末端以便直接克隆至 pMGX 质粒，并进入步骤 2。本文代表性结果来自将目标基因进行平末端克隆。
  2. 扩增目标基因（来自已设计并优化的合成基因，或含有目标基因的模板 DNA）15。
    1. 设计带有克隆用限制性酶切位点的引物；建议使用 5′-NdeI 位点和 3′-EcoRI 位点。如有必要，也可使用其他位点；请参考所选质粒的多克隆区域（图 S1-S4）。如需要，可加入 5′ 或 3′ 编码标签以用于 Western 印迹检测。
    2. 通过 PCR 扩增目标基因15。
    3. 通过琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物16。
    4. 若出现非特异性扩增，通过凝胶回收法纯化扩增的基因；若无非特异性条带，则使用酶反应纯化试剂盒进行纯化。
    5. 使用分光光度计在 260 nm 处检测吸光度以定量 DNA；以洗脱缓冲液作为空白对照17。

2. 将目的基因克隆至多基因表达系统载体 pMGX18

  1. 用 NdeI 和 EcoRI 对获得的目的基因和所需的载体 pMGX 进行限制性酶切。
    注意：如果回收到大量重新环化的质粒，请在加入 EcoRI 前让 NdeI 酶切反应进行 1 小时。
    1. 使用 40 µL 酶切反应体系，其中包含 0.5–1.5 µg DNA 和每种酶各 1 µL，以及 4 µL 相应的 10x 缓冲液。
    2. 对于 NdeI 和 EcoRI 双酶切，使用 EcoRI 缓冲液，先加入 NdeI 内切酶，在 37 °C 下酶切 1 小时；然后加入 EcoRI 内切酶，继续反应 1 小时。由于 NdeI 对靠近 DNA 末端的切割位点较为敏感，若先用 EcoRI 酶切可能会影响 NdeI 的有效切割。
  2. 将限制性酶切产物在琼脂糖凝胶上进行电泳（对于 1 kb 的基因，使用 0.7% 琼脂糖凝胶，110 V 电泳 55 分钟；针对不同大小的基因选择合适的琼脂糖浓度，请参考文献16）。
  3. 使用洁净的手术刀或剃须刀片切下插入片段和载体条带，并将切下的凝胶片段放入 1.5 mL 离心管中。
  4. 根据试剂盒制造商的操作说明，使用凝胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中提取 DNA。
  5. 按照插入片段与载体摩尔比为 3:1 的比例，将目的基因连接至 pMGX 载体中；同时设置一个不含插入片段的 pMGX 载体的阴性连接对照。
    1. 配置 20 µL 连接反应体系，包含 1 µL T4 DNA 连接酶、0.15–0.5 µg 载体 DNA（约 5 µL），以及根据 3:1 的插入片段/载体比例和待插入基因大小计算出的适量插入片段；pMGX 载体骨架的大小介于 5,312 至 5,504 bp 之间。设置一个除目的基因外其余组分均相同的阴性对照反应。确保阴性对照连接反应与含插入片段的连接反应中所用的载体 DNA 量相等。
  6. 将连接产物转化至 XL1-Blue 感受态大肠杆菌（E. coli）中，获得重组质粒 pMGX-yfg1（含目的基因 1）、pMGX-yfg2（含目的基因 2）… pMGX-yfgn（含目的基因 n）。操作过程中采用无菌技术（在生物安全柜内或火焰旁进行）。
    1. 将化学感受态 XL1-Blue E. coli 细胞（100 µL 分装）置于冰上融化 5 分钟，然后加入 5 µL 连接反应产物，冰上孵育 30 分钟。
    2. 在 42 °C 水浴中热激 45 秒，随后加入 200 µL 冷 LB 培养基，再冰上孵育 2 分钟。
    3. 在 37 °C、220 rpm 条件下振荡培养 1 小时，然后取 100 µL 菌液涂布于含有适当筛选标记（氨苄青霉素或卡那霉素）的 LB 琼脂平板上。
  7. 筛选阳性转化子克隆。
    1. 比较阴性对照组和连接组平板上的菌落数量。理想的菌落比例应大于 1:2。若阴性对照平板上出现大量菌落，请返回步骤 2.1 并参考相关注意事项。
    2. 根据阴性对照与连接组的菌落数比例，从每个不同基因的连接反应中挑选 4–8 个单菌落（1–n）用于筛选，分别接种至含相应抗生素的 4 mL LB 液体培养基中，37 °C、220 rpm 振荡过夜培养。
    3. 根据试剂盒制造商的操作说明，使用质粒 DNA 提取试剂盒提取质粒 DNA。
    4. 设置 20 µL 的 NdeI + EcoRI 双酶切反应体系，包含 150–500 ng DNA、每种酶各 1 µL 及 2 µL 相应的 10x 缓冲液。在此反应中，NdeI 和 EcoRI 应同时加入，以便确认目的基因位于两个限制性酶切位点之间。建议设置一个空载体 pMGX 的阴性对照。在 37 °C 水浴中酶切 2 小时。

3. 将基因2插入含有基因1的pMGX载体pMGX-yfg1

  1. 用 AvrII 酶切 pMGX-yfg1，并用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理。
    1. 使用 40 µL 酶切反应体系，其中包含 0.5–1.5 µg 载体 DNA（约 5–10 µL 提取的 DNA）和 1 µL AvrII 酶，以及 4 µL 相应的 10× 缓冲液。在 37 °C 下酶切 1.5 小时，然后加入 1.5 µL CIP，继续在 37 °C 下孵育 30 分钟。
  2. 用 AvrII 和 XbaI 酶切 pMGX-yfg2，以释放目的基因。
    1. 使用 40 µL 酶切反应体系，其中包含 0.5–1.5 µg DNA，每种酶各 1 µL，并加入 4 µL 相应的 10× 缓冲液。在 37 °C 下酶切 2 小时。
  3. 将酶切产物在适当浓度（0.7%）的琼脂糖凝胶上进行电泳，使用洁净的手术刀或刀片切下插入片段和载体条带（参见步骤 2.2–2.3）。
  4. 按照试剂盒生产商的说明书，使用凝胶回收试剂盒提取 DNA，并对 DNA 进行定量17。
  5. 按照插入片段与载体摩尔比为 3:1 的比例，将基因 2 连接到 pMGX-yfg1 中。同时设置一个不含插入片段的 pMGX-yfg1 酶切产物的阴性连接对照。操作方法同步骤 2.5。
  6. 取 5 µL 连接反应产物，转化至 XL1-Blue 感受态 E. coli 细胞中，包括连接成功的质粒 pMGX-yfg1,2（含有目的基因 1 和 2）以及阴性对照 pMGX-yfg1，操作参见步骤 2.6。
  7. 比较阴性对照组和连接组平板上的菌落数量。理想的菌落比例应大于 1:2。若阴性对照平板上出现大量菌落，请返回步骤 3.1，检查 CIP 处理过程。
  8. 根据阴性对照与连接组的菌落比例，从连接反应平板上挑选 4–8 个单菌落，分别接种于含适当抗生素的 4 mL LB 培养基中，在 37 °C、220 rpm 条件下过夜培养。
  9. 按照试剂盒生产商的说明书，使用质粒 DNA 提取试剂盒提取质粒 DNA，并进行定量17。
  10. 通过 EcoRI 酶切 pMGX-yfg1,2 来筛选第二个基因的有效插入。
    1. 使用 20 µL 酶切反应体系，其中包含 150–500 ng DNA、1 µL EcoRI 酶和 2 µL EcoRI 10× 缓冲液。在 37 °C 下酶切 2 小时。
  11. 将酶切产物在适当浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否出现与基因 2 大小相符的条带（参见步骤 2.2）。需注意，基因可能以非预期的反向方向插入载体中。

4. 将第三个基因添加到含有基因1和基因2的pMGX载体中，即pMGX-yfg1,2

  1. 用 AvrII 酶切 pMGX-yfg1,2，并用 CIP 处理，操作如步骤 3.1 所示。
  2. 用 AvrII 和 XbaI 酶切 pMGX-yfg3，操作如步骤 3.2 所示。
  3. 将限制性酶切产物在适当浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳，使用洁净的手术刀或刀片切下插入片段和载体条带；参见步骤 2.2–2.3。
  4. 使用凝胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中提取 DNA，并对 DNA 进行定量17。
  5. 按照 3:1 的插入片段与载体摩尔比，将基因 3 连接到 pMGX-yfg1,2 中，并设置一个不含额外插入片段的 pMGX-yfg1,2 酶切产物的阴性连接对照，操作如步骤 3.5 所示。
  6. 将 5 µL 连接反应产物转化至 XL1-Blue 感受态 E. coli 细胞中，包括连接成功的质粒 pMGX-yfg1,2,3（包含目标基因 1、2 和 3）以及阴性对照 pMGX-yfg1,2，操作如步骤 2.6 所示。
  7. 比较阴性对照组和连接组平板上的菌落数量。若阴性对照平板上出现大量菌落，请返回步骤 4.1 并检查 CIP 处理过程。
  8. 根据阴性对照与连接组的菌落数量比例，从连接反应平板上挑选 4–8 个单菌落，分别接种于含有适当抗生素的 4 mL LB 培养基中；在 37 °C、220 rpm 条件下过夜培养。
  9. 按照制造商说明书，使用质粒 DNA 提取试剂盒提取质粒 DNA。
  10. 通过使用 EcoRI 对 pMGX-yfg1,2,3 进行限制性酶切，检测第三个基因是否成功插入，操作如步骤 3.10 所示。
  11. 将酶切产物在适当浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳；观察是否出现与基因 2 和基因 3 大小相符的条带（参见步骤 2.2）。注意：基因 3 可能以不期望的反向插入载体中。若基因 2 与基因 3 大小相同，则需选择另一个合适的限制性酶切位点用于筛选。
    注意：根据需要，对每个新基因重复上述步骤。

5. 利用多基因表达系统产生目的蛋白并通过蛋白质印迹法评估表达水平

  1. 将包含所有目的基因的阳性克隆转化至化学感受态、用于蛋白表达的菌株中 E. coli，例如 BL21-(λDE3)。
    1. 解冻100 µL化学感受态BL21-(λDE3)菌液 E. coli 冰上孵育5分钟，然后加入1 µL阳性克隆质粒DNA；冰上孵育30分钟。
    2. 将细胞在42 °C水浴中热激45秒，然后加入200 µL预冷的LB培养基。冰上孵育2分钟。
    3. 在37 °C、220 rpm条件下振荡培养细胞1小时，然后取100 µL菌液涂布于含有适当选择标记（氨苄青霉素或卡那霉素）的LB琼脂平板上。
  2. 通过异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导表达蛋白。
    1. 从B21-(λDE3)转化平板上挑取单克隆菌落，接种于含相应抗生素的4 mL LB培养基中，于37 °C、220 rpm条件下振荡培养过夜。
    2. 使用1 mL过夜培养物接种100 mL含适当抗生素的LB培养基。
    3. 在37 °C、220 rpm振荡培养至OD600 0.6。
    4. 用100 µM IPTG诱导培养，在25 °C、220 rpm条件下培养15小时。
    5. 取1 mL培养物，于13,000 x g离心1分钟，弃上清液。
  3. 使用裂解液按照制造商说明书裂解细胞，对可溶性细胞裂解物进行蛋白质印迹分析，以确定所有蛋白是否成功表达19.

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结果

本研究旨在从单个质粒中共同表达五种蛋白质。编码N端或C端六组氨酸标签的五段密码子优化的合成基因片段通过商业途径购得。通过PCR扩增合成基因，并分别克隆至PCR-blunt载体中进行测序。为构建多顺反子质粒，首先将五个目的基因依次克隆至合适的pMGX质粒（pMGX-A）中。 图2 显示 PCRBlunt-yfg1 和 PCRBlunt-yfg2 除了用 NdeI + EcoRI 消化的 pMGX-A 外（见步骤 2）。为了将前两个基因克隆到 pMGX-A 中，将质粒用 NdeI + EcoRI 消化（图2）。将目的基因克隆至 pMGX-A 载体后，新构建的质粒命名为 pMGX-yfg1 和 pMGX-yfg2用 AvrII + XbaI 进行酶切消化，以确认获得成功的克隆，结果如所获得的 1.1-kb 和 1.3-kb 条带所示 图3

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讨论

多个基因的共表达正变得日益重要，特别是在表征和重建复杂的多基因代谢通路方面3,4,5。pMGX系统使在E. coli中进行多基因共表达成为常规操作6,7,8，并为不同研究者提供了便捷的工具。本研究展示了利用pMGX-A单个质粒系统可同时表达五种目标蛋白。目前许多可用的共表达系统仅允许插入两个基因，从而构建双顺反子质粒，例如pET Duet载体12。若需引入更多基因，则必须使用带有不同筛选标记的多个双顺反子载体。与其他多基因表达系统相比，pMGX系统可轻松将多个基因克隆至同一质粒中，并能够在无需不同供体质粒或去除基因内部多个限制性酶切位点的情况下重复使用限制性酶切位点1...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酶
小牛肠碱性磷酸酶（CIP）New England BiolabsM0290S
AvrIINew England BiolabsR0174S
EcoRINew England BiolabsR0101S
NdeINew England BiolabsR0111S
XbaINew England BiolabsR0145S
Herculase II 融合 DNA 聚合酶Agilent Technologies600677
T4 DNA 连接酶New England BiolabsM0202S
名称公司目录编号备注
试剂
1 kb DNA 标准分子量标记New England BiolabsN3232L
4-20% Mini-PROTEAN TGX 免染蛋白凝胶Bio-Rad456-8095
50x TAE 缓冲液Fisher Thermo ScientificBP1332-4
琼脂Fisher Thermo ScientificBP1423-500
琼脂糖Fisher Thermo ScientificBP160-500
氨苄青霉素Sigma-AlrichA9518-5G
BL21 (DE3) 化学感受态细胞实验室自制感受态细胞
B-PER 细菌蛋白提取试剂Fisher Thermo ScientificPI78243
dNTP 混合物Agilent Technologies随聚合酶提供
凝胶回收试剂盒OmegaD2500-02E.Z.N.A 凝胶回收试剂盒，由 VWR 提供，货号：CA101318-972
甘氨酸Fisher Thermo ScientificBP381-1
His 标签抗体 [HRP]，单克隆抗体，小鼠来源GenScriptA00612
Immobilon Western 化学发光 HRP 底物EMD MilliporeWBKLS0100
IPTGSigma-Alrich15502-10G
LB 培养基Fisher Thermo ScientificBP1426-500
甲醇Fisher Thermo ScientificA411-20
巴氏杀菌脱脂奶粉本地杂货店普通杂货店品牌奶粉即可满足要求
硝酸纤维素膜Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)10600007PT 型膜，孔径 0.45 µm，尺寸 200 mm × 4 m，由 VWR 提供，货号：CA10061-086
质粒 DNA 提取试剂盒OmegaD6943-02E.Z.N.A 质粒 DNA 小量提取试剂盒 I，由 VWR 提供，货号：CA101318-898
pMGXBoddy 实验室请联系 Boddy 实验室获取，邮箱：cboddy@uottawa.ca
引物Integrated DNA Technologies根据目标基因设计所需引物
合成基因Life Technologies根据需要进行设计和优化
厚型印迹滤纸Bio-Rad1703932
Tris 碱BioShopTRS001.1
Tween-20Sigma-AlrichP9416-50ML
XL1-Blue 化学感受态细胞实验室自制感受态细胞
名称公司目录编号备注
设备
BioSpectrometerEppendorfRK-83600-07
凝胶电泳槽 - PAGEBio-Rad1658005Mini-PROTEIN Tetra 垂直电泳槽
凝胶成像系统Alpha InnotechAlphaImager EC
恒温培养箱（烘箱）Fisher Thermo Scientific11-690-650DIsotemp
摇床培养箱Fisher Thermo ScientificSHKE6000-7MaxQ 6000
Personna 剃刀Fisher Thermo ScientificS04615
电源模块Bio-RadS65533QFB300
透射紫外灯VWR InternationalM-10E,6W
热循环仪EppendorfZ316091Mastercycler Personal，由 Sigma 提供
紫外面罩18-999-4542
水浴锅Fisher Thermo Scientific15-460-2SQ
Western 转膜装置Bio-Rad1703935Mini-Trans Blot 转膜槽

参考文献

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