这个实验方法的完整的文本<a href="http://www.springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1385/1-59259-241-4:229">协议，</a>在斯普林格协议。

作者没有什么可透露的。

使用荧光抗体对小鼠表皮石蜡切片的免疫组织化学

在表皮层，免疫组化是一个本地化特定的蛋白质，其相对表达车厢的有效手段;，即基肥，基底层，角质层层。一种特定的蛋白质的表皮内的精确定位适合向表皮内的职能作用的线索。在这一章中，我们描述了我们，在我们的实验室非常常规使用冷冻和石蜡切片修改表皮内的免疫定位可靠的方法。石蜡切片通常能提供更好的形态，因此，优异的业绩和照片;然而，并非所有的抗体将他们在处理涉及与恶劣的固定和治疗工作。因此，冰冻切片的协议也包括在内。在石蜡切片中，有两个固定的协议（Bouin氏和多聚甲醛），固定液的选择将直接关系到抗体规格，可能需要另一个固定方法。

我们描述了我们，在我们的实验室非常常规使用冷冻和石蜡切片修改表皮内的免疫定位可靠的方法。

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

在表皮中。免疫组化是将特定蛋白质定位到其表达区室的有效方法。在本视频中，我们展示了一种在表皮中免疫定位蛋白质的可靠方法，我们在实验室中经常使用该方法。嗨，我是来自都灵博士实验室的 Tammy，位于渥太华健康研究所慢性病项目的低楼。今天，我们将向您展示一种在小鼠表皮的石蜡包埋组织切片上使用荧光抗体进行免疫组织化学的程序。在我们的实验室中，我们优化了使用 BO 的固定组织免疫定位表皮分化标志物的方案。作为优化的一部分，我们在固定之前将皮肤放在纸巾上，以保持皮肤平整。该程序包括解剖表皮、固定、脱水、石蜡包埋和切片、脱蜡、再水化、抗原、暴露抗体标记，最后用落射荧光进行封片和可视化。那么让我们开始吧。使用新生小鼠时，无需剃掉背部皮肤。但是，当您有有毛的老鼠时，您需要剃掉后皮，以免妨碍切割切片。当您进行解剖时，您需要非常小心，不要将镊子放在要用于检测的皮肤区域。所以我们所做的是，我们只需将镊子放在我们要切割的地方的边缘，然后你非常小心地提起，切开表皮，记住不要触摸你想用于实验的区域。当我们修复皮肤时，我们不希望皮肤卷起并进入管中。我们希望它漂亮而平坦。因此，为了帮助实现这一目标，我们将皮肤放在纸巾上，使其在固定时保持平整。所以现在我们在纸巾上已经把皮肤漂亮平整了，我们要做的是剪掉边缘或修剪它们，以去除我们可能被镊子损坏的部分。然后你把皮肤切成非常小的块，大约 2 毫米 x 2 毫米。现在组织要被固定了。将皮肤切成易于处理的小块后，将其浸入 boin 溶液中。盖上试管，用 perfil 包裹试管，然后将它们放在摇杆上。对于过夜孵育，重要的是在 boin 溶液中仅孵育 16 至 18 小时。较短或较长的固定期会损害您的组织。孵化结束了。您用 PBS 冲洗组织，然后使用 30%、50% 和 70% 酒精进行一系列乙醇洗涤。您可以看到 BO 是黄色的，当您进行洗涤时，随着 boons 被稀释，洗涤的颜色变得越来越淡。每次 30 分钟，洗涤 2 次。在乙醇中最后一次洗涤后，将样品置于新鲜的 70% 乙醇中，并可储存在 4 摄氏度下，直到进一步处理几次石蜡。嵌入。过度使用冷冻组织可以使组织完整性优越，并且样品可以长期储存。通常，核心设施产生的结果更具可重复性。但是，如果您拥有设施和具有专业知识的专职作员，则可以在内部切割截面。学习剪出好的部分更像是一种艺术形式。因此，我们使用核心设施。从核心设施收到载玻片后，您可以看到载玻片上存在石蜡。作为薄膜，将载玻片放在用铝箔包裹的架子上，就像烤土豆一样，并在 55 度下孵育 5 分钟。孵育结束后，快速解开载玻片，将载玻片放入甲苯中洗涤 3 次，每次 5 分钟。请务必记住，这些 5 分钟的垫圈应适时，孵育时间过长，甲苯对您的样品不利。三次洗涤和甲苯后，用 100% 乙醇快速冲洗。由于乙醇和甲苯会形成沉淀物，会干扰您的实验，因此这是一个需要记住的非常重要的步骤。接下来，通过孵育玻片对样品进行再水化，在 95% 乙醇中 5 分钟，在 70% 乙醇中 5 分钟，然后在水中 2 次 5 分钟。此时，可以处理组织以使用 h 和 e 染色。为此，我们还使用核心设施。用于抗原分离，将可怜的 500 密耳一次性柠檬酸盐缓冲液放入 1 升塑料烧杯中，然后浸入载玻片中。记得取下金属手柄并将烧杯放入微波炉中。用高功率微波 2 次 5 分钟。记得在两次孵化之间打开门以冷却微波炉。微波加热完成后，从沸腾的柠檬酸盐缓冲液中取出载玻片，并将其放入装有温水的染色皿中。我们只使用温自来水，这样做的目的是将您的玻片从沸腾缓慢冷却到室温。现在，您可以在 PBS 中洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟，我们已准备好开始免疫组化。开始免疫染色时，我们需要做的第一件事是用一张薄纸擦干标本周围的区域。为了防止抗体交叉污染，我们用液体封闭剂划定样本周围的区域。通过将滤纸放入培养皿中来准备加湿室。用水浸泡，去除多余的水并插入载玻片。我们使用加湿室的原因是为了确保在孵育期间我们的载玻片不会干涸。幻灯片不要干燥非常重要，因为绘图会增加您的背景。此时用孵育缓冲液封闭玻片 30 分钟。封闭后，将玻片移回玻片架上，并在洗涤缓冲液中孵育。像以前一样去除多余的缓冲液。将玻片放回加湿室中，与一抗孵育 1 小时。在室温下。孵育 1 小时后，将玻片放回玻片架中，用洗涤缓冲液洗涤 3 次，每次 10 分钟。洗涤后，用纸巾去除标本周围多余的洗涤缓冲液。将玻片放回加湿室中，在室温下与二抗孵育 1 小时，与二抗孵育后，更换洗涤缓冲液 3 次，每次 15 分钟。接下来，我们分 3 次 5 分钟洗涤。在 PBS 中，去除样品周围的多余液体，并将 PBS 从载玻片背面擦去，以将盖玻片安装到载玻片上。我们使用含有 2.5%DAB 的手机。为了减少褪色，向载玻片中加入 80 微升滴加。小心不要引入任何气泡。然后在盖玻片上非常缓慢地降低。注意不要留下任何气泡。气泡很糟糕，因为它们经常直接落在你的标本上，就在手机干燥后你想拍照的地方。现在你准备好去看看你的幻灯片了。以下是使用 FITC 过滤器的成功染色。在 20 倍物镜中，我们看到 Clain 6 与表皮的所有超级基底层相关。我们实验室对 claudins 在表皮中的表达和定位非常感兴趣。关于紧密连接和表皮通透性屏障的形成，我们刚刚向您展示了如何在小鼠皮肤上进行免疫组化。执行此程序时，请务必记住，您希望组织切片是平坦的，并且要确保载玻片在两次孵育之间不会变干。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

Ottawa Health Research Institute.  我们描述了我们，在我们的实验室非常常规使用冷冻和石蜡切片修改表皮内的免疫定位可靠的方法。

使用荧光抗体对小鼠表皮石蜡切片的免疫组织化学

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