本研究介绍了一种利用海洋细菌Vibrio anguillarum评估污染物生态毒性的新方案，适用于包括纳米材料等新兴污染物在内的多种物质。该方法可在6小时暴露后测定LC50值，即导致细菌可培养性下降50%的浓度，亦称半致死浓度。
本文内容
摘要
摘要
细菌是生态系统的重要组成部分，微生物群落结构的变化可能对生物地球化学循环和食物网产生显著影响。基于微生物的毒性测试被广泛应用，因为这类方法相对快速、可重复、成本低廉，且不涉及伦理问题。本文介绍一种生态毒理学方法，用于评估海洋细菌Vibrio anguillarum的生物学响应。该方法可用于评估化学物质的急性毒性，包括纳米颗粒等新型污染物以及环境样品。其检测终点是由于暴露于有毒物质而导致的细菌可培养性降低（即 细菌复制并形成菌落的能力下降），这种降低通常可称为“死亡率”。该测试可在6小时暴露后测定LC50，即导致活跃复制并形成菌落的细菌数量减少50%的浓度。通过菌落形成单位（CFU）计数可培养细菌，并将"死亡率"与对照组进行比较评估。本研究中评估了硫酸铜（CuSO4）的毒性，在三次独立实验中均观察到明显的剂量-效应关系，平均LC50为1.13 mg/L。与现有的微生物检测方法相比，该方法适用于更宽范围的盐度条件，且对有色或浑浊样品无检测限制。本方法采用盐溶液作为暴露介质，避免了培养基可能对目标污染物产生的干扰。LC50的计算有助于与常用于海洋环境生态毒理评估的其他生物测定方法进行比较。
引言
生态毒理学生物测定利用标准生物模型评估化学品或环境样品的毒性，综合反映物理、化学和生物胁迫因子对生态系统的影响。由于生态系统的复杂性，生态毒理学风险评估必须结合一系列涉及不同营养级生物的生物测定方法。实验室动物毒性试验可能成本高昂、耗时较长，并存在伦理争议。减少动物实验并开发替代方法的迫切需求（例如， 关于细菌和无脊椎动物的研究现已成为一个关键议题，这一点已在当前的欧洲立法框架中得到报告，包括欧盟动物保护指令、欧盟化妆品指令第七次修正案以及REACH法规。
甲壳类、鱼类和藻类被广泛用于海洋环境中的毒性测定1。细菌是生态系统的重要组成部分，微生物群落的改变可能对生物地球化学循环及其他关键生态系统功能产生显著影响。基于微生物的毒性测试正日益受到关注，因其具有相对快速、可重复、成本低且不涉及伦理问题等优点2。本研究的目的是描述一种生态毒理学实验方案，用于评估海洋细菌 Vibrio anguillarum （Listonella anguillarum，弧菌科）在暴露于环境污染物时的响应情况。
V. anguillarum 是一种革兰氏阴性、短杆状、微弯曲的细菌（0.5 × 1.5 µm），具有一根极生鞭毛。该菌通常存在于半咸水或海水中，具有嗜盐性，最适盐度约为20，最适生长温度为25至30 °C3。由于其广泛分布以及在全球海洋生态系统中的重要生态作用，被选为模式生物4。V. anguillarum 的某些血清型已知可引起多种海洋或半咸水鱼类的弧菌病5,6。因此，本实验的部分操作需遵循标准的微生物学操作规范，但无需特殊的安全设备或额外防护措施。本研究所提出的毒性测试方案以细菌的可培养性（即 复制并形成菌落的能力）作为检测终点，通过6小时暴露后测定LC50值，即导致50%细菌失去复制和形成菌落能力的浓度。在Vibrio属及其他微生物中，这种能力的降低（通常被我们称为死亡率）可能部分源于处于“可存活但不可培养”（VBNC）状态的个体7。在本研究中，我们应用该方法评估了硫酸铜（CuSO4）这一标准毒性物质的毒性效应。
本方法旨在为污染物/化学物质（包括纳米材料等新兴污染物）的生态毒性评估提供一种合适的、基于微生物的检测手段。与现有微生物检测方法相比，本方案的创新性主要体现在暴露介质和检测终点两个方面。首先，暴露过程在盐溶液中进行，避免了培养基可能对目标污染物产生的干扰，从而防止其影响生物体的响应8。其次，检测终点为细菌可培养性的降低，该指标可与海洋/半咸水环境中基于存活率/死亡率的其他急性毒性检测终点直接比较。此外，本方案采用了液体到平板的微量计数技术，该技术此前已在E. coli9中应用，能够减少试剂用量，从而降低实验工作量（详见方案中的步骤3.3和3.4）。
方案
1. 试剂/材料的准备
- 准备约 300 个无菌的 1.5 mL 离心管，用于细菌悬液的系列稀释，同时准备带标签的无菌 15 mL 离心管作为测试容器，标签上注明测试浓度。
- 配制 2% NaCl 溶液作为暴露介质，并进行灭菌。也可使用灭菌的人工或天然海水，盐度范围为 5 至 40。
- 根据产品说明书配制含 2% NaCl 的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基，注意计算培养基本身已含的 NaCl 量。
- 将冷却但仍呈液态的 TSA 倒入已标记测试浓度、暴露时间、重复编号和稀释倍数的 90 mm 培养皿中；每皿 19 mL 为适宜体积。
- 根据产品说明书配制胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基，并加入适量 NaCl，使其盐度与暴露介质一致。
- 使用双蒸水配制 CuSO4 储备液，并用 0.22 µm 注射器滤器对所需分装量进行灭菌。若为环境样品，则需制备适当浓度梯度的样品稀释液，并用 0.22 µm 注射器滤器灭菌。
- 在已标记测试浓度的 15 mL 离心管中配制测试溶液。阴性对照管中加入 5 mL 暴露介质（2% NaCl），其余各管加入适量暴露介质和 CuSO4 储备液，使最终体积为 5 mL 并达到目标测试浓度。
2. 细菌接种物的制备
- 测试前12-18小时，制备一管新鲜的液体培养物 Vibrio anguillarum使用无菌接种环从固体培养基（TSA）上的过夜培养物中挑取一个分离良好的单菌落，接种至含有 10 mL TSB 的试管中，并将细菌培养物在 25 °C，培养12-18小时。
- 12–18 小时后，通过分光光度法估测接种液的细菌浓度。涡旋振荡接种液，并测定其在 600 nm 波长，以 TSB 作为空白对照。
- 为获得已知的细菌浓度，根据以下公式计算所需TSB的体积，将其加入2 mL涡旋混匀的接种液中进行稀释：
TSB mL = [(O.D. / 0.14) × 2] - 2 - 验证稀释接种物的光密度为 0.140（±0.005），相当于麦氏比浊标准的0.5点。
- 将稀释的接种液在3,000 × g下离心10分钟 g. 去除上清液，并将微生物沉淀重悬于1 mL的2% NaCl溶液（暴露介质）中。
3. 暴露测试
- 向每个试管（包括对照组）中加入 150 µL 重悬的细菌接种液。将 V. anguillarum 菌悬液在 25 °C 下避光并持续振荡培养 6 小时，以避免沉淀。
- 在暴露开始时（T0）和结束时（T6），采用菌落形成单位（CFU）计数法，对所有暴露组的细菌悬浮液进行细菌计数。
- 对每种暴露后的细菌悬浮液进行连续三重十倍梯度稀释（稀释至 10-5）。向已装有 900 µL 暴露介质（2% NaCl）的对应试管中加入 100 µL 细菌悬浮液 。逐级进行系列稀释，每步均涡旋振荡以重新悬浮细菌。
- 取 10-4 和 10-5 稀释度的菌液各 10 µL，分别接种于 TSA 培养皿的相应区域。通过旋转培养皿使液滴快速呈小圆圈滑动。将培养皿在 25 °C 下培养 48 小时。
4. 菌落形成单位计数
- 48小时后，计数培养皿上生长的菌落；含有5至50个菌落的平板最适合进行准确计数。
- 通过应用以下公式，计算每毫升各暴露细菌悬液中的活菌数量：
10-4 → CFU/mL = n° CFU × 100 × 10,000
10-5 → CFU/mL = n° CFU × 100 × 100,000 - 使用平行重复实验中获得的计数值的平均值，与对照组相比评估死亡率。按以下公式计算死亡率的百分比：
M% = 100 - [(N/C) × 100]
注：其中 N = 暴露于毒物后每毫升培养出的菌落形成单位（CFU）数量；C = 对照培养基中培养出的菌落形成单位（CFU）数量。 - 计算 LC50 (即， 毒物浓度导致每毫升中活跃复制的细菌数量减少50%（CFU/mL），通过使用适当的统计软件（见材料表）进行非线性回归分析。随后进行单因素方差分析（ANOVA），并进行事后成对比较 t-用于评估不同处理间显著性差异的检验。
结果
三项独立暴露实验的结果 V. anguillarum 至四种浓度的 CuSO₄4 显示出明显的剂量-反应关系，且随着参考毒物浓度的增加， actively replicating 并形成菌落的细菌数量显著减少图1；方差分析，F = 20.28，p <0.001）。在1.25 mg/L浓度下，CFU/mL数量显著减少（事后Tukey检验，p <0.05）相比对照组（CNTR）。在最高测试浓度下未检测到任何可培养的细菌。CuSO₄处理组之间无显著差异。4 在暴露介质的广泛盐度范围内均观察到毒性即， 5、20 或 35 g/L NaCl，数据未显示）。统计分析的一个代表性结果展示了非线性回归，如图所示。 补充图1. LC50 三次独立实验计算所得的数值（表1) 强调了该方法的可行性和可重复性。
图 1：Vibrio anguillarum 暴露于 CuSO4 中的结果。 在不同浓度的 CuSO4 中处理 6 小时后，每毫升菌落形成单位（CFU）的平均数量（CFU = 菌落形成单位）。数据表示三次独立实验的平均值（±标准差，SD）。相对于对照组（CNTR），具有活性复制并形成菌落的细菌减少量以黄色框标出（以百分比表示）。基于事后 Tukey 检验，与对照组相比具有显著差异的结果用星号表示（* = p <0.05；** = p <0.01）。请点击此处查看该图的放大版本。
表1：铜绿假单胞菌（Vibrio anguillarum）在暴露于 CuSO4 后的半数致死浓度（LC50）值。报告了三次独立试验的结果及平均值（± SD）。
补充图1：非线性回归分析。 对实验结果进行非线性回归分析（Logit-Hill 模型）的代表性输出结果。请点击此处下载该图。
讨论
本研究描述了一种利用海洋细菌V. anguillarum建立的新型生物测定方法，已成功用于评估参考毒物CuSO4的毒性效应，结果显示出明确的剂量-反应关系。选择海洋细菌V. anguillarum作为模式生物，是因为该菌具有嗜盐性、广泛分布，并且具有海洋生态系统的代表性。
该测试可在较宽范围的盐度值（5-40）下进行，并可使用盐溶液或人工及天然海水作为暴露介质，只要微生物在整个测试期间能够正常存活即可。这使得该方法可用于分析多种类型的样品，包括半咸水和海洋环境。
在暴露阶段无需使用培养基，以避免培养基对污染物8的干扰及其对生物反应可能产生的影响。该方案可靠、快速、成本低且相对简便。采用液体到平板的微量计数方法9具有可使用小体积（样品）的优势，但这也要求操作具备高度的准确性和稳定性。三次独立实验及其重复样本的结果表明，该方法具有很高的可重复性。利用细菌作为生物模型，以及该技术的可适应性，增强了本方法在生态学和环境科学中的相关性。其他关键技术要点包括细菌接种液制备的准确性，以及实验过程中某些步骤所需的无菌条件。
与现有的海洋生态毒理学检测方法（24–96 小时）相比，本研究所提出的检测方法更为快速（6 小时），且不会引发使用高等生物所带来的伦理问题。此外，参照毒物的实验数据显示，其LC50值与其他海洋物种急性毒性试验所得结果相当10,11，表明该方法具有良好的敏感性。在细菌生物检测法中，V. fischeri发光抑制试验是最常见且标准化程度最高的方法之一12。该生物检测法非常快速（15–30 分钟），适用于固相样品的检测，但可能受到有色或浑浊样品的干扰，影响发光强度的测定。盐度是上述检测方法应用中的一个限制因素，需维持在2% NaCl水平13。相比之下，本研究采用V. anguillarum的检测方法在较宽范围的盐度条件下均可获得可靠结果，对浑浊或有色样品无检测限制，且所需设备成本低于发光检测仪。将本研究结果与文献中报道的V. fisheri14,15,16检测结果进行比较，发现其EC50值具有可比性，进一步证明了该生物检测方法的有效性。
该生物测定方法评估细菌可培养性的降低，通常称为死亡率，而非目前微生物检测中常用的种群增长率或酶活性抑制。LC50 的计算使得该方法能够与常用于海洋环境生态毒理学评估的其他生物测定方法进行比较，这些方法通常以存活率/死亡率作为终点指标。迫切需要开展实验室间校准实验，以评估/验证本检测方法的可靠性与可重复性，并推动其在法规性检测方案中的标准化与应用。
纳米材料的日益使用及其在环境中的潜在释放，意味着需要进行风险评估17。然而，针对这些新兴污染物的传统（生态）毒理学方法似乎难以获得可靠的结果，可能需要进行一些调整18。本新生物测定法的特性使其能够简便且有效地应用于纳米颗粒的毒性评估。事实上，该方法可在不同盐度条件下进行，从而反映纳米颗粒在不同离子强度下的行为，而离子强度作为一项可变的环境参数，可能显著影响其毒性19。此外，在纳米颗粒的生态毒理学评估中，特别建议不使用培养基和营养物质，因为有机物质可能通过增强毒性效应而促进纳米颗粒的吸收20，或导致其发生聚集，从而减少生物可利用部分，进而降低其毒性21。
综上所述，对Vibrio anguillarum的生物测定法是一种有前景的工具，可用于评估传统和新兴污染物的风险，以及评估海洋和半咸水环境的状况。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由研究项目“纳米生物技术与环境和健康。项目2：环境。用于纳米颗粒生态毒理学监测的工具与方法”资助。纳米生物技术：环境与健康。项目2：环境。纳米颗粒生态毒理学监测的工具与方法由拉齐奥大区—伊帕蒂亚联合体（Regione Lazio-Consorzio Hypatia）向LM提供的资助。AR获得了罗马托尔维加塔大学/拉齐奥大区—伊帕蒂亚联合体在前述项目框架下资助的博士后基金。根据ISPRA与托尔维加塔大学之间的协议（编号：2015/52857），双方可共享设施并开展研究人员交流。
作者们衷心感谢 Maria Cristina Thaller 教授，她是我们开展所有微生物相关工作的守护天使，感谢她激发了我们对微生物世界的兴趣，并大力帮助我们改进了本课题的研究工作。作者们诚挚感谢 Andrea Tornambè 和 Erika Magaletti，感谢他们与意大利水环境研究所（ISPRA）浮游植物生态学与生态毒理学实验室开展的宝贵合作。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Vibrio anguillarum（菌株 AL 102，血清型 O1） | 来自挪威 NOIFMA 实验室菌种保藏 | ||
| 胰蛋白胨大豆琼脂 | Liofilchem | 610052 | 脱水培养基 |
| 胰蛋白胨大豆肉汤培养基 | Liofilchem | 610053 | 脱水培养基 |
| CuSO4·5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| 仪器名称 | 公司 | 目录编号 | 备注/说明 |
| 生物安全水平层流罩 | ESCO | ||
| 培养箱 | Fratelli Galli | Mod. 2100 | |
| 软件名称 | 公司 | 目录编号 | 备注/说明 |
| 基准剂量软件 | 美国环保署（US EPA） | Benchmark Dose 2.4.0 | 2012 |
参考文献
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