马卵母细胞中染色体分离、组蛋白乙酰化及纺锤体形态的分析

摘要

本文描述了一种从形态学和生物化学角度对马卵母细胞进行表征的实验方法。具体而言，本研究展示了如何通过超声引导下的卵母细胞采集术（OPU）获取未成熟和成熟的马卵母细胞，并阐述了如何研究染色体分离、纺锤体形态、组蛋白整体乙酰化水平以及mRNA表达。

摘要

辅助生殖技术领域的发展旨在治疗女性、伴侣动物以及濒危物种的不孕症。在马匹中，辅助生殖技术还能够从表现优异的个体获取胚胎，而不会中断其运动生涯，同时有助于增加具有高遗传价值母马的产驹数量。本文描述了利用卵母细胞采集术（ovum pick-up, OPU）从马卵巢中采集未成熟和成熟卵母细胞的操作流程。随后，通过借鉴先前在小鼠中建立的实验方案，对这些卵母细胞进行非整倍体发生率的研究。具体而言，在共聚焦激光显微镜扫描后，对中期Ⅱ（metaphase II, MII）卵母细胞的染色体和着丝粒在连续焦平面图像中进行荧光标记并计数。该分析显示，当从未成熟卵泡中采集卵母细胞并进行体外成熟时，其非整倍体发生率更高。 关键词：辅助生殖技术，卵母细胞采集术，OPU，马，卵母细胞，非整倍体，中期Ⅱ，染色体，着丝粒，共聚焦显微镜 体外 与……相比 体内免疫染色检测微管蛋白以及组蛋白H4在特定赖氨酸残基上的乙酰化形式，也揭示了减数分裂纺锤体形态及组蛋白乙酰化整体模式的差异。最后，通过逆转录和定量PCR（q-PCR）分析编码组蛋白去乙酰化酶（HDACs）和乙酰转移酶（HATs）的mRNA表达水平。在转录本的相对表达水平上未观察到显著差异 体外 和 体内 成熟卵母细胞。与卵母细胞成熟过程中转录活性普遍受到抑制的现象一致，对总转录本含量的分析仅能反映mRNA的稳定性或降解情况。因此，这些发现表明其他翻译及翻译后调控机制可能受到影响。

总体而言，本研究描述了一种对马卵母细胞进行形态学和生物化学表征的实验方法。由于样本获取困难，这类细胞极难研究。然而，该研究有助于增进我们对单排卵物种生殖生物学及不育症的认识。

引言

已开发出多种辅助生殖技术，用于治疗女性、伴侣动物及濒危物种的不孕症。在临床实践中最常见的操作之一是通过超声引导经阴道穿刺抽吸，从卵巢卵泡中采集处于第二次减数分裂中期（MII期）的卵母细胞，即卵母细胞采集术（OPU）。¹这些卵母细胞随后被受精 体外 （体外受精），随后将获得的胚胎植入受体子宫。在给予外源性促性腺激素后，采集处于MII期（成熟期）的卵母细胞。然而，该治疗在部分患者中可能引发卵巢过度刺激综合征（OHSS）。².

利用完全成熟但未成熟的卵母细胞（GV期）从卵泡中分离后能够自发恢复减数分裂的内在能力，可在不施用促性腺激素的情况下获得成熟卵母细胞³该过程称为卵母细胞 体外 成熟（IVM），代表了一种药物使用更少、成本更低且对患者更友好的辅助生殖技术方法。然而，胚胎发育的成功率在 体外-成熟卵母细胞的发育率通常低于 在体 成熟卵母细胞^4,5一种可能的解释是 体外 成熟卵母细胞更容易受到染色体分离错误的影响，由此产生的非整倍体会损害正常的胚胎发育⁶.

阐明体外成熟（IVM）过程中染色体错误分离的分子基础，将最终揭示该技术的全部潜力。在此背景下，用于研究形态学与生物化学特征的实验方法 体外-成熟卵母细胞，相较于 体内 成熟卵母细胞的制备方法在此描述^7,8具体以成年自然发情周期母马为实验模型，阐述了未成熟及成熟卵母细胞的经阴道未成熟卵母细胞采集（OPU）操作流程，以及未成熟卵母细胞的体外成熟（IVM）过程。随后，采用免疫荧光染色与图像分析技术，对这些配子的染色体分离、纺锤体形态以及组蛋白乙酰化的全貌模式进行研究。最后，介绍了用于分析mRNA表达的逆转录与定量PCR技术方案。

与啮齿类动物模型相比，马无法进行基因操作，操作难度较大，且需要昂贵的维持成本。然而，由于马的卵巢生理与人类相似^9,10，该模型在卵母细胞成熟研究中正受到越来越多的关注^11,12。此外，建立可靠的马体外成熟-体外受精（IVM-IVF）技术方案具有重要的经济价值，因其可增加高遗传价值母马的产驹数量。

在卵母细胞上进行实验的一个局限性，尤其是在单排卵物种中，是样本获取受限。本研究通过调整先前在小鼠中建立的方法，并将其应用于马卵母细胞^13,14，从而克服了这一限制，实现了染色体计数并最大限度地减少了样本损耗（参见讨论部分，与其他现有技术的比较）。此外，已优化了一种三重荧光染色方案，可在同一样本上进行多项分析，且q-PCR分析仅需2个卵母细胞组成的样本池即可完成。

总体而言，本研究描述了一种实验方法，旨在从形态学和生物化学角度对马卵母细胞进行表征。由于样本获取极为困难，这类细胞的研究极具挑战性。然而，该研究有助于拓展我们对单排卵物种生殖生物学及不育机制的认识。

方案

所有实验程序均经卢瓦尔河谷动物护理与使用委员会（CEEA Val de Loire）第19号批准，并遵循《实验动物护理与使用指导原则》进行。

1. 卵母细胞采集与 体外 成熟

1. 卵母细胞采集
   1. 每日通过超声检查一群成年母马卵巢卵泡的直径。当出现直径≥33 mm的卵泡（优势卵泡）时，通过颈静脉上部静脉注射1,500 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG）。
      1. 注射前，用酒精擦拭注射部位，定位颈静脉沟，并用拇指在注射点下方2–3 cm处轻压，使静脉隆起。将针头几乎与颈部平行刺入，回抽确认针头位于静脉内（血液会进入注射器）。此时进行注射；hCG将诱导优势卵泡内卵母细胞的成熟。
   2. 注射hCG后35小时，使用地托咪定（15 µg/kg，静脉注射）、酒石酸布托啡诺（10 µg/kg，静脉注射）和丁溴东莨菪碱（0.2–0.3 mg/kg，每匹马15 mL，静脉注射）对母马进行镇静。
   3. 将穿刺针连接至超声探头。将超声探头经阴道插入，并通过直肠固定卵巢，使其朝向超声探头。安排一名操作者操控穿刺针，另一名操作者固定卵巢位置，使卵泡朝向超声探头。操作从含有优势卵泡的卵巢开始。
   4. 用穿刺针穿破阴道壁和优势卵泡壁（用于OPU的超声探头配备有连接至负压吸引系统的穿刺针通道）；穿刺针在超声图像中可见。
   5. 将卵泡液抽吸至连接负压系统的50 mL锥形管中。将锥形管内容物倒入大培养皿中，使用体视显微镜寻找卵丘-卵母细胞复合体（COC）。
   6. 由于COC并非总能随卵泡液被回收，需使用含5 IU/mL肝素、37 °C预热的Dulbecco改良磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗卵泡。参照步骤1.1.5中对卵泡液的检查方法，检查DPBS中是否存在COC。重复冲洗数次，直至回收到COC。
   7. 回收优势卵泡的COC后，按照步骤1.1.3–1.1.4所述方法，穿刺并冲洗直径≥5 mm且≤25 mm的卵泡；这些卵泡不表达黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体（LHCGR），因此其卵母细胞不会对hCG产生成熟反应，将处于生发泡期（GV期，未成熟阶段）。仅保留具有多层完整卵丘细胞、细胞质呈棕色且细颗粒状的COC，其余弃去。
   8. OPU操作结束后，为每匹母马注射苄青霉素15,000 IU/只，以预防感染。
   9. 将母马安置于安静、清洁的马厩中至少2小时。通过观察耳部位置、对刺激（例如噪音）的反应以及步态，评估其意识状态，确认清醒后再将其与其他动物合群。
2. 体外成熟
   1. 将添加了1,790 IU/L肝素、0.4%牛血清白蛋白（BSA）、青霉素和链霉素的HEPES缓冲TCM199培养基（20 mM Hepes）预热至37 °C。该培养基需提前配制，经滤膜除菌后于4 °C保存，最长可保存6个月。
   2. 通过向NaHCO₃缓冲TCM199培养基（25 mM NaHCO₃）中添加50 ng/mL表皮生长因子（EGF）和20%胎牛血清⁷，配制IVM培养基。新开瓶的NaHCO₃缓冲TCM199培养基需在3周内使用完毕。EGF需提前配制成100倍浓缩液，于-20 °C冷冻保存，并在6个月内使用。将500 µL培养基分装至4孔板的各孔中，在38.5 °C、5% CO₂的湿润空气中孵育至少2小时。
   3. 从直径≥5 mm且≤25 mm的卵泡中回收COC后，将其置于盛有2 mL HEPES-TCM199培养基的培养皿（直径3.5 cm）中。将COC转移至培养皿不同区域，以洗去细胞碎片。
   4. 将COC转移至IVM培养基中，在38.5 °C、5% CO₂的湿润空气中孵育28小时。

2. 免疫荧光与图像分析

1. 染色体计数
   1. 从优势卵泡采集后或体外成熟（IVM）结束时，将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）在含5% CO₂的湿润空气中、38.5 °C条件下，用100 µM monastrol孵育1小时。提前配制100倍浓缩的monastrol储存液，于-20 °C保存，最长可保存1年。
   2. 使用0.5%透明质酸酶处理或轻柔吹打去除卵丘细胞；用0.2%蛋白酶处理去除透明带。提前配制10倍浓缩的透明质酸酶和蛋白酶储存液，于-20 °C保存，最长可保存1年。
   3. 将卵母细胞在含4%多聚甲醛的DPBS中于38.5 °C固定15分钟，随后在4 °C继续固定45分钟。
      警告！操作多聚甲醛时需佩戴个人防护装备，并按照危险废物处理指南处置污染材料。
   4. 将卵母细胞依次转移至3个含有500 µL添加0.1%聚乙烯醇（PVA）的DPBS孔中进行洗涤。在室温（RT）下用0.3% Triton X-100透化10分钟。
   5. 在添加1%牛血清白蛋白（DPBS-1%BSA）和10%正常驴血清的DPBS中孵育至少30分钟（室温），以阻断非特异性结合。样品可在阻断液中于4 °C保存3-4天。
   6. 进行一抗染色时，将卵母细胞在添加1% BSA的DPBS中与兔抗Aurora B磷酸化-Thr232抗体（稀释比例1:50）于4 °C孵育过夜。
   7. 按照步骤2.1.4所述方法洗涤卵母细胞。在避光条件下，将卵母细胞于添加1% BSA的DPBS中与TRITC标记的驴抗兔IgG抗体（1:100）溶液在室温下孵育1小时。
   8. 按照步骤2.1.4所述方法洗涤卵母细胞，然后将3-4个卵母细胞置于载玻片上的非硬化性抗荧光淬灭封片剂液滴中，该液滴中添加20 µM YOPRO1。重复此操作直至所有卵母细胞均被封片（每张载玻片3-4个卵母细胞）。
   9. 让卵母细胞在封片剂中沉降约10分钟，然后加盖盖玻片。为避免压碎卵母细胞，在盖玻片下方放置两条双面胶带后再覆盖于载玻片上。
      注：此措施还可确保所有样品在载玻片与盖玻片之间受到均匀压缩。载玻片可于-20 °C冷冻保存，并在随后2-3天内进行成像。
   10. 使用共聚焦激光扫描显微镜，配备60倍物镜，通过红色（着丝粒）和绿色（染色体）通道对样品进行成像^{7,13,14,20,21}。沿z轴扫描整个中期板区域，步长为0.35 µm。保存每一层平面的数字化图像。
   11. 使用NIH ImageJ软件的细胞计数功能（可访问：https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html）在连续的共聚焦切片中对着丝粒进行计数。
       注：通过为在相邻切片中出现、持续存在并消失的着丝粒分配数字编码，避免重复计数。
   12. 由另一位独立操作者重复步骤2.1.11中的染色体计数。
       注：将卵母细胞分类为整倍体（32条染色体）、超倍体（>32）或亚倍体（<32）。
2. 纺锤体形态与组蛋白乙酰化
   1. 从优势卵泡采集后或体外成熟（IVM）结束时，按照步骤2.1.2所述方法，使用0.5%透明质酸酶处理或轻柔吹打去除卵丘细胞。
   2. 按照步骤2.1.4所述方法在DPBS-PVA中洗涤卵母细胞，并在2.5%多聚甲醛中于38 °C固定20分钟。充分洗涤后，按照步骤2.1.4所述方法在室温下用0.1% Triton X-100透化5分钟。
      注：操作多聚甲醛时需佩戴个人防护装备，并按照危险废物处理指南处置污染材料。
   3. 在添加2%牛血清白蛋白（DPBS-2%BSA）、0.05%皂苷和10%正常驴血清的DPBS中于室温孵育2小时，以阻断非特异性结合。
      注：样品可在阻断液中于4 °C保存3-4天。
   4. 进行一抗染色时，将卵母细胞在含2% BSA和0.05%皂苷的DPBS中与小鼠抗α-微管蛋白抗体（1:150）和兔抗acH4K16抗体（1:250）于4 °C孵育过夜。
   5. 按照步骤2.1.4所述方法洗涤卵母细胞。在避光条件下，将卵母细胞在含2% BSA和0.05%皂苷的DPBS中与绿色荧光染料标记的驴抗小鼠IgG抗体（1:500）和TRITC标记的驴抗兔IgG抗体（1:100）溶液于室温孵育1小时。
   6. 按照步骤2.1.4所述方法洗涤卵母细胞，然后将3-4个卵母细胞置于载玻片上的非硬化性抗荧光淬灭封片剂液滴中，该液滴中添加1 µg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）。
   7. 按照步骤2.1.8所述方法将卵母细胞封片于载玻片上。
   8. 使用共聚焦激光扫描显微镜，配备60倍物镜，通过红色（acH4K16）、绿色（α-微管蛋白）和蓝色（DNA）通道对样品进行成像。
      注：在整个样品采集过程中，保持红色和蓝色通道的激光设置恒定。沿z轴扫描整个减数分裂纺锤体和中期板区域，步长为0.35 µm。保存数字化图像（单层平面图像及投影的三维图像）。
   9. 使用NIH ImageJ软件的测量功能（https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html），在投影图像上测量纺锤体两极之间的长度以及最大宽度处的纺锤体直径。每项测量重复3次，取平均值。
   10. 使用NIH ImageJ软件的积分密度功能（https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html）定量acH4K16的相对荧光强度，并以DAPI染色的积分密度值进行归一化处理。

3. mRNA 表达分析

1. 从5至25毫米卵泡中取出COCs后，收集仍留在培养皿中的颗粒细胞悬液，用预冷的DPBS洗涤两次，每次以10,600 × g离心2分钟。在液氮中速冻，随后将样品储存于-80 °C，最长可保存6个月；这些细胞将用于标准曲线的制备。
2. 按照步骤 2.1.2 中所述，小心去除未成熟（GV）卵母细胞中的所有卵丘细胞， 体外 成熟，并 体内 成熟卵母细胞
3. 按照2.1.4中所述，用DPBS-PVA洗涤卵母细胞，将卵母细胞以单个为单位收集于1 µL体积中，加入2 µL RNALater覆盖。在液氮中速冻，将样品于-80 °C保存，最长可保存6个月。
4. 加入2 pg的 荧光素酶 向每个样品中加入RNA作为内参。将卵母细胞以2枚为一组进行汇集，使用基于硅胶膜过滤柱的试剂盒提取总RNA，该试剂盒适用于从小样本中回收RNA。
5. 使用0.25 µg随机六聚体和小鼠莫洛尼白血病病毒逆转录酶，在37 °C下对10 µL RNA进行1小时的逆转录反应。样品可于-20 °C保存长达6个月。
6. 将颗粒细胞的cDNA用无RNase的水稀释至50 ng/µL。将此溶液依次1:10倍比稀释，得到5 ng/µL、0.5 ng/µL、0.05 ng/µL和0.005 ng/µL的溶液。
7. 以每反应20 µL的总体积，设置三个重复反应体系，每个反应使用相当于0.05个卵母细胞的cDNA作为模板，或使用5 µL颗粒细胞cDNA的系列稀释液，加入10 µL SYBR Green Supermix以及每种特异性引物各0.3 µM（表1).
8. 在热循环仪中使用三步法程序进行反应：95 °C 变性 30 s，60 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 20 s，共重复 40 个循环。最后采集熔解曲线，从 60 °C 开始，每 20 s 升温 0.5 °C 至 95 °C。
9. 使用标准曲线评估卵母细胞样品中特定 mRNA 的起始量（SQ）¹⁵ 根据颗粒细胞样本计算数据，以目的基因的SQ值与看家基因的SQ值的比值表示。

结果

这些实验的原始发现此前已有详细描述⁷，本文报告这些结果旨在举例说明使用所述实验方案可获得的典型数据。

成熟率

从优势卵泡经OPU获取的32枚卵丘-卵母细胞复合体（COCs）中，有28枚（88%）处于MII期。从直径5-25 mm卵泡中收集的58枚COCs中，有14枚立即速冻保存，作为未成熟卵母细胞用于mRNA表达研究。其余44枚 体外 成熟，其中37个达到MII期（85%）。两组间的成熟效率差异无统计学意义（Fisher精确检验P） >0.05).

非整倍体率

讨论

尽管马属动物的体外成熟技术（IVM）已开展超过20年¹⁶我们尚不清楚卵母细胞是否可能是胚胎非整倍性的起源，尽管在人类中已有此类假说提出¹⁷。原因可能是制备卵母细胞染色体展片用于计数时会导致大量样本损失。鉴于此，本研究对用于分析染色体分离错误的现有方法进行了综述，以期筛选出最适合应用于马卵母细胞的检测技术。在科学文献中发现了四种主要技术：1）染色体展片^5,18,19，2）荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）^4,6,17,20，3）单星素诱导的纺锤体塌陷后着丝粒计数

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
超声探头	Aloka	UST-5820-7,5
人绒毛膜促性腺激素	centravet	CHO004	每只动物静脉注射 1,500 单位
地托咪定	centravet	MED010	静脉注射 9 - 15 µg/kg
丁溴东莨菪碱	centravet	EST001	静脉注射 0.2 mg/kg
体视显微镜	NIKON	SMZ-2B
丁丙诺啡	centravet	DOL003	静脉注射 10µg/kg
苄青霉素	centravet	DEP203 IM	每只动物 15,000 UI
TCM199	Sigma-Aldrich	M3769 10X1L	用于 HEPES 缓冲 TCM199 的粉末
HEPES 钠盐	Sigma-Aldrich	H3784-100G
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A8806
肝素	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
NaHCO3 缓冲 TCM199	Sigma-Aldrich	M2154-500ML	用于体外成熟（IVM）培养基的液体
表皮生长因子	Sigma-Aldrich	E4127
新生小牛血清	Sigma-Aldrich	N4762-500ML
4 孔培养皿	NUNCLON	144444
培养箱	Heraeus	BB6060
莫那司他醇	Sigma-Aldrich	M8515
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H3506
蛋白酶 K	Sigma-Aldrich	P5147
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
聚乙烯醇	Sigma-Aldrich	341584
曲拉通 X-100	Sigma-Aldrich	T8787
正常驴血清	Sigma-Aldrich	D9663
兔抗 Aurora B 磷酸化-Thr232 抗体	BioLegend	636102
TRITC 标记驴抗兔 IgG 抗体	Vector Laboratories	711-025-152
Vecta-Shield	Vector Laboratories	H-1000
YOPRO1	Thermofisher Scientific	Y3603
共聚焦激光扫描显微镜	LSM 780	Zeiss
共聚焦激光扫描显微镜	LSM 700	Zeiss
ImageJ 软件	rsb.info. nih.gov/ij/download.html	免费资源
鼠抗 α-微管蛋白抗体	Sigma-Aldrich	T8203
兔抗乙酰化组蛋白 H4K16 抗体	Upstate Biotechnology	07-329
AlexaFluor 488 标记驴抗小鼠 IgG 抗体	Life Technologies	A21202
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚	Sigma-Aldrich	D8417	DAPI
离心机	Eppendorf	5417R
RNALater	Invitrogen	AM7020
荧光素酶 RNA	Promega	L4561
PicoPure RNA 提取试剂盒	Applied Biosystems	12204-01
随机六聚体引物	Thermofisher Scientific	N8080127
鼠莫洛尼白血病病毒逆转录酶	Thermofisher Scientific	28025013
SYBR Green 超级混合液	BioRad	1708880
特异性引物	Sigma-Aldrich		使用 Primer3Plus 软件（免费资源）设计特异性引物
PCR 扩增仪	BioRad	MyiQ
鼠单克隆抗 CENPA 抗体	Abcam	ab13939
鼠单克隆抗 Aurora B 抗体	Abcam	ab3609