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方法文章

鉴定蛋白质中的胞间连丝定位序列 活体植株中

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DOI：

10.3791/55301

⸱

2017年8月15日

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York, 2Department of Plant Pathology and Plant-Microbe Biology, Cornell University

本文内容

摘要

植物细胞间的连接结构——胞间连丝（Pd），在植物生理过程及植物与病毒的相互作用中发挥着核心作用。决定蛋白质向胞间连丝运输的关键因素是引导蛋白质定位至胞间连丝的分选信号。然而，目前对这类信号序列的认识仍处于初级阶段。本文介绍一种用于鉴定靶向胞间连丝蛋白中胞间连丝定位信号的策略。

摘要

胞间连丝（Pd）是植物细胞之间相互连接的通道，作为小分子和大分子在细胞间运输的门户。虽然离子和水等小分子在胞间连丝中的运输被认为是被动进行的，但蛋白质等生物大分子的细胞间运输则很可能通过一种主动机制完成，该机制依赖于被运输分子上的特异性靶向信号。目前已被鉴定的胞间连丝定位信号（PLSs）数量极少，严重限制了人们对参与植物细胞间大分子运输与通讯的蛋白质分选途径的理解。在已知能够通过胞间连丝运输的大量植物内源性和病毒蛋白中，迄今仅报道了三种PLSs，且全部来源于植物内源性蛋白。因此，建立一种可靠且系统的实验策略，以直接在活体植物细胞中鉴定出对胞间连丝靶向既必要又充分的功能性PLS序列，具有重要意义。本文以烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的细胞间运动蛋白（MP）为范例，描述了这样一种策略。该实验鉴定了首个植物病毒PLS，并对其进行了表征，此方法可推广应用于大多数靶向胞间连丝蛋白的PLS序列的发现。

引言

胞间连丝（Pd）作为植物发育和形态发生关键调控因子的细胞间运输通道，其运输的分子范围从转录因子到mRNA以及小RNA分子。此外，大多数植物病毒在侵染过程中利用Pd的这种大分子运输能力实现细胞间的扩散；为了通过胞间连丝移动，植物病毒进化出一类特化的蛋白质，称为运动蛋白（MPs），它们能够特异性地靶向Pd1,2,3,4,5,6,7。Pd运输的分子通路很可能与将被运输蛋白导入这些通路的特定序列密切相关。因此，鉴定这些Pd定位信号（PLSs）可能有助于识别相应的Pd运输通路。这一概念类似于Pd运输8，例如不同的核输入通路，其特异性取决于不同的核定位信号（NLS）序列9,10。从概念上讲，NLS和PLS均代表不可切割的亚细胞靶向序列，对实现靶向具有必要性和充分性。然而，与NLS11不同，目前关于PLS的序列信息极为有限。具体而言，仅有四个参与Pd靶向的蛋白质序列被报道，且均来源于内源性植物蛋白。第一个是KN1的同源异型盒结构域12——一种可从植物叶片内部细胞层移动至表皮的转录因子13——及其KNOX同源蛋白14。第二个也来自一种转录因子Dof，其包含一个假定的Pd定位信号，被称为细胞间运输（IT）基序15。第三个序列来源于定位于胞间连丝的PDLP1型I类膜蛋白，由其跨膜结构域代表16。最后，第四个Pd靶向序列最近在糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白中被报道，由糖基磷脂酰肌醇（GPI）修饰信号所代表17。

有趣的是，直到最近，尚未有关于病毒运动蛋白（MPs）的核定位信号（PLS）的报道。先前的研究表明，植物病毒的运动蛋白中可能存在假定的PLS序列。18,19，但无真正的PLS 即，一段对无关的货物分子实现Pd靶向既必要又充分的最短氨基酸序列（例如，CFP）已在一种病毒MP中被鉴定出来。然而，这些蛋白质中的一种，即MP的 烟草花叶病毒 （烟草花叶病毒，TMV）是首个被证实存在钯（Pd）定位与转运的病毒20.

为解决这一空白，我们开发了一种实验策略以鉴定TMV MP的PLS。该策略基于以下三个概念：（i）我们将PLS定义为能够介导蛋白质靶向胞间连丝（Pd）的最小氨基酸序列，且该序列既必要又充分。21(ii) 由于TMV MP首先靶向Pd，然后通过这些通道进行转运22我们旨在分离这两种活性，以鉴定出真正发挥 Pd 定位功能、但不参与后续转运的 PLS。 （iii）我们对所鉴定出的 PLS 进行了分析，以确定对其 Pd 定位活性（无论是结构上还是功能上）至关重要的氨基酸残基。通过该策略，我们界定出 TMV MP 氨基末端一段由 50 个氨基酸残基组成的序列，其作为真正的 PLS 发挥作用。该结论通过构建一系列覆盖 TMV MP 全长的蛋白片段，并在其羧基末端标记 CFP，随后在植物组织中瞬时表达而获得。每个测试片段的 Pd 定位通过与其共表达 Pd 标记蛋白 PDCB1（Pd callose binding protein 1）来确定。23. 能够定位于 Pd 但不能穿过 Pd 的最小片段被认为代表 PLS。最后，对 PLS 进行丙氨酸扫描，以确定其结构和/或功能所必需的关键氨基酸残基。

尽管本文以鉴定烟草花叶病毒（TMV）运动蛋白（MP）的胞间连丝（Pd）定位信号（PLS）为例说明该方法，但它也可用于发现任何其他靶向胞间连丝（Pd）的蛋白质中的PLS，无论这些蛋白质是由植物病原体编码还是由植物自身编码；这是因为本方法并不依赖于病毒运动蛋白（MP）在靶向胞间连丝（Pd）方面所具有的任何独特特性。

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方案

1. 植物材料

  1. 植物物种的选择
  2. 使用与目标蛋白来源相对应的植物物种， 即，一种能够表达该蛋白的内源性蛋白，或作为病原体天然宿主的病毒蛋白。此外，所选植物物种必须适用于所采用的瞬时遗传转化方法。
    注意：这些研究通常采用 Nicotiana benthamiana，该植物是烟草花叶病毒（TMV）的良好寄主，并可通过农杆菌介导的遗传转化技术高效转化， 即，农杆菌浸润（参见步骤3）。 N. benthamiana 植物也易于培养，且具有较大的叶片，可通过农杆菌轻松接种，并易于通过共聚焦显微镜进行分析。
  3. 植物生长
    1. 植物 N. benthamiana 将种子以高密度播种于湿润土壤中。置于20-25 ˚C的可控环境培养箱中，光照强度约为75 µmol photons m⁻² s⁻¹，光照周期为16小时。-2 s-1 以及8小时黑暗。当幼叶直径达到0.5 cm时，小心将幼苗转移至较大的花盆中，并在相同培养箱内的相同条件下继续培养。
    2. 在4周内培养植株，直至其生长至4-8叶期，此时最大叶片直径为4-6 cm；在此阶段可进行农杆菌浸润实验（见步骤3）。
      注意：重要的是，如果植株已经开始开花，则切勿使用，因为在此发育阶段，叶片结构常会发生变化24,25，有时会导致结果不一致。

2. 表达载体构建

  1. 表达系统的选择
    1. 选择表达系统， 即，最适合在所研究的植物物种中表达目标蛋白的载体及载体递送方法。
      注意：偶尔，所测试的蛋白质/植物物种的特定组合可能需要特定的载体和载体递送方法，以实现目标蛋白质的最佳表达和功能。然而，对于大多数双子叶植物，应选择双元质粒作为表达载体，农杆菌浸润作为递送系统。
  2. 蛋白质荧光标记
    1. 对每种表达的蛋白质进行荧光标记，以分析其亚细胞分布22，包括 Pd 的定位。
      注意：使用自荧光蛋白（如 CFP 和 DsRed2）作为标签。将待测蛋白与 CFP 融合，并与游离的 DsRed2 共表达。CFP 既作为标签，也作为与病毒无关的货物分子。DsRed2 用于校准瞬时表达的整体效率，并因其具有细胞自主性，可用于识别最初被转化的细胞；当评估可能不具备细胞自主性的待测蛋白的细胞间移动时，后一功能尤为重要。在与同样具有细胞自主性的 Pd 标记蛋白 PDCB1 共表达时，应将待测蛋白与 CFP 融合，PDCB1 与 DsRed2 融合。
    2. 作为一般原则，将自发荧光标签融合至表达蛋白的羧基末端。然而，如果带标签的全长检测蛋白表现出液泡分选靶向性受损，则将标签转移至蛋白的氨基末端。
    3. 将待测蛋白的编码序列克隆至合适的植物表达载体中。
      注意：有许多不同的植物表达载体可用于荧光标记。我们使用一系列 pSAT 质粒26 或其某些衍生物27,28，适用于将目的序列直接与推荐的自荧光标签在氨基端和羧基端方向上进行同框克隆（见步骤2.2.1）。
    4. 将每个表达盒转入农杆菌双元载体中。
      注意：尽管基于pSAT的载体适用于直接通过基因枪法递送至植物组织，但此处推荐的转化方法为农杆菌浸润法（见步骤3），该方法要求表达盒必须位于双元载体的T-DNA边界之间29.
      注意：所有pSAT载体均设计用于向pPZP-RCS2多基因表达双元载体进行此类转移26,30 通过使用稀有切割核酸酶 AscI、I-PpoI、I-SceI、I-CeuI、PI-PspI 和 PI-TliI 的单步克隆26偏好使用重组克隆技术的研究人员， 例如，使用异源的 lox 位点31，可使用pSAT载体变体26,27.
    5. 对于共表达，转移两个表达盒， 例如，将测试蛋白-CFP与DsRed2，或测试蛋白-CFP与PDCB1-DsRed2（见步骤2.1），共同克隆至同一pPZP-RCS2双元载体中。
      注意：或者，可将含有各自双元表达载体的农杆菌培养物混合后共同用于侵染 N. benthamiana （参见步骤 3.1）。

3. 农杆菌浸润

  1. 将 1 µg 来自步骤 2.2.5 的基于 pPZP-RCS2 的质粒加入 100 µL 感受态细胞培养物中 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 菌株 EHA105 或 GV3101，按所述方法制备32，冰上孵育30分钟，液氮中速冻1分钟，然后在28 °C下孵育15分钟。
    1. 然后，向感受态细胞混合物中加入1 mL LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl），于28 °C孵育2 h。在3,000 × g离心1 min收集细胞，用0.2 mL LB重新悬浮，接种于添加了适当抗生素的LB琼脂平板上例如，基于pPZP-RSC2载体使用100 mg/L链霉素和50 mg/L利福平26,30在28 °C下培养48小时，直至可见单个菌落。
  2. 挑取数个单菌落接种于新鲜的LB琼脂平板上（参见步骤3.1），在28 °C培养48 h，取少量细菌用于菌落PCR分析33 以确认特定双元载体的存在。
  3. 在含有适当抗生素（参见步骤 3.1.1）的 5 mL LB 培养基中，将含有目标构建物的农杆菌单菌落于 28 °C 过夜培养。在 3,000 × g 条件下离心收集菌体，并将菌体重悬至 OD600=0.5，溶于农杆菌浸润缓冲液（10 mM MgCl₂）中2，10 mM MES（pH 5.6），150 µM 乙酰丁香酮。室温孵育 2 小时。
    1. 若使用多种双元质粒而非单一的多基因表达质粒进行蛋白共表达，则在侵染前将相应的菌液按1:1（v/v）体积比混合，随后在28 °C下孵育2 h。
  4. 将接种物装入一支1 mL塑料注射器中，将注射器前端（无针头）紧贴完全成熟的叶片下表皮（远轴面） N. benthamiana 叶片。用戴着手套的手指按住叶片的近轴面34,35.
    1. 通过缓慢注射将农杆菌引入浸润介质中。为确保统计学意义，需对每株植物的多片叶片进行浸润处理。
      注意：最老的叶片不用于实验，因为其表达水平不一致。
    2. 接种所有叶片 原位按照步骤1.2所述，将已侵染的植株维持至观察前。

4. 共聚焦显微镜

  1. 在渗透后24-48小时（根据所测试蛋白瞬时表达效率而定），使用刀片沿叶脉间将每片叶片切成片段；每个组织切片的大小应确保能够被显微镜观察所用的盖玻片（22 mm × 40 mm）完全覆盖。
  2. 将叶片切片放置在载玻片上，使叶片的远轴面朝上，于切片上滴加一滴水，再盖上盖玻片。用小段胶带在盖玻片两侧固定。
  3. 在激光扫描共聚焦显微镜下观察农杆菌浸润的组织，并记录所得图像。
    1. 首先使用10倍物镜识别具有信号的细胞，然后使用63倍物镜进行更详细的观察。
    2. 使用氩离子激光器的458 nm波长激发CFP，543 nm波长激发DsRed2。保持所有图像采集参数不变。 即，实验间的激光强度和光电倍增管（PMT）设置。每种实验条件下平均检测100-120个细胞。

5. PLS 的鉴定

  1. 使用共聚焦显微镜诊断待测蛋白的定位（第4节）。检查待测蛋白是否具有特征性的周边点状分布模式25,36,37,38,39,40,41 并与Pd标记物PDCB1共定位23这表明被检测的蛋白质很可能含有 PLS 序列。
  2. 在确认待测蛋白的PLS活性后，将其开放阅读框（ORF）（GenBank登录号BAF93925.1）逐步细分为更小的片段，并进行自荧光标记，例如，CFP，）标签标记每个片段，并按照步骤4所述分析其亚细胞定位。建议初始将每个片段的大小设为100个氨基酸残基。
  3. 进一步细分具有 PLS 活性的截短片段，并按照步骤 4 所述检测其亚细胞定位，直至获得仍能定位于 Pd 的最小片段， 即 足以将自荧光标签货物运输至Pd的片段被鉴定出来。该片段被认为代表PLS序列。
  4. 删除被测全长蛋白中的假定 PLS， 即 将测试蛋白中剩余的、不含假定 PLS 的部分与自荧光标签融合，并按照步骤 4 所述确定所得突变蛋白的亚细胞定位。如果该缺失假定 PLS 的突变蛋白无法定位于 Pd，则表明所鉴定的 PLS 不仅对测试蛋白的 Pd 转运具有充分性（见步骤 5.3），而且是必需的。
  5. 用含有CFP标记的PLS表达载体和游离DsRed2的农杆菌培养物混合液对叶片进行农杆菌浸润（参见步骤3.3）。使用10倍物镜，在与步骤4.3相同的设置下，通过共聚焦显微镜观察浸润后的组织。
  6. 将同时含有CFP和DsRed2信号的细胞记为初始侵入细胞，将仅含有CFP信号的相邻细胞记为表现出移动的细胞。
    注意：此步骤用于检测已鉴定的 PLS 是否具有细胞间移动的潜力；这是因为许多靶向胞间连丝（Pd）的蛋白质（包括大多数植物病毒运动蛋白，MPs）也能通过 Pd 进入邻近细胞。用于侵染的农杆菌浓度需根据不同的表达结构分别优化。进行农杆菌介导的瞬时转化（agroinfiltration）时，应确保所用菌液稀释度能够：（i）实现单个细胞的转化，而相邻细胞未被转化；（ii）达到相对一致的表达效率。例如，我们的实验采用 OD600 分别为CFP标记的PLS和游离DsRed2的表达设置了0.01和0.005。

6. 利用丙氨酸扫描鉴定关键的 PLS 残基42

  1. 使用标准PCR方案，采用一对含有预期突变的引物扩增PLS编码序列， 即，用丙氨酸替换每个引物中央区域的目标氨基酸残基，如所述21进行引物设计，并根据生产商说明书使用定点突变试剂盒进行定点突变。
  2. 使用任何标准的DNA纯化试剂盒纯化所得的PCR产物，并在37 °C下用DpnI进行消化，以去除亲本（即，非突变的）甲基化与半甲基化DNA。室温（勿置于冰上）冷却5分钟。随后将混合物直接转化入 E. coli 感受态细胞43，并按照步骤3.2所述鉴定含有目标突变构建体的菌落。
  3. 将突变体构建体导入双元载体，具体操作如步骤2.2.4所述；进行农杆菌浸润，具体操作如步骤3所述；检测Pd的靶向定位，具体操作如步骤4和5.1所述。

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结果

代表性数据忠实地展示了所述实验方案预期得到的结果，并鉴定了TMV MP的PLS，该数据改编自Yuan et al.21。图1A首先总结了主要的构建体，包括表达全长TMV MP（1-268）、TMV MP PLS（包含该蛋白前50个氨基酸残基，即1-50）及其丙氨酸扫描V4A突变体与CFP的融合蛋白（构建方法见步骤2.2、5.2和6）；而图1B则对这些标记蛋白的亚细胞定位进行了总结与定量分析。图1C展示了TMV MP-CFP和TMV MP PLS-CFP所表现出的典型周边点状胞间连丝（Pd）定位模式，以及共表达的Pd标记蛋白PDCB1-DsRed2的定位模式（见步骤5.1）。图2A展示了TMV MP-CFP和TMV MP PLS-CFP对Pd的靶向定位，以及共表达的游离DeRed2在细胞核与细胞质中的分布情况（见步骤5.1）。最后，图2B展示...

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讨论

本方案包含四个核心组成部分：确定一段既必要又充分的靶向Pd序列的概念、将目标蛋白系统性地分割为长度逐步缩短的片段、将待测片段与一种自荧光蛋白融合，该自荧光蛋白既作为标签又作为大分子货物，以及在瞬时表达待测融合蛋白后，对活体植物组织中Pd靶向功能进行检测。需注意，农杆菌介导的瞬时表达可在相对较短时间内获得实验数据， 即几天，相比之下，生产转基因植物通常需要数月时间，而转基因植物常被用于类似研究中15.

目的蛋白与亚细胞定位标记物的共表达， 例如，PDCB1 或游离的 DsRed2 通常由一个多基因表达载体表达。然而，如果将多个表达盒转入单一载体在技术上存在困难，则也可将每个表达盒分别转入不同的双元载体，再将所得农杆菌菌株的液体培养物取等体积混合，用于农杆菌浸润实验，以实现共表达。由于本实验采用瞬时表达系统，双元载体无需携带用于稳定转化的筛选标记，尽管保留这些标记也不会影响表达效率。

本方案已针对N. benthamiana中的蛋...

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致谢

由于篇幅所限，我们主要引用了综述类文章，对于未引用其原始研究工作的同行们，我们深表歉意。V.C. 实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）、美国国家科学基金会（NSF）、美国农业部/国家食品与农业研究所（USDA/NIFA）、美以双方农业研究与发展基金会（BARD）以及美国-以色列两国科学基金会（BSF）向 V.C. 提供的资助；S.G.L. 实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）以及康奈尔大学植物病理学系和植物-微生物生物学系资金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）ZeissLSM5任何具有类似功能的共聚焦激光扫描显微镜均可使用
共聚焦显微镜成像用 Zen 软件Zeiss2009 版本软件应与所使用的共聚焦激光扫描显微镜兼容
Quickchange II 定点突变试剂盒 Agilent200523
乙酰丁香酮Sigma-AldrichD134406
MESSigma-Aldrich69892
无针头注射器BD309659
MgCl2FisherScientificM33-500
壮观霉素 Sigma-AldrichS4014
利福平Sigma-AldrichR3501
氨苄青霉素 Sigma-AldrichA0166

参考文献

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胞间连丝定位蛋白质靶向信号农杆菌浸润共聚焦显微镜荧光蛋白标记烟草花叶病毒植物细胞通讯分子转运胞间连丝靶向细胞间运输
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