蛋白质中 Plasmodesmal 定位序列的识别在底中

Summary

植物细胞间连接, 胞 (Pd), 在植物生理学和植物-病毒相互作用中扮演中心角色。对 pd 传输的关键是分拣信号, 直接蛋白质的 pd。然而, 我们对这些序列的了解还处于起步阶段。我们描述了一种在 pd 靶蛋白中识别 pd 定位信号的策略。

Abstract

胞 (Pd) 是细胞连接, 它的作用是通过在植物细胞之间传输小分子和大分子的通路。而 Pd 运输的小分子, 如离子和水, 被推定为被动发生, 细胞运输的生物大分子, 这种蛋白质, 最有可能发生通过一个积极的机制, 涉及特定的靶向信号的运输分子。识别的胞 (Pd) 定位信号 (PLSs) 的稀缺性严重限制了对植物细胞大分子运输和通讯所涉及的蛋白质分选途径的理解。从大量的植物内源性和病毒蛋白已知的交通通过 Pd, 迄今只有三 PLSs 报告, 所有这些来自内源植物蛋白。因此, 重要的是要建立一个可靠的, 系统的实验策略, 以确定一个功能 PLS 序列, 这是必要的和足够的 Pd 靶向, 直接在活植物细胞。在这里, 我们描述一个这样的战略使用作为一个范例的细胞运动蛋白 (MP) 的烟草马赛克病毒(TMV)。这些实验, 确定和特点的第一植物病毒 pls, 可以适应发现 pls 序列在多数 Pd 靶向蛋白质。

Introduction

胞 (Pd) 作为植物发育和形态发生的关键调控器的细胞间转运的导管, 从转录因子到 mRNA 和小 RNA 分子不等。此外, 大多数植物病毒利用 Pd 的大分子转运能力在感染过程中进行细胞间传播;通过 pd, 植物病毒进化出专门的蛋白质, 称为运动蛋白 (MPs), 专门针对 pd^1,2,3,45^,7. Pd 转运的分子通路最有可能是与特定的序列紧密相连的, 靶向转移的蛋白质进入这些通路。因此, 识别这些 pd 定位信号 (PLSs) 可能是对相应的 pd 转运通路的诊断。这是通过类比的 Pd 传输⁸, 例如, 不同的核进口通路, 可以具体为不同的核定位信号 (不规则) 序列^9,10。从概念上讲, NLSs 和 PLSs 都表示 non-cleavable 的亚细胞靶序列是必要和足够的目标。但是, 与 NLS....

Protocol

1. 植物材料

1. 植物种类的选择
2. 使用的植物物种的利益蛋白,即, 其中一个编码这种蛋白质的内生蛋白或代表自然宿主的病原体的病毒蛋白。此外, 选定的植物种类必须服从选择的瞬态遗传转化方法。
   注意: 这些研究通常使用烟草烟, 它代表了 TMV 的良好宿主, 并通过农杆菌介导的遗传转化技术 (即, agroinfiltration (参见步骤 3) 有效地转换。N. 烟植物也很容易生长并且有大叶子, 很容易被农杆菌接种并且通过共聚焦显微镜很容易分析。
3. 植物生长
   1. 在高密度的潮湿土壤中种植烟种子。让他们在一个受控环境室在20-25 ˚C 在 16 h 的光下在 ~ 75 µmol 光子 m^-2 s^-1和 8 h 黑暗。在 euphyll 直径达到0.5 厘米后, 小心地将幼苗转移到较大的盆中, 并在相同的条件下继续生长在同一个室内。
   2. 在4周内, 当最大的叶子直径为4-6 厘米时, 保持植株生长到4-8 叶阶段;此时, 它们可用于 agroinfiltration (参见步骤 3)。
      注意: 重要的是, 永远不要使用植物, 如果他们开始开花, 因为, 在这个发展阶段, 叶子建筑学经常变化^24,

Results

代表数据, 忠实地说明预期的结果从被描述的协议和辨认 TMV MP PLS, 适应从元et al.²¹.图 1A首先总结了表达全长 TMV mp (1-268) 的主要构造, TMV mp PLS (包括蛋白质的前50氨基酸残滓, 1-50) 和它的丙氨酸扫描 V4A 衍生物熔化了 CFP (生成作为在步骤2.2、5.2 和6中描述), 而图 1B对这些标记蛋白质的亚细胞定位进行了总结和量化。图 1C说明了为 TMV mp-CFP 和 TMV mp PLS CFP 以及 coexpressed pd 标记 PDCB1-DsRed2 (参见步骤 5.1) 观察到的特征性外周点 Pd 定位模式。图 2A说明了 TMV mp-CFP 和 TMV mp CFP 和 nucleocytoplasmic coexpressed 自由 DeRed2 分布的 Pd 目标 (参见步骤 5.1.......

Discussion

该协议有四核心成分: 确定一个序列的概念是必要的和足够的目标, 以 Pd, 系统划分的利益蛋白的片段, 逐步减少长度, 融合测试片段的 autofluorescent 蛋白, 既作为标签和高分子货物, 和功能测试的 Pd 靶向活植物组织后, 瞬态表达的检测融合蛋白。请注意, 农杆菌介导的瞬态表达式在相对较短的时间内生成数据,即, 与在类似研究中经常使用的转基因植物生产所需的月份相比, 是数天,¹⁵。

共的蛋白质的兴趣与亚细胞定位标记,例如, PDCB1 或自由 DsRed2, 通常是从基因表达载体执行。但是, 如果将多个表达式磁带传输到单个向量中是技术上的问题, 则共也可以通过将每个磁带传输到单独的二进制结构中, 并将等效的液体培养量结果农杆菌菌株为 agroinfiltration。由于该协议利用瞬态表达式, 二进制向量不需要进行稳定变换的选择标记, 尽管它们的存在不利于表达效率。

该协议针对烟中的蛋白质表达和目标进行了优化.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM）	蔡司	LSM5	任何具有类似功能的 CLSM 都是适合
共聚焦显微镜成像的 Zen 软件	蔡司	2009 版	该软件应与使用的 CLSM 兼容
Quickchange II 定点诱变试剂盒	安捷伦	200523
乙酰丁香酮	Sigma-Aldrich	D134406
MES	Sigma-Aldrich	69892
无针头	BD	309659
MgCl2	FisherScientific	M33-500
大观霉素	Sigma-Aldrich	S4014
利福平	Sigma-Aldrich	R3501
氨苄青霉素	西格玛奥德里奇	A0166