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测量与建模人体角质层的收缩性干燥

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DOI：

10.3791/55336

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2017年3月1日

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Binghamton University

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过测量粘附在弹性体基底上的圆形组织样本在平面内的空间分辨干燥位移，来量化角质层动态干燥行为和机械性能的方法。该技术可用于测量不同化学处理对干燥过程及组织机械性能的影响。

摘要

角质层（SC）是皮肤的最表层。由于其与外界环境直接接触，该组织层会受到清洁剂和环境湿度日常变化的影响，这两者均可能改变组织的含水量。当皮肤屏障功能严重受损或处于低湿度环境时，角质层含水量下降，可能导致其刚度发生变化，并产生干燥应力的累积。在极端情况下，这些因素可导致组织发生机械性破裂。我们已建立一种高通量方法，用于量化角质层在干燥过程中力学性质的动态变化。该技术可用于评估在使用化妆品清洁剂和保湿剂处理后，角质层干燥行为及其力学性质的变化。该方法通过测量粘附于弹性基底上的圆形组织样本在干燥过程中空间分辨的面内干燥位移的动态变化来实现。干燥过程中获取的面内径向位移经过方位角平均后，采用基于线性弹性收缩模型的曲线进行拟合，进而从拟合的模型曲线中提取干燥应力和角质层弹性模量的动态变化信息。

引言

表皮的最外层，即角质层（SC），由充满脂质基质包围的紧密连接的角质细胞构成1,2。角质层的组成和结构完整性对于维持正常的屏障功能至关重要3，该屏障功能可防止微生物侵入，并抵抗机械力和过度水分流失4。个人护理产品维持或破坏皮肤屏障功能的能力，是皮肤健康护理和化妆品行业广泛关注的问题5。已知日常使用个人护理产品会改变角质层的机械性能6,7,8。例如，化妆品清洁剂中的表面活性剂可显著增加角质层的弹性模量，并在其中积累干燥应力，从而提高组织开裂的倾向7,9。几乎所有化妆品保湿剂中含有的甘油则可软化角质层，减少干燥应力的积累8,10,11，从而降低组织破裂的可能性。

本文所述方法能够在受控环境中定量分析角质层（SC）干燥过程中的动态干燥行为及其力学特性7,8。此前，该技术已成功用于阐明不同化妆品对角质层组织动态干燥行为及力学特性变化的影响。该方法通过定量测定粘附于柔软弹性基底上的人体角质层组织在干燥过程中产生的收缩，利用简化的收缩模型拟合干燥位移，并从拟合曲线中提取弹性模量和干燥应力。当需要测试多个角质层样本时，该方法相较于单轴张力测试更为快速，所需组织量显著减少，同时通过防止样本底面蒸发，实现了更符合生理条件的干燥过程。

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方案

已获得豁免批准（3002-13），依据美国卫生与公共服务部法规 45 CFR 46.101(b)(4)，可使用去标识化的组织样本开展研究。全层皮肤组织来源于择期手术。本文所用组织来自一名66岁白人女性的乳腺组织。

1. 弹性体包被盖玻片的制备

  1. 在20 mL玻璃小瓶中，将0.107 g Sylgard 184固化剂与5.893 g基础剂混合。总混合物质量为6 g，基础剂与固化剂的比例为55:1。
  2. 用玻璃棒搅拌以确保混合均匀后，将玻璃小瓶放入真空腔中脱气，以去除所有气泡。
  3. 将一片玻璃盖玻片（55 mm × 25 mm）置于旋涂仪中心。在盖玻片中心加入约1 mL混合液，使用剪去末端的5,000 µL移液器进行操作。以2,000 rpm转速旋涂60 s。
    1. 重复此步骤以制备5–6个基底。
  4. 将盖玻片在60 °C烘箱中固化12 h。
  5. 使用剃刀刀片从牺牲基底上部分剥离弹性体薄膜。用永久性记号笔标记弹性体薄膜的上表面以及暴露的玻璃表面。
  6. 将样品安装在倒置显微镜上，并使用远程聚焦附件记录两个标记物焦平面之间z轴高度的差异。该差值即为弹性体基底的厚度h。

2. 角质层的制备

  1. 使用水浴锅或加热磁力搅拌器将装有去离子水（DW）的玻璃烧杯加热至 60 °C，烧杯容量填充一半。在生物安全柜内，将全层人皮肤浸入水中 4 分钟。
  2. 立即将皮肤样本转移至另一烧杯中，该烧杯盛有冷却至 <10 °C 的去离子水，浸泡 4 分钟。烧杯填充一半可最大限度减少生物危害性物质的飞溅。
  3. 从烧杯中取出皮肤，置于培养皿中，使用弯头组织镊子轻轻分离表皮层。
  4. 将分离得到的表皮基底面朝下放置于铺有纱布的培养皿中。确保基底层完全与纱布接触。
    1. 用 0.1 M 磷酸盐缓冲液溶解的 0.25%（wt/vol）IX-S 型猪胰蛋白酶溶液浸泡纱布，室温孵育 6–8 小时。容器中加入的胰蛋白酶溶液量仅需润湿纱布即可。
  5. 用组织镊子夹起纱布，并将其漂浮于盛有部分去离子水的容器中。轻轻牵拉角质层（SC），使其与纱布分离。
  6. 用去离子水洗涤角质层 3–4 次，以去除仍附着在 SC 上的残留表皮组织。
  7. 将分离的角质层漂浮于含 0.4% 大豆（glycine max）胰蛋白酶抑制剂的去离子水溶液中。使用平板摇床振荡组织 10 分钟。
  8. 将角质层漂浮于部分装有去离子水的培养皿中。使用平板摇床振荡组织 10 分钟。
  9. 将分离的角质层薄片置于超细塑料网筛上，在室温（25 °C，40% 相对湿度（R.H.））条件下干燥 48 小时。
  10. 从网筛上取下角质层，并使用圆形打孔器切割出直径为 R=3 mm 的圆形样品。使用永久性标记笔在样品最外表面中心处标记一个小螺旋符号，作为识别角质层正面的视觉标记。
    注意：永久性标记应位于样品中心，此处干燥引起的形变最小，可最大限度减少标记对记录的干燥位移曲线的影响。

3. 样品处理与沉积

  1. 将角质层（SC）样品在含有90 µL荧光标记微珠（505/515 nm，直径1 µm，羧基修饰）的15 mL去离子水（DW）中振荡30分钟。此步骤可使微珠沉积在SC表面
    注意：尽管在SC表面沉积大量微珠可能会略微减缓其干燥速度，相较于未加微珠的样品12，但可最大限度提高后续获得的面内变形场的空间分辨率。因此，添加微珠的体积应根据具体情况临时决定（ad hoc）。
  2. 取出SC样品，并将其置于部分装有去离子水的培养皿中。
  3. 以15–30°的浅角度将基底部分浸入去离子水中。
  4. 将漂浮的SC样品的一边固定在基底与水界面的接触线处。垂直从水中提起基底，可使SC样品平滑地贴合到基底上，避免产生皱褶或夹入气泡。
  5. 重复步骤3.4，将最多6个SC样品贴附至同一基底上。样品之间应至少保留2–3 mm的间隙，并避免在基底边缘附近进行贴附。这可防止一个样品的干燥过程影响其他样品的干燥位移。
  6. 在实验室条件下将固定好的SC样品干燥60分钟。此过程可使SC与基底之间的残留水分完全蒸发，并确保组织完全粘附。
    注意：在此阶段，可通过将基底倒置浸入所需溶液中一定时间，对SC样品施加化学或化妆品制剂处理7,8。处理完成后，重复步骤3.6。干燥后，可使用透射光显微镜检查SC样品是否完全粘附于基底。样品下方的夹带气泡或脱层边缘会在样品中形成具有清晰边界的明显对比差异。
  7. 通过将部分装水的培养皿放入密闭容器中，构建一个湿度控制环境（湿度室）。
  8. 将基底放入该湿度室中24小时，使其平衡至99%的相对湿度。切勿将基底直接放入培养皿的水中。

4. 显微镜环境控制

  1. 通过连接至显微镜可安装灌流腔的湿度控制系统，实现对环境条件的控制。该湿度控制系统的详细信息以德文提供。 等 (2013)7 和 Liu 与 German（2015）8.
  2. 将基底安装到显微镜上，在基底上放置灌流室，并使用真空脂将灌流室边缘密封至弹性体。
  3. 安装后，在开始实验前将内部空气平衡至99%相对湿度（R.H.），以防止实验前水分蒸发。一旦开始第5或第7部分的成像，将内部空气湿度降低至所需值。
    注：本文中，SC 样品被干燥至 25% 相对湿度（R.H.）

5. 平面干燥位移中的成像

  1. 使用倒置显微镜和10倍物镜获取SC样本的图像。利用配备FITC滤光片（503-530 nm发射带通）的光源激发荧光微珠。可通过自动化的x-y载物台，在样本干燥过程中连续成像多个样品。
  2. 使用数字CCD相机以1,392 x 1,040像素的分辨率记录荧光和透射光图像。每幅图像的视场为8.98 x 6.71 mm，可单幅图像完整捕获整个SC样本。以每10分钟一次的频率连续采集图像，持续16小时。

6. 厚度测量用基底的制备

  1. 在化学通风橱中，取 1 mL 偶联剂（3-氨基丙基三乙氧基硅烷；≥98%）置于小型塑料盖内。将第 1 节中的弹性体基底与该盖一同放入密闭容器中，处理 5 小时。注意避免基底直接接触偶联剂。
  2. 取 5 mg EDC（N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐；≥99%）加入 1.5 mL 离心管中。向 EDC 中加入 500 µL 去离子水（DW），涡旋振荡 10 秒以混匀溶液。
  3. 将 0.076 g 四硼酸钠和 0.1 g 硼酸加入 20 mL 去离子水中。在 70 °C 下使用磁力搅拌器搅拌混合 1 小时。继续添加硼酸直至溶液 pH 值达到 7.4。
  4. 将 20 mL 硼酸盐缓冲液转移至 50 mL 离心管中。加入 60 µL 的 1 µm 微球（535/575 nm，羧基修饰）至该缓冲液中。最后，加入 200 µL EDC 溶液。振荡混匀后，将混合液倒入直径为 10 cm 的培养皿中。
  5. 从容器中取出经硅烷化处理的基底，将其弹性体薄膜面朝下缓慢放入微球溶液中，操作时应缓慢以避免产生气泡。每个培养皿中可放置两个基底。
  6. 让基底在微球溶液中漂浮 45 分钟。
  7. 使用镊子将基底从微球溶液中取出，然后用去离子水冲洗以去除未结合的微球。
  8. 将基底自然晾干。用压缩空气吹拂弹性体薄膜表面可减少水渍的形成。
  9. 将基底密封存放于不透明容器中，以防止微球在单细胞样品沉积前发生光漂白。

7. 角质层厚度成像

  1. 使用第3节方法将角质层（SC）样品沉积到基底上。但在执行步骤3.1时，不要向去离子水中添加荧光微珠。此外，在完成步骤3.6之前，使用移液器将5 µL未稀释的荧光标记微珠溶液（505/515 nm，直径0.1 µm）滴加到每个沉积的SC样品表面。
  2. 使用配备40倍物镜的显微镜测定SC厚度。通过远程调焦附件，测量位于SC-基底界面和SC上表面的两层微珠的焦平面之间的z轴高度差，从而记录SC样品随时间变化的厚度。
  3. 在3小时的干燥过程中，测量每个SC样品的3个区域的厚度。在此时间段内，SC样品的厚度将达到稳定值8。

8. 组织变形的量化与建模

  1. 采用粒子图像测速技术13，从每个记录时间步长的荧光图像中获取空间分辨的平面内干燥位移。
  2. 使用 MATLAB 从每个径向对称的角质层（SC）样品的位移场中获得径向和方位向位移的方位平均分布。
    注：补充信息中已提供一个示例数据集（名为 'd.mat'）和 MATLAB 代码（名为 'PIV-processing.m'），该代码可完成此步骤及步骤 8.3 的操作。
  3. 将径向位移分布拟合至一个模型7,8,14,15,16，该模型将干燥的角质层描述为一个厚度随时间变化（hSC）、半径为 R、弹性模量为 ESC 的线性弹性圆形薄盘，其附着于弹性模量为 E 的可变形弹性基底上。假设角质层具有明确且恒定的泊松比，νSC = 0.47,8。采用最小二乘法获得最佳拟合结果。
    注：用于拟合的模型以修正贝塞尔函数表示径向位移，其表达式为：
    figure-protocol-1             (1)
    其中 figure-protocol-2， figure-protocol-3 和 figure-protocol-4
    项 figure-protocol-5 对应一个穿透深度，其表达式为：
    figure-protocol-6。
    figure-protocol-7 表示一个基底刚度参数；当样品尺寸远大于基底厚度时该参数有效。此处，参数 figure-protocol-8 和 figure-protocol-9 分别表示基底厚度和泊松比。硅胶弹性体基底17 的泊松比为 ν = 0.5。
  4. 通过将公式 (1) 以最小二乘法拟合至径向位移分布，获得每个时间步长下的模型参数 α 和 β。
    1. 利用拟合参数 β，根据下式计算角质层弹性模量 ESC：
      figure-protocol-10
    2. 利用拟合参数 α，根据下式计算随时间变化的收缩干燥应力 PSC：
      figure-protocol-11

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结果

图1(a) 显示了涂覆有荧光微珠的角质层（SC）样品的代表性荧光图像（见第3节）。图1(b) 显示了该样品对应的透射光图像，并叠加了在25%相对湿度下干燥16小时后形成的、空间分辨的干燥位移的矢量图。由于样品具有圆对称性，这些位移可进行方位角平均。图1(c) 展示了径向位移（ur，实心红线）和方位角位移（uθ，虚线蓝线）随无量纲径向位置 r/R 变化的曲线图。其中，R 表示SC样品的平均半径，r/R = 0 表示样品中心，r/R = 1 表示样品边缘。各径向位置的标准差以均值周围的阴影区域表示。这些变异主要由SC结构的异质性引起3,7,12。在整个干燥过程中，方位角位移始终保持较小值；而径向位移曲线则从中心到边缘单调增加，并在达到平衡前持续增大...

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讨论

本文介绍了一种可用于测量人体角质层（SC）动态干燥行为和机械性能的技术。先前的研究表明，该技术可用于量化环境条件以及化妆品清洁剂和保湿剂中常用化学产品对角质层动态干燥行为的影响7,8。本实验方案包含若干关键步骤。首先，角质层的含水量会显著影响其膨胀程度，因此，准确测量角质层的厚度以及面内位移对于精确预测弹性模量和干燥应力大小至关重要。其次，样品必须完全粘附于基底上。应避免粘附不完全、非径向对称的样品，或存在微小撕裂或孔洞的样品，因为这些因素会显著影响干燥变形的分布以及用于模型拟合的径向位移曲线。

若无法获得湿度控制系统，可采用该技术。在无环境控制的条件下，组织样本在实验室环境中会脱水干燥12。因此，应持续监测并维持实验室环境，因为干燥行为及实验结果的可重复性会受到温度和湿度的昼夜变化及季节性变化的影响。

目前，该技术仅限于能够附着在基底上并引起弹性体薄膜形变的样品...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
硅弹性体基质Dow-Corning1064291
硅弹性体固化剂Dow-Corning1015311
FluoSpheres 羧基 0.1 µm 黄绿色荧光 505/515 Thermo FisherF8803
FluoSpheres 羧基 1 µm 黄绿色荧光 505/515 Thermo FisherF8823
FluoSpheres 羧基 1 µm 尼罗红荧光 535/575 Thermo FisherF8819
猪胰蛋白酶Sigma-AldrichT6567
胰蛋白酶抑制剂 II-s 型Sigma-AldrichT9128
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷Sigma-Aldrich440140
四硼酸钠Sigma-Aldrich221732
硼酸Sigma-AldrichB0294
磷酸盐缓冲液Sigma-AldrichP7059
N-(二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐Sigma-AldrichE7750
涡旋混合器VWR58816-123
6 mm 直径打孔器Sigma-AldrichZ708860
SOLA 6-LCR-SB Lummencor 光源引擎No.3526
Cfi Plan Achro Uw 1X 物镜Nikon Plan UWMRL00012
CFI Plan Fluor 40X 油镜 1.3 数值孔径 - 0.20 mm 工作距离Nikon Plan FluorMRH01401
Nikon Eclipse Ti-U 倒置显微镜 NikonMEA53200
Clara-E 相机AndorDR-328G-C02-SIL
远程聚焦附件 E-RFA Ergo 设计Nikon99888
Ti-S-E 电动载物台NikonMEC56110

参考文献

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