用同位素标记不同的姐妹组蛋白重建核小体

摘要

本方案描述了含有不同同位素标记的姐妹组蛋白的核小体的重建方法。同时，在使用预先修饰的组蛋白拷贝后，可生成不对称翻译后修饰的核小体。这些样品可直接用于高分辨率核磁共振（NMR）波谱技术，同时研究姐妹组蛋白上的修饰串扰机制。

摘要

不对称修饰的核小体包含两个组蛋白拷贝（姐妹组蛋白），其上带有不同的翻译后修饰（PTMs）组合。这类新近发现的核小体形式，其建立机制及功能意义尚不明确。目前的分析方法尚无法有效检测核小体中姐妹组蛋白上特异性PTM的分布情况。本方案介绍了一种生物化学方法，用于 体外 重组包含不同同位素标记的姐妹组蛋白的核小体。在组蛋白亚复合物复性过程中加入预先修饰的组蛋白混合物，可生成不对称修饰的复合物。这些不对称核小体制备物可进一步与组蛋白修饰酶反应，利用核磁共振（NMR）波谱法研究由不对称预整合的PTM所介导的修饰间串扰机制。特别是通过针对各自同位素类型的NMR相关实验，可独立地实时监测两种姐妹组蛋白上的修饰反应。该方法为研究促进核小体复合物上不对称PTM模式形成与传播的串扰机制提供了有效手段。

引言

真核生物的DNA在细胞核内被紧密地包装成染色质。染色质的基本结构单元是核小体核心颗粒，其包含约147个碱基对的DNA，缠绕在一个由四种核心组蛋白（H3、H4、H2A、H2B）各两个拷贝组成的八聚体复合物上。组蛋白蛋白具有多种翻译后修饰（PTMs）。这些共价修饰可通过影响系统的物理化学性质直接发挥作用，或通过招募染色质重塑活性间接发挥作用，从而改变染色质结构^1,2,3。通过这些机制，组蛋白PTMs调控染色质的可及性，进而调节所有以DNA为基础的细胞功能⁴。

翻译后修饰主要由组蛋白修饰酶系统催化，作用于核小体中核心组蛋白的无序N端区段（即“尾部”）。由于组蛋白尾部相对较短的序列上存在多个修饰位点，翻译后修饰可通过促进或抑制后续修饰反应而相互影响，这种现象称为修饰间的串扰。⁵由于核小体整体结构的对称性，人们曾认为修饰反应及串扰机制在每种核小体组蛋白的两个拷贝（姐妹组蛋白）上是相似发生的。这一概念最近受到挑战并随后被证伪。特别是， 体外 在游离组蛋白H3尾部肽段和核小体上进行的酶学实验表明，一组H3激酶以不对称方式引入磷酸化修饰⁶此外，基于....

方案

1. 利用同位素标记（及不对称修饰）的姐妹组蛋白重建核小体

注意：： 本实验方案描述了使用同位素标记不同的组蛋白H3重建核小体的方法。为此，使用了两组组蛋白H3：一组为¹⁵N标记，并在N端带有6xHis标签；另一组为¹³C标记，并在N端融合Strep肽段（WSHPQFEK）。两种标签均通过烟草蚀刻病毒（Tobacco Etch Virus, TEV）蛋白酶识别位点与天然H3序列分隔。为制备其他不对称修饰的核小体，可将其中一组H3以预先修饰的形式加入。组蛋白组的预修饰可通过将目标同位素标记组蛋白与相应的组蛋白修饰酶在各类反应所需的辅因子/PTM供体存在下进行反应来实现¹⁶。可通过核磁共振（NMR）波谱法或质谱法评估相应PTM修饰的效率。此处使用的组蛋白/DNA用量仅为粗略建议，旨在获得DNA浓度（260 nm处测定）约为10 µM的核小体制剂。该最终产量足以在相对较短的采集时间内获得高质量的NMR谱图。

1. 利用不同同位素标记（及不对称修饰）的组蛋白H3重建组蛋白八聚体
   注意：重组组蛋白可在BL21(DE3)plysS细胞中以毫克级产量表达¹⁴。为获得同位素标记的组蛋白，采用相同的表达/纯化流程，唯一区别在于细菌培养时使用含¹⁵

结果

将重建混合物通过凝胶过滤柱后，可分离出正确折叠的八聚体物种（图2）。含有三种不同类型八聚体的重建八聚体混合物随后进行串联亲和纯化。收集各步骤的样品，并通过SDS-PAGE及后续的WB进行分析。通过检测不同样品中两种亲和标签（His-和Strep-）的存在情况，可验证该实验方案是否正确执行，从而实现不对称物种的分离（图3）。随后，通过TEV蛋白酶消化去除亲和标签（图4）。去除亲和标签后的不对称八聚体用于重建不对称核小体。首先，通过小规模预实验确定DNA与八聚体的最佳摩尔比，以获得高产率的单分散复合物。随后，采用优化后的混合比例进行大规模核小体重建。通过蛋白/DNA凝胶和NMR波谱分别分析核小体的正确组装情况以及姐妹H3组蛋白的不同同位素标记情况（图5）。图6展示了一个应用实例：将不同同位素标记且H3S10位点不对称磷酸化的核小体与Gcn5乙酰转移酶反应，并通过NMR波谱实时监测两个H3拷贝上H3K14位点的.......

讨论

在核小体重建过程中，本方案采用一种长度为165 bp的DNA模板，其中包含601-Widom核小体定位序列²⁰，但使用不同长度的DNA模板也预期可获得类似效果。该方案的设计与应用基于不对称类型的组蛋白H3。依据相同原理，该方法也可用于其他核心组蛋白，并可用于重建携带两种不同同位素标记的核心组蛋白的复合物。该方案还可稍作修改，以首先重建组蛋白亚复合物，而非直接重建组蛋白八聚体。通过此修改，可采用相同的串联纯化方案重建不对称的H3-H4四聚体。随后将这些四聚体与分别重建的H2A-H2B二聚体及DNA混合，以组装成核小体¹⁶。经修改后的方案在最终产率和整体性能方面与原始方案相似。

该方案高度依赖于两个亲和层析柱有效结合相应物种的能力，从而最终获得高纯度的不对称复合物。要直接且具体地证明最终纯化的复合物确实且仅是不对称形式，较为困难。然而，使用相应抗体对各纯化步骤样品进行蛋白质印迹（WB）分析，可为串联纯化方案的成功提供可靠的证据（图3）。通过核磁共振（NMR）.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸胍	Applichem	A14199	使用高纯度的 Gu-HCl
Tris	Roth	4855.2
DTT	Applichem	A1101
NaCl	VWR chemicals	27810.364
EDTA	Roth	8043.2
Na2H2PO4	Applichem	A1046
NaH2PO4	Applichem	A3902
咪唑	Applichem	A1073
d-脱硫生物素	Sigma	D1411
Ni-NTA Superflow	Qiagen	1034557
Strep-Tactin Superflow	IBA	2-1207-001
His-probe 抗体	Santa Cruz	sc-8036
Strep-tactin 偶联 HRP	IBA	2-1502-001
Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg	GE Healthcare	28-9893-35
6 - 8 kDa 透析膜	Spectrumlabs	spectra/por 1, 132650
50 kDa 透析膜	Spectrumlabs	spectra/por 7, 132129
10 kDa 离心过滤单元	Merck Millipore	UFC901024
30 kDa 离心过滤单元	Merck Millipore	UFC903024
溶液态核磁共振波谱仪			工作频率至少为 500 MHz，并配备三共振低温探头
缓冲液名称	组分
变性缓冲液	7 M 盐酸胍
	20 mM Tris，pH 7.5
	10 mM DTT
复性缓冲液	10 mM Tris，pH 7.5
	2 M NaCl
	1 mM EDTA
	2 mM DTT
测定缓冲液	25 mM Na2H2PO4，pH 6.8
	25 mM NaCl
	2 mM DTT