方法文章

蒸发减少型培养条件提高微孔板中多细胞球体形成的可重复性

DOI：

10.3791/55403

⸱

2017年3月7日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Translational Medicine, Palacky University in Olomouc

本文内容

摘要

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微孔板中培养基的不均匀损失会影响均一多细胞肿瘤球体形成的可重复性。优化培养条件以减少显著的培养基损失，将有助于提高采用液体覆盖技术进行类球体形成实验及其相关检测结果的可重复性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

高度模拟肿瘤的模型 在体 条件在抗癌药物筛选的药物发现与开发中正变得越来越流行。多细胞肿瘤球（MCTSes）能有效模拟实体瘤的生理条件，使其成为理想的模型 体外 用于先导化合物优化和靶点验证的模型。在多种可用于多细胞球体（MCTS）培养的技术中，琼脂糖上的液体覆盖法是生成MCTS最经济的方法之一。然而，采用液体覆盖法进行高通量筛选时，MCTS培养物的可靠转移可能受到若干因素限制，包括微孔板（MPs）需包被琼脂糖，以及不同孔间MCTS形成的一致性难以重复。微孔板易受边缘效应影响，这是由于板外缘培养基过度蒸发所致，从而限制了整块板在药物测试中的应用。本文提供了液体覆盖技术的详细技术改进方案，以提高MCTS均匀形成的可扩展性和可重复性。此外，还介绍了一种简单、半自动且具有普适性的软件工具，用于药物处理后MCTS特征的评估。

引言

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肿瘤中的癌细胞在生理上以复杂的三维（3D）结构排列，周围环绕着细胞外基质及相互作用的细胞。由于组织中几乎所有细胞都存在于3D环境中，因此迫切需要更符合生理相关性的 体外 模拟肿瘤特征的肿瘤模型推动了多种三维培养技术的发展1,2,3这些模型现已成为研究肿瘤微环境在三维条件下对转移及细胞治疗反应作用的基础研究工具。2此外，与二维（2D）细胞培养相比43D 模型有助于更好地理解影响细胞信号通路的肿瘤-间质相互作用。

癌细胞系的多细胞肿瘤球体（MCTSes）因其在三维细胞培养模型中相对接近 体内 肿瘤。在现有的多种技术中，基于琼脂糖包被板的液体覆盖技术（LOT）在多细胞肿瘤球体（MCTS）生成中备受关注，广泛应用于先导化合物优化和靶点验证。5,6,7,8,9,10,11这一点在最近的研究中显而易见，这些研究已成功利用LOT在MCTS培养物中开展了化合物文库的初步筛选。6,7然而，由于蒸发导致培养基不均匀流失，使用微孔板（MPs）进行液滴法（LOT）时常出现类球体（MCTS）形态和生长在孔间变异的问题。因此，形成的MCTS不均一，会影响药理学实验数据的显著性和相关性。8,12,13除了可重复性问题之外，基于液滴微阵列（LOT）的高通量检测面临的另一个实际问题是使用自动液体分配装置时磁珠（MPs）会被琼脂糖包被。尽管可通过加热液体分配装置以防止琼脂糖凝胶化，但分配卡匣和管路发生堵塞仍是机器人系统潜在的隐患。6.

为了克服其中一些挑战，我们近期对用于MCTS培养的LOT方法进行了一些改进8。这些改进主要基于利用高通量筛选实验室中常见的仪器，防止微孔板（MPs）中培养基不均匀流失的可行途径。本文详细介绍了改进后的LOT方法，用于在384孔板（WPs）中生成大小均一且可重复的MCTS。此外，本文还介绍了一种半自动化的MCTS尺寸评估流程，特别适用于部分解体、经药物处理且横截面积边界不清晰的MCTS的测量。

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方案

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1. 琼脂糖包被平板的制备

  1. 称取0.75 g低熔点琼脂糖，加入100 mL不含血清的McCoy's 5A培养基（含或不含酚红）。将溶液放入微波炉加热，每隔1-2分钟摇动一次，直至琼脂糖完全溶解。将溶液进行高压灭菌以实现无菌。
  2. 将灭菌后的琼脂糖冷却至约70 °C，在超净台中通过500 mL、0.22 µm滤膜进行真空过滤。若不一次性使用全部溶液，可将0.75%过滤琼脂糖溶液（FAS）分装成较小体积。将此即用型琼脂糖溶液无菌保存于冷室或4 °C冰箱中，最多可保存4周。
  3. 将带有塑料或金属喷嘴的加样盒连接至Combi试剂分配器，并在超净台中先用70%乙醇（EtOH）润洗加样盒，再用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）预冲洗。
  4. 使用前，将储存的FAS分装液在微波炉中加热融化。用琼脂糖溶液润洗加样盒，然后向384孔、经组织培养（TC）处理的“特殊”微孔板中每孔加入15 µL FAS。让微孔板中的琼脂糖冷却15-20分钟后再接种细胞。将包被琼脂糖的微孔板无菌包装于聚乙烯袋中，避光保存于冷室或4 °C环境中。
    注意：避免反复加热0.75% FAS，以防储备液中琼脂糖浓度发生变化。按上述条件保存时，琼脂糖包被板可保存最多2周。包被微孔板时无需对FAS加热。
  5. 用70-80 °C的无菌水冲洗加样盒，以清除喷嘴和管路中残留的琼脂糖，完成清洗。

2. 细胞培养与多细胞球体形成

  1. 培养人结直肠癌 HCT116 细胞，方法如前所述8.
  2. 从冷藏处取出所需数量的琼脂糖包被、384孔、TC处理的微孔板，于室温（RT）平衡15分钟。
  3. 使用标准管式分配盒，用70% EtOH和无菌PBS对Combi试剂分配器进行引液，为细胞接种做好准备。通过分配器上的手动设置按钮，将接种体积调整至所需的µL，并将分配速度设为中等。
    注意：整个细胞接种过程均在无菌条件下于层流箱内进行。
  4. 使用重组细胞解离酶从组织培养瓶中解离贴壁细胞。在无菌烧杯中制备细胞悬液原液，接种细胞密度为 2.5 x 104 每孔加入50 µL完全培养基，细胞密度为cells/mL。若接种多个384孔板，需使用磁力搅拌器搅拌细胞悬液，防止细胞沉降至烧杯底部。
  5. 让培养板在室温下静置 30 分钟，然后在 4 × g 条件下离心 15 分钟。
  6. 同时，取一个防蒸发环境盖，加入8 mL无菌H2O 或 5% 二甲基亚砜（DMSO）加入短边（左侧和右侧）中，使用 5 mL 移液管（图1A首先，将移液器吸头缓慢上下移动，向左侧槽中加入4 mL填充液。右侧槽同样重复此步骤。
    注意：加入侧槽的液体不可在盖子中央汇聚，需留出气体交换的间隙（图1A）。加入过量的 H2O导致H渗漏2O流向外侧的盖子，随后进入384孔TC板的外周孔中。
  7. 用无菌 H 填充 384 孔 TC 板的液体储液槽2O，并将常规培养皿盖替换为装有液体的环境控制盖（图2A).
  8. 将培养板置于37 °C、95%湿度、5% CO₂的旋转培养箱中2，以及20% O₂2，让细胞聚集形成多细胞球体（MCTSes）培养4天。在随后的几天中，避免长时间打开培养箱门，以防止湿度水平骤降。

3. 使用机器人系统进行培养基更换

  1. 在MCTS形成后的第4天，使用自动微孔板洗涤器分配器向每孔加入30 µL预热培养基。继续培养MCTS 3天。此后每3天定期更换培养基，直至MCTS达到实验所需的大小。
  2. 为从每孔中吸取指定体积的培养基，需通过实验调整洗涤器多通道头的z轴高度。每孔吸取30 µL培养基，并替换为30 µL新鲜的预热培养基。
    注意：将分配速度以及洗涤器多通道头进入孔板的速度设为最低，以尽量减少孔内液体的湍流。

4. MCTS 的高内涵成像与半自动化图像分析

  1. 使用4倍空气物镜（N.A. 16）在高内涵自动成像系统中对MCTS进行成像。
  2. 将曝光时间设置为11 ms，像素合并（binning）设置为4 × 4。根据实验需要，调整z轴堆栈的数量和间距以及像素合并参数，以捕获每个孔中完整的MCTS图像。
  3. 按照“readme”文件中的说明，使用自行编写的编程语言程序逐步处理图像。
    注意：.m代码文件和.txt说明文件可作为补充代码文件获取（图1B）。该程序从2D图像中测量MCTS的面积、长轴和短轴、周长以及实心度（solidity）。

通过图像处理流程图比较液体操作准确性，突出显示预处理和分割步骤。
图1：环境盖的制备及半自动分析流程图。（A）用于减少蒸发的环境盖图像，其中分别加入了正确量（左侧）和过量（右侧）的填充液体（此处为5% DMSO）。箭头指示从短边凹槽加液的位置。星号表示在加入正确体积的DMSO后，盖子中央出现的间隙。（B）展示半自动图像分析流程中各步骤的工作流程图。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

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在培养体积较小的微孔板（MPs）中，培养基的不均匀丢失，尤其是外周孔的丢失，是一个常见问题。通过显著改善的培养条件，例如使用温湿度控制良好的培养箱以及减少蒸发的微孔板和板盖，可降低各孔中培养基的大量丢失8。为测量相对蒸发量，向每个孔中加入等体积的橙黄G（Orange G, OG），并在标准培养箱和旋转培养箱中，分别使用普通板盖和环境控制板盖的微孔板上，记录3天内OG吸光度的变化。根据各孔距板边缘的距离，将微孔板的孔分为6组（图2A）。在标准培养箱中使用普通板盖的微孔板中，第1至第4组的OG吸光度随时间发生了显著变化（图2B）。尽管在环境控制板盖与旋转培养箱组合条件下，第1组孔的OG吸光度也存在一定程度的变化（图2C），但其变异系数（CVs）明显低于标准培养箱中使用普通板盖的微孔板（图2D）。

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讨论

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用过滤的琼脂糖包被384孔TC板

在LOT中的标准操作是使用1-1.5%的低熔点琼脂糖来包被培养板，这要求琼脂糖和/或分配单元保持加热状态，以防止琼脂糖凝固6。当使用内径在0.2至0.4 mm之间的细管路液体分配卡盒制备多块培养板时，琼脂糖的凝固可能成为一个潜在问题。为克服分配卡盒可能发生的堵塞问题，采用了0.75%的FAS，因其在分配过程中无需额外加热。偶然发现，0.75%的FAS比未过滤的1-1.5%甚至0.75%琼脂糖溶液凝固速度更慢。使用0.75%的FAS，可在不到35秒内完成整块384孔组织培养板的包被，且不会堵塞分配卡盒。实验结束后，可通过用加热的水对卡盒进行预冲洗来清洁卡盒，以去除残留的琼脂糖，防止卡盒闲置时残留物堵塞尖端。

环境盖与旋转孵育器相较于常规培养皿盖与孵育器

蒸发引起的培养基不均匀损失显著影响了均一MCTS形成的可重复性，从而损害了检测结果的可靠性14。令人意外的...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本工作得到了捷克教育、青年和体育部（LO1304）以及捷克技术局（TE01020028）资助项目的资助。作者谨此感谢Lakshman Varanasi博士拍摄环境盖板的静态图像。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖Sigma-AldrichA9414低熔点
McCOY's 5A 培养基Sigma-AldrichM8403
“rapid” Filtermax 滤器TPP995050.22 μm，500 mL
Multidrop™ Combi 试剂分配仪 Thermo Fisher Scientific5840300
小管路分配卡盒 Thermo Fisher Scientific24073295金属喷嘴 
384 孔细胞培养板 PerkinElmer6057308板型 - CellCarrier
标准管路分配卡盒Thermo Fisher Scientific24072670
MicroClime 环境盖LabcyteLLS-0310
DMSOSigmaD4540
旋转培养箱（SteriStore）HighRes Biosolutions23641序列号：D00384
微孔板洗板与分配系统 BioTek未指定型号：EL406 
高内涵成像系统（CellVoyager）横河电机株式会社未指定型号：CV7000
橙黄GNew England BiolabsB7022S
TrypLE™ Express 重组细胞解离试剂Thermo Fisher Scientific12604021无酚红

参考文献

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