本文介绍了一种快速肌纤维分析方案，该方法可提高染色质量，从而利用免费软件 ImageJ 实现肌纤维群体的自动采集与定量分析。
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本文内容
摘要
摘要
对肌纤维群体进行定量分析可更深入地揭示疾病、创伤及各种其他因素对骨骼肌组成的影响。传统上，多个研究领域常采用多种耗时的方法来研究肌纤维群体。然而，近年来发展的基于肌球蛋白重链蛋白表达的免疫组织化学方法，为在单个切片中快速鉴定多种肌纤维类型提供了替代方案。本文介绍了一种快速、可靠且可重复的染色优化方案，可实现整个横切面的自动采集以及利用ImageJ软件对肌纤维群体进行自动定量分析。具体而言，将包埋的骨骼肌组织切成横切片，使用针对肌球蛋白重链的抗体、荧光标记的二抗以及DAPI（用于细胞核染色）进行染色。随后，利用载片扫描仪自动扫描整个横切面，获得整个样本的高分辨率复合图像。接着，通过ImageJ的自动化宏程序对慢速、中间型和快速肌纤维进行群体分析与定量。我们先前已证实，该方法对肌纤维群体的识别可靠性可达±4%以内。此外，该方法利用开源平台ImageJ，显著降低了不同操作者之间的变异性和每次分析所需的时间。
引言
骨骼肌组成在生理性过程（如衰老1,2、运动3,4,5,6,7）或病理性过程（如疾病8,9,10或创伤11）中会发生显著变化。因此，多个研究领域致力于探究这些过程对肌肉结构的影响，以理解其功能改变。决定肌肉功能的关键因素之一是肌纤维的组成。肌纤维表达不同类型的肌球蛋白重链（MHC）蛋白，据此可分为慢肌纤维、中间型纤维或快肌纤维7,12,13,14,15,16,17。从生理学角度看，不同部位的肌肉因其在体内的功能差异而具有不同的肌纤维组成。通过肌纤维分型技术，可对各类肌纤维的数量进行定量分析，从而识别其对生理或病理生理过程的适应性改变7,17。传统上，曾采用多种耗时的方法来区分肌纤维类型。这些方法通常依据肌球蛋白ATP酶在不同pH条件下的反应活性或肌肉酶活性对肌纤维进行分类。由于单个切片无法评估所有类型的纤维特征，因此需要多个横切面样本，以便识别全部肌纤维并进行人工定量分析14,16,17,18,19,20,21,22。相比之下，近年来的研究采用针对肌球蛋白重链蛋白的免疫组织化学（IHC）方法，可在单个横切面上快速染色多种肌纤维类型。由于该方法具有显著优势，目前已被视为肌纤维群体分析的金标准19,23,24。通过优化的IHC染色方案，我们近期已证明，利用开源平台ImageJ可实现整块肌肉横切面的全自动图像采集及随后的肌纤维自动定量分析。与人工定量相比，该方法将每张切片的分析时间显著缩短至人工分析的约10%，同时保持了±4%的准确度25。
本方法的总体目标是介绍一种快速、可靠且不依赖操作者的指南，用于在开源平台上自动量化整块大鼠肌肉中的肌纤维。此外，我们还描述了可能的改进方案，以便将该方法应用于其他样本，如小鼠或人类肌肉。
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方案
所有涉及动物受试者的操作均遵循FELASA推荐的实验室动物护理原则26。在研究开始前，已获得维也纳医科大学伦理审查委员会和奥地利科研部（BMWF：Bundesministerium fuer Wissenschaft und Forschung，编号：BMWF-66.009/0222-WF/II/3b/2014）的批准。
1. 肌肉组织采集
注意：Meng et al.27 之前发表的一项研究详细描述了肌肉样本的正确冷冻方法。
- 在动物安乐死后立即获取完整的肌肉或足以获得完整横截面的组织。
- 从麻醉或已处死的大鼠中取出整个肌肉。使用镊子和剪刀去除肌肉周围的所有结缔组织和肌腱。麻醉或安乐死操作应遵循FELASA的国际指南28。
- 使用校准的精密天平称量肌肉。此快速步骤可实现肌肉样本之间的比较分析，尤其适用于干预性操作后的分析。
- 将肌肉放入容器中，根据肌肉大小完全浸没于O.C.T. 包埋剂中，四周预留约1 mm的安全边缘（例如，铝箔制成的容器）。
- 将异戊烷预先用液氮冷却约2分钟，然后将肌肉在其中快速冷冻。异戊烷底部应开始出现白色结晶。
注意：此步骤对保持肌肉的正确结构至关重要，从而确保后续染色和肌纤维分析的准确性27。 - 将保存在O.C.T. 中的样本在-80 °C下至少保存24小时。然而，若冷却条件适当，样本可在-80 °C下保存数月甚至数年。
- 使用冷冻切片机在-20 °C下从肌肉中段切取10 µm厚的横切片。若无法实现10 µm切片，可每次增加2 µm厚度，最大不超过20 µm。此步骤必须使用足够锋利的刀片。
- 通过将载玻片靠近横切面的方式将切片转移至防脱载玻片上。横切面将自动粘附于载玻片上。染色前需将载玻片在-20 °C下过夜保存。
2. 染色
注意：可获得的抗肌球蛋白重链蛋白的抗体种类繁多；然而，高质量的抗体对于自动化的图像采集与分析至关重要。有关抗体的稀释比例及抗体信息，请参见 表1. 有关用于计算正确稀释度并查看所需溶液量的电子表格文件，请参见 补充文件 1.
- 在染色前将冷冻肌肉切片解冻并空气干燥 10 分钟。
- 用含 0.05% Triton X 的磷酸盐缓冲液（PBS）小心清洗切片，先洗 10 分钟，再洗 5 分钟。Triton 可显著改善染色质量。详见讨论部分。
- 让切片空气干燥 2 分钟，并使用疏水笔在每张载玻片上圈出各个横切面（以减少抗体使用量），再额外干燥 15 分钟。
- 用含 10% 山羊血清的 PBST（PBS + 0.05% Triton X）在室温下封闭所有载玻片 1 小时。
- 将所有一抗（表 1）用含 10% 山羊血清的 PBST（PBS + 0.05% Triton X）配制成混合抗体溶液。使用前充分混匀。Triton X 对实现整个横切面的均匀染色至关重要。每张横切面约需 30 µL 一抗混合液。
- 在步骤 2.7–2.13 中，需充分避光。调暗室内灯光并使用加盖的染色盒可提供足够的保护。此外，染色盒底部应加入液体以保持染色过程中的湿润环境，防止切片干燥。
- 将一抗混合液（表 1）加入载玻片，在室温下的湿润染色盒中孵育 1 小时。
- 用含 0.05% Triton X 的 PBS 洗涤载玻片 10 分钟，再用新鲜 PBST 洗涤 5 分钟。
- 将二抗用含 10% 山羊血清的 PBST（PBS + 0.05% Triton X）配制成混合液。每张横切面计算使用 30 µL 二抗混合液。
- 将二抗混合液加入载玻片，孵育 1 小时。
- 用 PBST（PBS + 0.05% Triton X）洗涤载玻片 10 分钟，再用新鲜 PBST 洗涤 5 分钟。
- 加入 DAPI 核染色试剂盒（建议使用即用型溶液）染色 15 分钟，或按照制造商说明操作，以标记细胞核。
- 用 PBST（PBS + 0.05% Triton X）短暂洗涤载玻片 1 分钟。随后让载玻片短暂空气干燥。
- 加入荧光封片剂并加盖盖玻片。4 °C 避光保存，并在 24–48 小时内完成成像为佳。
3. 显微镜观察
- 将载玻片装入切片扫描仪。根据切片扫描仪的不同，最多可装载12张载玻片。
- 创建一个新项目。预览时使用DAPI通道和2.5倍物镜；详细分析时使用DAPI、GFP、FITC和Cy5通道以及20倍物镜。在整个项目中，通过DAPI通道实现自动对焦。
- 为每个通道设置如下颜色：DAPI—蓝色，FITC—绿色，Texas Red—红色，Cy5—黄色。
- 使用DAPI通道创建每张载玻片的预览图像。为此，对第一个样本进行手动对焦，并在后续预览分析中沿用该对焦设置，以获取所有样本的预览图像。
- 勾画出需要进行详细采集的每个横截面区域。勾画时避免靠近样本边缘，以确保完整捕获整个目标区域。
- 为每个通道设置曝光时间。大多数情况下，不同通道的曝光参数在所有横截面上保持一致。
- 运行自动图像采集。检查前几个视野的采集情况，以便在自动采集过程早期发现并防止错误采集。
- 如有需要，可通过桌面镜像软件建立远程控制。该方法可通过任何网络或互联网连接，将切片扫描仪所连接计算机的屏幕镜像至另一台计算机，实现对图像采集过程的远程监控。尽管无法对实际载玻片的物理设置进行更改，但图像采集软件的虚拟环境允许监控图像的对焦是否正确或曝光时间是否合适。此外，可定期查看预计完成时间。
- 图像采集完成后，通过手动检查所有图像中肌纤维结构、单个肌纤维及不同类型肌纤维是否可分辨，来确认自动对焦是否正确。
- 对对焦不正确的图像区域重新采集，包括单个视野或整个目标区域。如需重新采集局部区域，可在整个项目中标记相应区域或图像，并使用手动对焦重新采集。大多数情况下，额外的图像细节在不同焦平面上会导致图像对焦错误。
- 对于拟纳入最终分析的每个横截面，将各通道（不包括DAPI）分别导出为独立的jpeg文件。根据通道命名并分类存储文件，文件夹命名为Texas Red、FITC和Cy5。
4. 肌纤维自动分析
注意：该宏可通过以下网页获取：https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/
- 在分析前使用常规图像编辑软件预览每张图像，并检查染色肌纤维与背景之间的对比度是否足够。如有必要，使用亮度和对比度调整命令调节图像的亮度和对比度，以增强差异。
- 打开 ImageJ 或 Fiji。使用“Plugins - Macros - Edit”命令打开宏，这将显示宏的源代码，并允许快速调整参数。如有必要，在宏的源代码中修改每个通道的文件夹目录。
注意：肌纤维分析的参数值基于大鼠肱二头肌和蚓状肌，其他物种或肌肉可能需要不同的参数值。 - 使用“run”命令启动宏。文件夹中的所有图像将被依次加载到宏中并进行定量分析。结果将在一个新窗口中显示。此步骤所需时间从数秒到数小时不等，具体取决于待分析数据量的大小。
- 将结果窗口导出为电子表格文件。识别被正确定量的 Cy5（慢肌）、FITC（中间型）和 Texas Red（快肌）纤维数值，并加总得到总纤维数量。
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结果
采用免疫组织化学方法快速染色大鼠完整肌肉横切面，以鉴定MHC I、IIA和IIB型肌纤维。利用荧光显微镜载玻片扫描仪，自动获取整个横切面图像，随后使用ImageJ进行肌纤维的自动化分析。该实验流程的设计理念在于提供一种简单、可靠且高效的肌纤维定量工作流程。
该实验流程（图1）首先按照Meng et al.27先前教程中所述的方法，正确取材并冷冻肌肉样本，这对于获得良好的染色质量至关重要。下一步，使用针对I型、IIA型和IIB型肌球蛋白重链蛋白的一抗以及相应的荧光二抗对肌肉样本进行切片和染色。为获得最佳染色效果，二抗的浓度采用厂家推荐浓度的两倍，并在抗体混合液中加入Triton X，以确保染色均匀。肌肉纤维的免疫荧光染色快速且交叉反应较少，在本实验设置中，每批最多26张切片约需5小时即可完成。所得图像中阳性纤维与周围组织对比度高，不同类型纤维之间区分明显（...
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讨论
本文展示了一种广泛适用的方法，可高效地通过免疫组织化学技术对大鼠肌肉横切面的肌纤维群体进行研究和自动量化。为确保实验可重复性，我们提供了详细的分步操作说明，并提出了适用于本研究未涉及的其他物种的潜在改进方案。此外，我们还讨论了该方法的优势、实现最佳效果所需的先决条件及其局限性。
目前，已有多种染色方法可用于鉴定肌纤维类型，同时也有多种方法被用于肌纤维的手动或半自动定量分析17。然而，尚无任何方案将两者结合，描述一种标准化的方法，以可靠地染色肌纤维类型，并利用免费的分析软件自动获取和定量肌纤维。基于先前的研究24,29，我们优化了现有的肌球蛋白重链免疫组织化学染色流程，用于对小鼠肌肉横切面上的肌纤维类型进行自动化分析。最近，我们已证明，对整个横切面进行自动化分析是可行的，与手动分析相比具有可靠性，且更节省时间27。此外，该方法不受操作者影响，从而减少了人为误差，能够在不同处...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由Christian Doppler研究基金会资助。我们感谢奥地利维也纳医科大学影像核心设施的Sabine Rauscher在整个项目过程中提供的支持。一抗由Schiaffino, S.研发，来源于美国国立卫生研究院（NIH）下属国立儿童健康与人类发育研究所（NICHD）创建、现由爱荷华大学生物系（爱荷华城，IA）维护的发育研究杂交瘤库。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| O.C.T. 化合物 | Tissue-Tek, Sakura, 荷兰 | 用于肌肉组织包埋 | |
| 异戊烷 | 用于肌肉组织的充分冷冻 | ||
| Superfrost Ultra Plus 载玻片 | Thermo Scientific, 德国 | 1014356190 | 粘附性载玻片 |
| 磷酸盐缓冲液 | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, 德国 | 85112 | 去垢剂溶液 |
| 山羊血清 | Thermo Scientific, 德国 | 50197Z | 山羊血清 |
| DAKO 荧光封片剂 | Dako 丹麦 | S3023 | |
| Dako 笔 | Dako 丹麦 | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, 维也纳, 奥地利 | ||
| 一抗 | |||
| MHC-I（货号：BA-F8，RRID: AB_10572253） | 发育研究杂交瘤库（DSHB, 爱荷华, 美国） | 上清液 | |
| MHC-IIa（货号：SC-71，RRID: AB_2147165） | 发育研究杂交瘤库（DSHB, 爱荷华, 美国） | 上清液 | |
| MHC-IIb（货号：BF-F3，RRID: AB_2266724） | 发育研究杂交瘤库（DSHB, 爱荷华, 美国） | 上清液 | |
| 二抗 | |||
| Alexa Fluor 633 山羊抗小鼠 IgG2b | Thermo Scientific, 德国 | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, 德国 | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠 IgM (µ 链) | Thermo Scientific, 德国 | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes 试剂 | Thermo Scientific, 德国 | R37606 |
参考文献
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