本文介绍了一种快速肌纤维分析方案，该方法可提高染色质量，从而利用免费软件 ImageJ 实现肌纤维群体的自动采集与定量分析。
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本文内容
摘要
摘要
对肌纤维群体进行定量分析可更深入地揭示疾病、创伤及各种其他因素对骨骼肌组成的影响。传统上，多个研究领域常采用多种耗时的方法来研究肌纤维群体。然而，近年来发展的基于肌球蛋白重链蛋白表达的免疫组织化学方法，为在单个切片中快速鉴定多种肌纤维类型提供了替代方案。本文介绍了一种快速、可靠且可重复的染色优化方案，可实现整个横切面的自动采集以及利用ImageJ软件对肌纤维群体进行自动定量分析。具体而言，将包埋的骨骼肌组织切成横切片，使用针对肌球蛋白重链的抗体、荧光标记的二抗以及DAPI（用于细胞核染色）进行染色。随后，利用载片扫描仪自动扫描整个横切面，获得整个样本的高分辨率复合图像。接着，通过ImageJ的自动化宏程序对慢速、中间型和快速肌纤维进行群体分析与定量。我们先前已证实，该方法对肌纤维群体的识别可靠性可达±4%以内。此外，该方法利用开源平台ImageJ，显著降低了不同操作者之间的变异性和每次分析所需的时间。
引言
骨骼肌组成在生理性过程（如衰老1,2、运动3,4,5,6,7）或病理性过程（如疾病8,9,10或创伤11）中会发生显著变化。因此，多个研究领域致力于探究这些过程对肌肉结构的影响，以理解其功能改变。决定肌肉功能的关键因素之一是肌纤维的组成。肌纤维表达不同类型的肌球蛋白重链（MHC）蛋白，据此可分为慢肌纤维、中间型纤维或快肌纤维7,12,13,14,15<....
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方案
所有涉及动物受试者的操作均遵循FELASA推荐的实验室动物护理原则26。在研究开始前，已获得维也纳医科大学伦理审查委员会和奥地利科研部（BMWF：Bundesministerium fuer Wissenschaft und Forschung，编号：BMWF-66.009/0222-WF/II/3b/2014）的批准。
1. 肌肉组织采集
注意：Meng et al.27 之前发表的一项研究详细描述了肌肉样本的正确冷冻方法。
- 在动物安乐死后立即获取完整的肌肉或足以获得完整横截面的组织。
- 从麻醉或已处死的大鼠中取出整个肌肉。使用镊子和剪刀去除肌肉周围的所有结缔组织和肌腱。麻醉或安乐死操作应遵循FELASA的国际指南28。
- 使用校准的精密天平称量肌肉。此快速步骤可实现肌肉样本之间的比较分析，尤其适用于干预性操作后的分析。
- 将肌肉放入容器中，根据肌肉大小完全浸没于O.C.T. 包埋剂中，四周预留约1 mm的安全边缘（例如，铝箔制成的容器）。
- 将异戊烷预先用液氮冷却约2分钟，然后将肌肉在其中快速冷冻。异戊烷底部应开始出现白色....
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结果
采用免疫组织化学方法对大鼠完整肌肉横切面进行快速染色，以鉴定MHC I、IIA和IIB型肌纤维。利用荧光显微镜载玻片扫描仪，自动获取整个横切面图像，随后使用ImageJ进行肌纤维的自动化分析。该实验流程的设计理念在于提供一种简单、可靠且高效的肌纤维定量工作流程。
该操作流程的工作流程（图1) 始于肌肉样本的正确取下与冷冻，具体步骤如 Meng 之前发表的教程所述 等27这对于获得良好的染色质量至关重要。下一步，使用针对肌球蛋白重链蛋白I型、IIA型和IIB型的一抗以及相应的荧光二抗对肌肉样本进行切片和染色。为了达到最佳染色效果，二抗的浓度采用厂商推荐浓度的两倍，并在抗体混合液中加入Triton X，以确保染色均匀。在本实验体系中，肌肉纤维的免疫荧光染色快速且交叉反应较少，每批最多26张载玻片的样本约需5小时即可完成。所得图像显示阳性纤维与周围组织之间具有.......
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讨论
本文展示了一种广泛适用的方法，可高效地通过免疫组织化学技术对大鼠肌肉横切面的肌纤维群体进行研究和自动量化。为确保实验可重复性，我们提供了详细的分步操作说明，并提出了适用于本研究未涉及的其他物种的潜在改进方案。此外，我们还讨论了该方法的优势、实现最佳效果所需的先决条件及其局限性。
目前，已有多种染色方法可用于鉴定肌纤维类型，同时也有多种方法被用于肌纤维的手动或半自动定量分析17。然而，尚无任何方案将两者结合，描述一种标准化的方法，以可靠地染色肌纤维类型，并利用免费的分析软件自动获取和定量肌纤维。基于先前的研究24,29，我们优化了现有的肌球蛋白重链免疫组织化学染色流程，用于对小鼠肌肉横切面上的肌纤维类型进行自动化分析。最近，我们已证明，对整个横切面进行自动化分析是可行的，与手动分析相比具有可靠性，且更节省时间27。此外，该方法不受操作者影响，从而减少了人为误差，能够在不同处.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由Christian Doppler研究基金会资助。我们感谢奥地利维也纳医科大学影像核心设施的Sabine Rauscher在整个项目过程中提供的支持。一抗由Schiaffino, S.研发，来源于美国国立卫生研究院（NIH）下属国立儿童健康与人类发育研究所（NICHD）创建、现由爱荷华大学生物系（爱荷华城，IA）维护的发育研究杂交瘤库。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| O.C.T. 化合物 | Tissue-Tek, Sakura, 荷兰 | 用于肌肉组织包埋 | |
| 异戊烷 | 用于肌肉组织的充分冷冻 | ||
| Superfrost Ultra Plus 载玻片 | Thermo Scientific, 德国 | 1014356190 | 粘附性载玻片 |
| 磷酸盐缓冲液 | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, 德国 | 85112 | 去垢剂溶液 |
| 山羊血清 | Thermo Scientific, 德国 | 50197Z | 山羊血清 |
| DAKO 荧光封片剂 | Dako 丹麦 | S3023 | |
| Dako 笔 | Dako 丹麦 | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, 维也纳, 奥地利 | ||
| 一抗 | |||
| MHC-I（货号：BA-F8，RRID: AB_10572253） | 发育研究杂交瘤库（DSHB, 爱荷华, 美国） | 上清液 | |
| MHC-IIa（货号：SC-71，RRID: AB_2147165） | 发育研究杂交瘤库（DSHB, 爱荷华, 美国） | 上清液 | |
| MHC-IIb（货号：BF-F3，RRID: AB_2266724） | 发育研究杂交瘤库（DSHB, 爱荷华, 美国） | 上清液 | |
| 二抗 | |||
| Alexa Fluor 633 山羊抗小鼠 IgG2b | Thermo Scientific, 德国 | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, 德国 | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠 IgM (µ 链) | Thermo Scientific, 德国 | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes 试剂 | Thermo Scientific, 德国 | R37606 |
参考文献
- Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
- Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of....
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