时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱法用于研究蛋白质结构与动力学

摘要

构象柔性在蛋白质功能中起着关键作用。本文介绍了将时间分辨电喷雾电离质谱与氢-氘交换相结合，用于研究有序和无序蛋白质中驱动功能的快速结构变化。

摘要

由于缺乏稳定的二级结构元件，内在无序蛋白（IDP）长期以来一直对结构生物学家构成挑战。在快速时间尺度上测量的氢-氘交换（HDX）能够特异性地检测短暂存在的结构和氢键网络，从而实现对天然构象集合中瞬时构象体的表征。将HDX与质谱技术联用具有多项关键优势，包括高灵敏度、样品消耗量低以及对蛋白质大小无限制。该技术在过去几十年中取得了显著进展，现已能够监测毫秒时间尺度的HDX标记过程。此外，通过将HDX工作流程整合到包含酸性蛋白酶微反应器的微流控平台上，我们能够在肽段水平上定位蛋白质的动态特性。在本研究中，将时间分辨电喷雾电离质谱（TRESI-MS）与HDX联用，用于深入解析tau蛋白中的残余结构及其在过度磷酸化后所诱导的构象变化。

引言

在过去的几十年中，用于测定蛋白质结构和动力学的分析技术取得了显著进展^1,2,3,4。尽管X射线晶体学仍是确定蛋白质结构的主要工具，但该方法需要高浓度的蛋白质，并且需要进行大量优化以获得可用于衍射的晶体。对于难以结晶的蛋白质（如膜相关蛋白和内在无序蛋白），传统上采用氢-氘交换（HDX）核磁共振（NMR）进行研究⁵。然而，在最近几十年中，将电喷雾电离质谱（ESI-MS）与HDX联用的技术迅速得到广泛应用^6,7。

质谱技术为克服X射线晶体学和核磁共振所面临诸多限制提供了解决方案。特别是，质谱具有高度灵敏性（所需浓度为nM至µM级别），且对蛋白质分子大小几乎无限制。此外，质谱分析的高占空比使得研究蛋白质在酶促转化、错误折叠、复合物形成及其他生物学相关过程中的动态变化成为可能。这些过程通常发生在毫秒到秒的时间尺度上，因此在分析前需要实现试剂的快速混合。

Wilson 和 Konermann 于 2003 年开发的时....

方案

注意：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。激光烧蚀聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）产生的烟雾可能具有毒性。务必确保激光雕刻机连接至正常工作的通风系统。在构建微流控装置时，应采取所有适当的安全措施，包括使用工程控制措施（通风橱、锐器容器）和个人防护装备（护目镜、口罩、手套、实验服、长裤、封闭式鞋）。在分析过程中为减少干扰性污染物，应尽可能使用高效液相色谱（HPLC）级试剂，所有试剂均应为美国化学会（ACS）级或更高纯度。

1. 微流控装置的制备

1. PMMA微流控平台的构建
   1. 取一块标准的PMMA块（8.9 × 3.8 × 0.6 cm），使用激光雕刻机在上面激光烧蚀出用于引入试剂的进样通道、蛋白水解室以及出样通道^17,18。
      注意：蛋白水解室应蚀刻为细长的椭圆形（30 × 5 × 0.05 mm）。进样和出样通道必须延伸至PMMA块的末端，且宽度和深度均不得超过75 µm，以便适配30号毛细管。
   2. 使用带有1/64"厚切割片的旋转工具，将一根30号不锈钢金属毛细管切成两段，每段长约10 cm。使用砂纸打磨毛细管末端（可在光学显微镜下观察以辅助操作）。
   3. 使用电烙铁将毛细管熔融固定至刻蚀好的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）块中。进样通道将连接自动注射泵....

结果

天然 tau 蛋白与磷酸化 tau 蛋白的消化谱相似，序列覆盖度分别为 77.1% 和 71.7%。通过使用实验室自主开发的 FORTRAN 软件生成的理论同位素分布，拟合实验观测到的同位素分布，从而确定各肽段的氘代摄取值。最佳拟合分布如图所示（图 3a），并附有相应的氘代摄取值。随后生成摄取动力学曲线，并以单指数方程进行良好描述。对在三个或更多标记时间点（n = 3）被检测到的所有肽段的动力学曲线进行分析。这些对观测摄取值的单指数拟合得到了每个肽段的交换速率常数 k_obs。该值与基于一级序列的“随机线圈”本征速率常数 k_int 进行比较。在 1.52 秒时计算得到的保护因子 PF（k_int / k_obs）被映射到天然态和过度磷酸化 tau 蛋白的代表性结构上（图 4）。

讨论

尽管X射线晶体学和核磁共振（NMR）等结构生物学方法能够提供蛋白质的极为详细的结构信息，但这些图像通常是静态的。当使用这些传统方法研究瞬时物种和弱结构化结构域时，仍难以实现有效表征。因此，为了获得此类系统的动态信息，必须在快速的时间尺度上开展研究。我们已成功应用TRESI-HDX-MS技术，在肽段局部水平上深入揭示了一种被广泛研究的固有无序蛋白（IDP）所发生的构象变化。该技术的一个关键局限在于，胃蛋白酶是一种非特异性蛋白酶，单独使用时通常难以实现完整的序列覆盖。一种提高序列覆盖度和特异性的方法是将Aspergillus saitoi来源的蛋白酶XIII型引入消化室²⁶。

在整个实验过程中，必须将消化室的 pH 值保持在 2.4，以有效终止交换反应并减少回交换量¹¹。任何蛋白水解步骤及后续分析都必须尽快完成。以往的研究已优化了消化室的尺寸，并提出了相应的流速建议，以确保在室温下回交换水平降至可忽略的程度（≤5%）²²。强烈.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）	Professional Plastics	SACR.250CCP	8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm
熔融石英玻璃毛细管	Polymicro Technologies	106815-0018	内径：75 µm，外径：150 µm
金属毛细管	McMaster-Carr	28 ga – 89875K97 30 ga  - 89875K99
氟化乙烯丙烯（FEP）管	IDEX	1477 1548	内径：0.007”，外径：1/16” 内径：0.020”，外径：1/16”
标准聚合物管切割器	IDEX	A-327	适用于外径为1/16” 和 1/8” 的管材
微型静态混合三通接头	IDEX	M-540	适用于外径为1/16” 的管材
或
不锈钢三通接头，孔径0.25 mm	Valco Instruments Co., Inc. (VICI)	ZT1C	适用于外径为1/16” 的管材
适用于外径1/16” 管材的PEEK三通接头	IDEX	P-727
10-32 雌接头至雌鲁尔接头	IDEX	P-659
10-32 PEEK双翼螺母	IDEX	F-300
适用于外径1/16” 管材的卡套	IDEX	F-142
100系列旋转工具	Dremel	F013010001
切割片	Jobmate		厚度1/64”
Stereomaster数字变焦显微镜	Fisher Scientific	12-563-411
电烙铁	Mastercraft	58-6301-2
VersaLaser	Universal Laser
注射器	Hamilton	81220	容量500 µL
注射泵	Harvard Apparatus	70-4501
名称	公司	目录编号	备注
试剂
NHS活化琼脂糖	Fisher Scientific	26196
来自猪胃黏膜的胃蛋白酶	Sigma-Aldrich	P6887-250MG
重水	Sigma-Aldrich	151882-10X0.6ML
乙酸	Sigma-Aldrich	695092-100ML
色谱纯水	Fisher Scientific	W5-4
乙酸铵	Sigma-Aldrich	A7330-500G
磷酸钠	Fisher Scientific	S369-500
氯化钠	Fisher Scientific	S671-3
名称	公司	目录编号	备注
软件/在线工具
CorelDraw X3	Corel
分子量计算器		版本 6.49	开源质谱工具
mMass		版本 5.5.0	开源质谱工具
ExPASy FindPept	瑞士生物信息学研究所
SigmaPlot	Systat Software	版本 11.0
PyMOL	Schrödinger	版本 1.5.0.4
名称	公司	目录编号	备注
仪器
QStar Elite 混合型 Q-TOF 质谱仪	AB SCIEX