本文所述方法可通过非侵入性生物发光成像（BLI）技术，对小鼠肺部由IL-8启动子依赖性炎症激活进行可视化观察。在递送荧光素酶报告载体后，同一动物可在长达两个月的时间内多次接受BLI检测。
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方法文章
一种白细胞介素-8瞬时转基因小鼠模型用于 体内 长期监测炎症反应
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
气道炎症常与细菌感染相关，是肺部疾病的重要决定因素。 体内 确定各种因素的促炎能力具有挑战性，需要进行终末性操作，例如支气管肺泡灌洗以及肺组织的摘除 原位 分析，从而无法在同一只小鼠中进行纵向观察。此处通过气管内灌注诱导肺部炎症 铜绿假单胞菌 在瞬时转基因小鼠中，于异源牛IL-8启动子调控下表达荧光素酶报告基因，收集其培养上清液（SN）。通过检测肺部荧光素酶的表达水平进行监测。 体内 在滴注后的2.5至48小时时间范围内进行生物发光成像（BLI）分析。该操作可在2至3个月内重复多次，从而可在无需处死动物的情况下对同一小鼠的炎症反应进行评估。该方法可实现实时监测肺部发挥促炎和抗炎作用的因子，适用于功能学及药理学研究。
引言
慢性肺部疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、囊性纤维化（CF）和支气管扩张症，其特征是气道炎症。气道炎症表现为水肿、细胞浸润、T淋巴细胞和肥大细胞活化、气道分泌物增加以及胶原过度沉积。囊性纤维化是一种多系统疾病，其发病和死亡的主要原因是肺部细菌感染，并伴随肺部急性加重的逐渐增多。肺功能的下降预示着显著更差的临床预后1,2,3,4。
呼吸道的炎症状态通常通过评估来自下呼吸道和上呼吸道样本（如痰液）中炎症过程中募集的免疫学标志物来观察，但结果存在可变性。此外，也可进行支气管镜检查5小鼠模型是研究以气道炎症为特征、且尚无有效治疗方法或治愈手段的疾病发病机制和演变过程的重要工具。肺部感染和炎症的动物模型已被用于研究哮喘以及宿主与病原体之间的相互作用，包括模拟人类疾病状态的化学物质的作用（例如， 香烟烟雾暴露，LPS，弹性蛋白酶，卵清蛋白，聚肌胞苷酸 等等。，以及上述方法的组合6测量炎症相关参数需要处死动物，因为必须采用侵入性方法来检测肺部细菌载量、细胞因子水平以及收集支气管肺泡灌洗（BAL）液....
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方案
所有所述动物实验均经维罗纳大学跨部门实验研究中心内部动物福利委员会批准，并符合欧盟指令2010/63/EU、意大利D.Lgs 26/2014以及《实验动物护理和使用指南》（华盛顿特区：国家科学院出版社，1996年修订版）。本方案及实验已获国家卫生研究院批准（编号273/15）。动物可自由获取标准啮齿类动物饲料和软化自来水，在任何处理前至少适应本地动物房环境5天（室温：20 - 24 °C；相对湿度：40 - 70%；光照-黑暗循环：12小时）。
1. 体内 基因递送
- 使用层流罩制备 体内 递送试剂/核酸复合物。
- 根据生产商提供的 体内 操作说明，确定实验方案和参数。
- 每只小鼠注射总体积为 200 µL 的复合物。
- 起始使用 40 µg 溶于无内毒素水中的 DNA；优化范围可达到 60 µg。
注意：根据生产商说明，注射体积中核酸的最终浓度不得超过 0.5 µg/µL。 - 使用 N/P 比值为 6 - 8（每 µg 核酸使用 0.12 - 0.16 µL 递送试剂）。计算相应体积的递送试剂。
注意：复合物应带正电荷，以实现有效的细胞摄取。N/P 比值定义为 体内 递送试剂中每个核酸磷酸基团（P）所对应的氮残基数（N），代表复合物内部的离子平衡程度。
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结果
bIL-8-Luc 瞬时转基因小鼠模型被用于 体内 监测用含分泌性毒力因子的浓缩细菌上清液（30倍浓度）攻击后小鼠的肺部炎症。所诱导的炎症反应可通过以下方法检测： 体内 成像表现为BLI信号增强。促炎活性在滴注后2.5小时即可明显检测到，尽管BLI信号在5至24小时之间达到最高峰值，并在48小时时仍可检测到（图3).
图3：代表性 体内 由肺部炎症成像 P. aeruginosa IL-8 瞬时转基因.......
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讨论
在之前的一项研究中11，已显示出bIL-8-Luc依赖性BLI与BAL标志物之间的差异，该差异依赖于不同小鼠品系间敏感性的不同程度12。因此，将bIL-8-Luc模型首次应用于另一种小鼠品系时，需要对炎症反应进行初步研究，包括BLI以及更为标准化的炎症标志物两方面。
小鼠转染可引起轻度肺部炎症及bIL-8-Luc的激活，该信号可通过生物发光成像（BLI）在DNA注射后3至4天内检测到。图41 周后完全消失1基因递送后，应始终通过检测 bIL-8-Luc 的表达来验证 体内 BLI，因为这是后续实验步骤成功所必需的条件。在转染7天后且对小鼠进行攻击前，应记录基线激活信号，以确认转染诱导的炎症已消失。
该方法已在炎症急性期进行过测试，但尚未在慢性期中得到验证。目前尚不清楚活体微生物攻击对此实验体系中所用启动子活性的影响。深入了解急性和慢性.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由意大利囊性纤维化基金会项目 FFC#18/2013、FFC#29/2015 以及意大利囊性纤维化联盟通过威尼托分会—威尼托抗囊性纤维化协会（Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FMT 2500 荧光断层成像系统 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II 前临床 In Vivo 成像系统 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | 避光保存，探针储存于 4 °C |
| 雌性近交系 BalbC 小鼠 | Harlan Laboratories Italy | 使用前，动物需在本地动物房条件下适应至少 5 天 | |
| bIL-8-Luc 质粒 | 意大利帕尔马大学医学兽医科学系 | 质粒储存于 -20 °C | |
| pGL3basic 载体 | Promega | E1751 | 载体储存于 -20 °C |
| JetPEI DNA 转染试剂 | Polyplus transfection | 201B-001G | DNA 与 JetPEI 混合物的最终 N/P 比为 7 |
| D-荧光素钾盐 1 g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | 避光保存，储存于 -20 °C |
| Living Image 软件 | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| 异氟烷 | ESTEVE spa | 571329.8 | 避免吸入 |
| Bio-Plex 细胞因子检测试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | 未开封试剂盒储存于 4 °C |
| 自动细胞计数仪 | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century DP-4M 型干粉吹入器 | Penn-century | DPM-EXT | |
| 气体麻醉系统 XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 微型医用导管 | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| 5 mL 无针头注射器 | Terumo | SS*05SE1 | 用剪刀剪去活塞的边缘 |
| Hamilton 0.10 mL（型号 1710） | Gastight | 81022 | |
| Discofix 三通旋塞阀 | Braun | 4095111 | |
| 1 mL 带针头注射器 | Pic solution | 3,071,260,300,320 | 使用时去除针头 |
| 塑料饲管 18ga × 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | 将管尖斜向剪切 |
参考文献
- Barnes, P. J. Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes. J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).
- Cohen-Cymberknoh, M., Kerem, E., Ferkol, T., Elizur, A. Airway inflammation in cysti....
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重印与许可
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