本文所述方法可通过非侵入性生物发光成像（BLI）技术，对小鼠肺部由IL-8启动子依赖性炎症激活进行可视化观察。在递送荧光素酶报告载体后，同一动物可在长达两个月的时间内多次接受BLI检测。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
一种白细胞介素-8瞬时转基因小鼠模型用于 体内 长期监测炎症反应
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
气道炎症常与细菌感染相关，是肺部疾病的重要决定因素。 体内 确定各种因素的促炎能力具有挑战性，需要进行终末性操作，例如支气管肺泡灌洗以及肺组织的摘除 原位 分析，从而无法在同一只小鼠中进行纵向观察。此处通过气管内灌注诱导肺部炎症 铜绿假单胞菌 在瞬时转基因小鼠中，于异源牛IL-8启动子调控下表达荧光素酶报告基因，收集其培养上清液（SN）。通过检测肺部荧光素酶的表达水平进行监测。 体内 在滴注后的2.5至48小时时间范围内进行生物发光成像（BLI）分析。该操作可在2至3个月内重复多次，从而可在无需处死动物的情况下对同一小鼠的炎症反应进行评估。该方法可实现实时监测肺部发挥促炎和抗炎作用的因子，适用于功能学及药理学研究。
引言
慢性肺部疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、囊性纤维化（CF）和支气管扩张症，其特征是气道炎症。气道炎症表现为水肿、细胞浸润、T淋巴细胞和肥大细胞活化、气道分泌物增加以及胶原过度沉积。囊性纤维化是一种多系统疾病，其发病和死亡的主要原因是肺部细菌感染，并伴随肺部急性加重的逐渐增多。肺功能的下降预示着显著更差的临床预后1,2,3,4。
呼吸道的炎症状态通常通过评估来自下呼吸道和上呼吸道样本（如痰液）中炎症过程中募集的免疫学标志物来观察，但结果存在可变性。此外，也可进行支气管镜检查5小鼠模型是研究以气道炎症为特征、且尚无有效治疗方法或治愈手段的疾病发病机制和演变过程的重要工具。肺部感染和炎症的动物模型已被用于研究哮喘以及宿主与病原体之间的相互作用，包括模拟人类疾病状态的化学物质的作用（例如， 香烟烟雾暴露，LPS，弹性蛋白酶，卵清蛋白，聚肌胞苷酸 等等。，以及上述方法的组合6测量炎症相关参数需要处死动物，因为必须采用侵入性方法来检测肺部细菌载量、细胞因子水平以及收集支气管肺泡灌洗（BAL）液。此外，通常还需进行组织学检查。若要获取炎症反应动力学的信息，则需要使用大量小鼠。因此，一种无需处死动物即可获得此类信息的技术，在技术、伦理、经济和操作层面均具有重要价值。
IL-8 在炎症过程中发挥关键作用，可招募白细胞至炎症组织，是研究炎症通路激活的分子读出指标。MIP-2 和 KC 可能是小鼠体内人源 IL-8 的功能同源物。小鼠仅表达一种潜在的 IL-8 受体，即人源 CXCR2 的同源物7,8，但其能够调控异源 IL-8 基因启动子驱动的报告基因。近期在发现牛源 IL-8 启动子/荧光素酶报告基因构建体可在小鼠体内发生转激活后，建立了一种肺部炎症小鼠模型。该特性使得可利用生物发光成像（BLI）在活体动物中监测炎症反应9。
该模型已用于研究由细菌外毒素（例如，脂多糖（LPS）或细菌菌株释放的产物）或TNFalpha10,11引发的炎症反应。药物研发的重点在于开发和优化新老抗炎分子，以治疗囊性纤维化（CF）、哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等肺部疾病。为了推动智能化临床试验的设计，这些新化学实体必须能够在动物模型中快速、便捷地进行测试，并与特定的临床表型相关联。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有所述动物实验均经维罗纳大学跨部门实验研究中心内部动物福利委员会批准，并符合欧盟指令2010/63/EU、意大利D.Lgs 26/2014以及《实验动物护理和使用指南》（华盛顿特区：国家科学院出版社，1996年修订版）。本方案及实验已获国家卫生研究院批准（编号273/15）。动物可自由获取标准啮齿类动物饲料和软化自来水，在任何处理前至少适应本地动物房环境5天（室温：20 - 24 °C；相对湿度：40 - 70%；光照-黑暗循环：12小时）。
1. 体内 基因递送
- 使用层流罩制备 体内 递送试剂/核酸复合物。
- 根据生产商提供的 体内 操作说明，确定实验方案和参数。
- 每只小鼠注射总体积为 200 µL 的复合物。
- 起始使用 40 µg 溶于无内毒素水中的 DNA；优化范围可达到 60 µg。
注意：根据生产商说明，注射体积中核酸的最终浓度不得超过 0.5 µg/µL。 - 使用 N/P 比值为 6 - 8（每 µg 核酸使用 0.12 - 0.16 µL 递送试剂）。计算相应体积的递送试剂。
注意：复合物应带正电荷，以实现有效的细胞摄取。N/P 比值定义为 体内 递送试剂中每个核酸磷酸基团（P）所对应的氮残基数（N），代表复合物内部的离子平衡程度。
- 将计算量的核酸（见步骤 1.2.1）用 10% 葡萄糖储备液（提供）和无菌水稀释至终浓度为 5% 葡萄糖。确保稀释体积为最终注射体积的一半。轻轻涡旋或通过移液上下吹打混匀。
- 将计算量的递送试剂（见步骤 1.2.3）用 10% 葡萄糖储备液（提供）和无菌水稀释至终浓度为 5% 葡萄糖，体积为注射体积的一半。轻轻涡旋后在 13,000 x g 离心 15 秒。
- 将上述稀释后的递送试剂一次性加入稀释后的核酸中。轻轻涡旋混匀，并在 13,000 x g 离心 15 秒。
- 将步骤 1.5 得到的混合物在室温下孵育 15 分钟。
注意：自此步骤起，复合物在室温下可稳定存在 4 小时，在 4 °C 保存时可稳定长达 7 天。 - 使用已平衡至室温的复合物进行尾静脉注射。将小鼠尾巴浸入温水（50 - 53 °C）中 30 秒，以促进静脉扩张。
- 将小鼠放入固定装置中。以 20 - 30° 角度将 27 至 30 号针头插入尾静脉，缓慢注射 200 µL。注射完成后拔出针头，并对注射部位施加压力。
注意：注射过程中尾巴出现轻微隆起表明针头位置不正确。若发生此情况，应拔出针头并在先前注射位点的近端重新操作。
- 将小鼠放入固定装置中。以 20 - 30° 角度将 27 至 30 号针头插入尾静脉，缓慢注射 200 µL。注射完成后拔出针头，并对注射部位施加压力。
- 在静脉注射后 24 和 48 小时，通过 体内 生物发光成像（BLI）（见步骤 2）检测基因表达情况。
2. 在体实验 生物发光成像
注意：提前配制15 mg/mL的D-荧光素新鲜储备液，使用0.22 µm滤器过滤除菌，并于-20 °C保存。
- 将小鼠放入透明的聚甲基丙烯酸甲酯麻醉室中。确保异氟烷储罐已充满。准备麻醉动物时，打开泵（左侧）和麻醉室（右侧）的开关。诱导麻醉时将异氟烷调节至2.5%，维持麻醉时调节至2%。在IVIS成像系统中，动物成像过程中持续保持2.5%异氟烷麻醉。
- 小鼠完全麻醉后，在成像前15分钟，以10 mL/kg体重的剂量经腹腔注射D-荧光素溶液。
注意：应进行D-荧光素的动力学研究，以确定给予D-荧光素后信号峰值出现的时间。 - 打开 在体 成像系统及成像室准备：用一张黑色卡纸衬垫成像室内部（使用后丢弃）。根据需要放置鼻罩以实施正确麻醉（每只小鼠使用一个鼻罩）。
注意：供应麻醉气体至仪器的管路被分流，以确保相同浓度的麻醉气体被输送至成像系统内部的麻醉气体分配装置。 - 将小鼠（最多5只）从盒子转移到成像系统中连接至多通管的鼻罩，并关闭门。图像采集持续5分钟。
- 使用制造商提供的软件按照以下步骤获取BLI。
- 初始化软件。在 体内 成像系统采集控制面板，在其旁边打勾 发光的确认激发滤光片设置为阻断，发射滤光片设置为开放。
- 单击箭头：在发光成像模式下，选择5分钟曝光时间、Binning值为8、F/Stop为1；在摄影成像模式下，选择Binning值为4、F/Stop为8。
- 从“视野”下拉列表中选择 D，19 cm，并设置“对象高度”为 1.5 cm。准备就绪后，单击“采集”以获取图像。
- 图像采集完成后，将小鼠放回其笼中。
- 使用制造商提供的软件对特定区域发射的光子进行定量分析。
- 点击 ROI 工具 工具调色板中。在 ROI 工具，选择 测量感兴趣区域 从“类型”下拉列表中。
- 单击方形图标，绘制一个具有适当尺寸的方形感兴趣区域（ROI），以覆盖一只动物的胸腔。复制并粘贴该感兴趣区域至每只动物，以获得尺寸相同的感兴趣区域。在感兴趣区域工具面板中，单击 测量 ROI 以获取感兴趣区域（ROI）内总强度的测量值。
- 观察在会话期间于图像或序列中创建的所有 ROI（每个 ROI 占一行）的 ROI 测量数据。点击“导出”并选择文件保存的文件夹。
3. 使用促炎性刺激物对小鼠进行攻毒实验
注意：在小鼠接受促炎性刺激物攻击之前，通过i检查其基础激活状态n 体内 BLI（参见步骤2）。两次操作之间必须间隔至少7天。 体内 基因递送及小鼠攻毒，以待轻微且短暂的炎症消退。
- 准备气管内滴注所需的设备（参见 图1 和 图2）。
- 将5 ml一次性注射器与弹簧（C，E）、100 µL注射器（B）以及一次性量表（D）连接至三通旋塞阀（A）。将该系统置于支架（H）上。将该系统置于支架（H）上。
- 将PE190微型医用管路（F）连接至一次性量表（D）和笔式导管（G）。
- 用800 µL空气填充5 mL注射器，并旋转三通旋塞阀。
注意：通过在100 µL注射器中吸取50 µL Pseudomonas aeruginosa 培养上清液，以填充管路。
图1：气管内装置单个组件的示意图。
(A) 三通旋塞阀，(B) 100 µL Hamilton 注射器，(C) 一次性5 mL注射器，(D) 一次性测量计，(E) 带弹簧的一次性5 mL注射器，(F) PE190微细医用导管，(G) 笔式固定器，以及(H) 支撑装置。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：组装好的经气管装置示意图。
标识与图 1中相同。请点击此处查看该图的放大版本。
- 使用异氟烷蒸气室麻醉小鼠，异氟烷浓度设定为2.5%，以氧气作为混合气体。
- 3 - 5 分钟后观察动物，评估麻醉效果。
注意：为确认小鼠已完全麻醉，需仔细观察以下体征：呼吸频率应明显减慢，提起颈部时无前肢伸展反应，以及刺激后肢时无反应。若上述标准未达到，需额外等待数分钟并再次检查，确认后方可进行下一步操作。 - 将麻醉后的小鼠置于亚克力玻璃插管平台上，使其门齿钩住金属丝，悬吊固定。
- 用左手（对于惯用右手的研究者）打开喉镜，并取一把钝头镊子。利用喉镜的尖端和镊子轻轻撬开口腔。
- 用镊子将舌头拉出并固定于一侧。将喉镜片朝向口腔后部引导。保持喉镜非常轻柔地向下按压于一个 90° 角度，直至气管开口可见。固定喉镜位置。
- 用另一只手取与PE管末端相连的输送管，将其插入气管。旋转三通阀以输送接种物。尽快将管子从气管中拔出。将小鼠保持直立数秒钟，使接种物吸入肺部。
注意：若气管阻塞时间过长，小鼠将窒息死亡。 - 将小鼠从平台上取下。恢复时间可能因品系而异；需密切观察小鼠，确保其在操作后30分钟内完全清醒。
- 腹腔注射 150 mg/kg D-荧光素，随后使用活体成像系统对肺部进行成像 体内 在气管内给予刺激物后 4、24 和 48 小时，使用成像系统进行成像。利用制造商提供的软件定量分析特定区域发射的光子数。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
bIL-8-Luc 瞬时转基因小鼠模型被用于 体内 监测用含分泌性毒力因子的浓缩细菌上清液（30倍浓度）攻击后小鼠的肺部炎症。所诱导的炎症反应可通过以下方法检测： 体内 成像表现为BLI信号增强。促炎活性在滴注后2.5小时即可明显检测到，尽管BLI信号在5至24小时之间达到最高峰值，并在48小时时仍可检测到（图3).
图3：代表性 体内 由肺部炎症成像 P. aeruginosa IL-8 瞬时转基因...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在之前的一项研究中11，已显示出bIL-8-Luc依赖性BLI与BAL标志物之间的差异，该差异依赖于不同小鼠品系间敏感性的不同程度12。因此，将bIL-8-Luc模型首次应用于另一种小鼠品系时，需要对炎症反应进行初步研究，包括BLI以及更为标准化的炎症标志物两方面。
小鼠转染可引起轻度肺部炎症及bIL-8-Luc的激活，该信号可通过生物发光成像（BLI）在DNA注射后3至4天内检测到。图41 周后完全消失1基因递送后，应始终通过检测 bIL-8-Luc 的表达来验证 体内 BLI，因为这是后续实验步骤成功所必需的条件。在转染7天后且对小鼠进行攻击前，应记录基线激活信号，以确认转染诱导的炎症已消失。
该方法已在炎症急性期进行过测试，但尚未在慢性期中得到验证。目前尚不清楚活体微生物攻击对此实验体系中所用启动子活性的影响。深入了解急性和慢性...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由意大利囊性纤维化基金会项目 FFC#18/2013、FFC#29/2015 以及意大利囊性纤维化联盟通过威尼托分会—威尼托抗囊性纤维化协会（Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus）资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FMT 2500 荧光断层成像系统 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| IVIS Lumina serie II 前临床 In Vivo 成像系统 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | 避光保存，探针储存于 4 °C |
| 雌性近交系 BalbC 小鼠 | Harlan Laboratories Italy | 使用前，动物需在本地动物房条件下适应至少 5 天 | |
| bIL-8-Luc 质粒 | 意大利帕尔马大学医学兽医科学系 | 质粒储存于 -20 °C | |
| pGL3basic 载体 | Promega | E1751 | 载体储存于 -20 °C |
| JetPEI DNA 转染试剂 | Polyplus transfection | 201B-001G | DNA 与 JetPEI 混合物的最终 N/P 比为 7 |
| D-荧光素钾盐 1 g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | 避光保存，储存于 -20 °C |
| Living Image 软件 | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
| 异氟烷 | ESTEVE spa | 571329.8 | 避免吸入 |
| Bio-Plex 细胞因子检测试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | 未开封试剂盒储存于 4 °C |
| 自动细胞计数仪 | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Penn-century DP-4M 型干粉吹入器 | Penn-century | DPM-EXT | |
| 气体麻醉系统 XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 微型医用导管 | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| 5 mL 无针头注射器 | Terumo | SS*05SE1 | 用剪刀剪去活塞的边缘 |
| Hamilton 0.10 mL（型号 1710） | Gastight | 81022 | |
| Discofix 三通旋塞阀 | Braun | 4095111 | |
| 1 mL 带针头注射器 | Pic solution | 3,071,260,300,320 | 使用时去除针头 |
| 塑料饲管 18ga × 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | 将管尖斜向剪切 |
参考文献
- Barnes, P. J. Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes. J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).
- Cohen-Cymberknoh, M., Kerem, E., Ferkol, T., Elizur, A. Airway inflammation in cystic fibrosis: molecular mechanisms and clinical implications. Thorax. 68 (12), 1157-1162 (2013).
- Dhooghe, B., Noel, S., Huaux, F., Leal, T. Lung inflammation in cystic fibrosis: pathogenesis and novel therapies. Clin Biochem. 47 (7-8), 539-546 (2014).
- Durham, A. L., Caramori, G., Chung, K. F., Adcock, I. M. Targeted anti-inflammatory therapeutics in asthma and chronic obstructive lung disease. Transl Res. 167 (1), 192-203 (2015).
- Sagel, S. D. Noninvasive biomarkers of airway inflammation in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 9 (6), 516-521 (2003).
- Starkey, M. R., et al. Murine models of infectious exacerbations of airway inflammation. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 337-344 (2013).
- Cacalano, G., et al. Neutrophil and B cell expansion in mice that lack the murine IL-8 receptor homolog. Science. 265 (5172), 682-684 (1994).
- Simonet, W. S., et al. Long-term impaired neutrophil migration in mice overexpressing human interleukin-8. J Clin Invest. 94 (3), 1310-1319 (1994).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PLoS One. 7 (6), e39716(2012).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251(2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226(2016).
- De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS One. 9 (9), e106873(2014).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
