不受控制的出血是创伤患者死亡的重要原因，可通过小鼠模型中的标准肝损伤来模拟。该模型可产生稳定的失血量和存活率，并可用于止血剂的测试。本文提供了实施这一重要模型的逐步操作流程。
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本文内容
摘要
摘要
无法控制的出血是创伤患者可预防性死亡的重要原因。我们已建立了一种小鼠无法控制出血的模型 通过 导致持续失血、血流动力学改变和存活的肝裂伤。
小鼠接受标准化的左中叶肝切除术。手术后允许其自由出血，不进行机械干预。根据研究者的兴趣，可将止血剂作为预处理或抢救治疗给予。在出血期间，通过左侧股动脉导管进行实时血流动力学监测。随后处死小鼠，量化失血量，采集血液用于进一步分析，并获取器官以评估损伤情况。实验设计支持对多只动物同时进行测试。
肝脏出血作为非控制性出血的模型在文献中已有报道，主要见于大鼠和猪模型。其中一些模型采用血流动力学监测或量化失血量，但缺乏一致性。本模型在小鼠模型中结合了失血量的量化和实时血流动力学监测，具有可利用转基因品系以及高通量机制的优势，有助于进一步研究非控制性出血中的病理生理机制。
引言
创伤是全球青年人死亡和残疾的首要原因。1 严重创伤患者死亡的主要原因之一是无法控制的出血。2 出血性创伤患者的管理包括两个方面：外科止血以及失血的复苏与替代治疗。
出血性休克的动物模型一直是创伤研究的基石，可用于评估创伤性/出血性休克的病理生理机制及治疗方法。3,4 动物模型中的休克大致可通过两种方法建立：控制性失血和非控制性失血。5,6 控制性失血通过移除固定体积的血液，或持续放血至达到特定血压水平（固定压力法）来实现。尽管这些模型在研究出血性休克的机制和免疫改变方面具有价值，但它们不适用于止血药物的测试，也无法模拟创伤后临床实际中的出血情况。为此，我们致力于建立一种非控制性出血模型，以便在小鼠模型中检测止血变化及促凝药物的效果。肝脏是实施非控制性出血的理想选择之一，部分原因在于其具有双重血供，且在钝性伤和穿透伤中均为最常见的腹腔内受损器官之一。鉴于其高度的临床相关性，肝脏已被广泛用作非控制性出血的模型，最常见于大鼠和猪模型，近年来也应用于灵长类动物模型。7,8,9,10,11,12 小鼠模型中也已引入肝脏损伤，例如挤压伤模型或钝性损伤；然而，这些模型通常不会因肝脏损伤而引发出血性休克。13,14
大鼠和猪的失控性肝出血模型在研究复苏措施和血流动力学监测方面具有重要价值，但由于成本、实验动物使用数量以及可用于特定细胞和分子信号通路分析的转基因品系相对缺乏等原因，其优势不及小鼠模型。本研究所建立的小鼠模型与现有的肝出血模型具有重要的相似之处，包括标准化的肝组织切割、失血量定量、血流动力学监测以及可进行生存分析。许多现有模型仅包含上述部分要素，而本模型旨在同时在多只小鼠中测量多种生理学参数。此外，建立小鼠模型为深入研究失控性出血的病理生理机制提供了可能，超越了单纯的复苏研究，有望利用先进的分子技术，发展出一种成本低、通量高的研究模型。
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方案
小鼠饲养条件符合匹兹堡大学（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）和美国国立卫生研究院（NIH；美国马里兰州贝塞斯达）的动物护理指南，饲养环境为特定病原体-free条件，光照-黑暗周期为12小时，可自由获取标准饲料和水。所有动物实验均经匹兹堡大学动物研究与护理委员会批准，并严格按照其制定的指南进行。
1. 手术区域与器械准备
- 在手术前对所有手术器械、缝合线、纱布、棉签、导管和导管连接件进行灭菌。
- 将手术器械、缝合线、纱布和棉签放入高压灭菌器中进行灭菌；使用环氧乙烷对导管和导管连接件进行灭菌。
- 手术区域准备
- 打开循环水加热垫并设置温度为 37 °C，在其上方放置一块外科蓝色垫巾，再在其上覆盖无菌手术单。
- 将所有已灭菌的器械打开并放置于无菌手术单上。操作时佩戴无菌手套，避免在此过程中破坏无菌状态。
- 用一个不锈钢容器盛装 70% 乙醇并置于一旁备用，用于在不同动物之间清洁器械。
- 开启微珠灭菌器，并使其加热至 150 °C，也用于在不同动物之间对器械进行清洁。若手术涉及超过 5 只小鼠，务必更换为一套新的无菌器械。
- 传感器装置设置
- 连接一个无菌传感器、PE-50 导管、两根 23G 针头、公对公鲁尔接头以及一个三通旋塞阀。6
- 根据制造商说明对传感器进行校准和调零。
2. 肝脏裂伤手术操作
- 麻醉诱导与体位摆放
- 腹腔注射戊巴比妥钠，剂量为70 mg/kg。麻醉作用应在5–10分钟内起效；通过脚趾夹捏测试评估麻醉深度。若小鼠对脚趾夹捏有反应，则需延长等待时间或追加麻醉。若手术过程中需要追加麻醉，可补充戊巴比妥钠。每次追加剂量不得超过0.05 mL，以防止过量。
- 小鼠完全麻醉后，将其仰卧位固定于手术板上，用胶带将四肢固定在板上。
- 用剃刀剃除腹部及双侧腹股沟区的毛发。
- 用碘伏浸泡无菌纱布，涂抹于腹部及双侧腹股沟区域以备手术。 在生存实验中，使用聚维酮碘对腹部和腹股沟区域进行消毒，随后使用乙醇，共完成三个消毒循环。
- 插入直肠温度探针以监测整个实验过程中的核心体温，维持核心体温在35–37 °C之间。
- 股动脉和静脉插管
- 静脉导管装置设置：使用静脉输液袋中的乳酸林格液填充PE-10管、30 G针头和三通旋塞阀。
- 动脉导管装置设置：用肝素化生理盐水（1,000 U 肝素按1:10稀释）填充PE-10导管和30G针头。需使用肝素盐水以防止凝血。
- 将小鼠置于解剖显微镜下。
- 使用手术虹膜剪在腹股沟肌上做一个4-5毫米的纵向切口。用杜蒙镊子夹住与内收肌相连的脂肪组织，并向外侧牵拉，以清晰暴露股血管束。切勿穿过脂肪组织进行解剖，以免造成血管损伤。
- 使用Dumont镊子小心地将神经从动脉和静脉中分离出来。神经旁边有一脂肪垫，用一把Dumont镊子夹住该脂肪垫并向外侧牵拉，从而将神经从动脉上拉开，形成分离平面。用另一把Dumont镊子钝性分离神经与动脉之间的结缔组织。
- 解剖此部分时，切勿抓取神经。
- 在股深动脉分支近端，用6-0丝线在动脉和静脉上各绕三圈结扎。
- 将缝线1置于最靠近近端的位置，并保持松弛。
- 将缝线2置于最远端并立即打结。
- 将缝线3置于缝线1和2之间，并保持松弛。
- 在血管的腹侧表面做血管切开术。建议使用显微血管剪进行血管切开，以避免切断血管。
- 将三通导管插入动脉。立即结扎缝线1和缝线2，以固定导管位置。
- 将三通导管连接至换能器，并采集基线血压数据。
- 在对侧腹股沟重复步骤 2.2.4 - 2.2.6。以与动脉类似的方式插管股静脉。在血管腹侧表面行静脉切开术，随后插入导管。该导管可用于液体或药物输注。
- 肝裂伤
- 预先称量一个含有0.5 mL PBS、三个吸收三角和一个称量纸的离心管，每只小鼠对应一套。
- 从剑突开始沿腹中线向尾侧做一正中腹切口，以完全暴露肝脏。
- 在腹部右侧腹壁处插入一个吸收性三角巾。左侧重复相同操作。
- 确保吸收性明胶海绵三角远离肝脏，以避免肝脏撕裂后产生填塞止血效应。
- 小心抓取肝脏的左中叶，使用手术虹膜剪刀对叶进行75%的切割损伤。将切割下的组织片段放入含有PBS的离心管中。
- 用钉合器关闭腹壁 通过 使用订书器。捏住皮肤和肌肉，迅速钉合。在肝脏撕裂后应尽快操作，以避免腹腔外失血。 在生存实验中，腹部切口需分两层缝合。先用可吸收缝线连续缝合肌肉层，再用不可吸收缝线连续缝合皮肤层，即可实现充分闭合。
- 对于存活时间超过30分钟的小鼠，应移除股部导管，并使用步骤2.2.6中的缝线3结扎动脉和静脉。随后按照前一步骤所述，分两层缝合双侧腹股沟。
- 在出血观察的特定时间点（30分钟至72小时）后，移除缝合钉。取出吸收三角垫，放入已预先称重的称量舟中。使用额外的吸收三角垫吸取任何未被吸收的血液。
- 称量吸收性滤纸以计算总失血量。
- 术后护理
- 将需在30分钟处死的小鼠置于手术板上，在全身麻醉状态下持续监测，直至处死时间。 采用心脏穿刺联合过量吸入异氟烷的方法处死小鼠。
- 将需要较长存活时间点的小鼠放置在循环水加热垫上方的恢复笼中。在恢复期间持续监测小鼠，直至其恢复意识并能维持胸卧位，期间不得无人看管。只有当小鼠从麻醉状态完全恢复后，方可将其放回与其他小鼠共用的笼具中。
- 术后苏醒后，通过皮下注射给予0.1 mg/kg的buprenex镇痛，之后每12小时给药一次，直至处死动物时止。
- 术后将小鼠放回正常饲养笼后，让其自由获取食物和水。
- 对于需处死的存活小鼠，使用吸入式异氟烷进行麻醉。麻醉后，通过右心心脏穿刺采集血液，失血量按上述方法记录，最后通过过量异氟烷确保实施安乐死。
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结果
肝脏裂伤模型可在小鼠中产生可重复且一致的失血量。图1A展示了采用该模型获得的裂伤肝脏重量具有一致性，其标准差仅为0.02 g。裂伤肝脏重量的一致性使得该模型可在不同小鼠及不同实验设置（如不同的复苏方案）中重复使用。此外，裂伤肝脏重量的可重复性（标准误仅为0.01 g）为难以在动物模型中实现的非控制性出血提供了更为标准化的模型。
该模型中不同治疗方案止血效果的验证结果如图1B所示。小鼠预先接受肝素（66单位，作为失血阳性对照）或抗纤溶药物氨甲环酸（TXA）（作为阴性对照），以及一种经验证的促止血纳米颗粒（此前已在小鼠尾静脉出血实验中测试过）处理。15 这些结果表明，该模型可用于评估在出血情况下止血或抗凝血的效果。
不受控...
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讨论
本文所述的小鼠肝脏裂伤模型提供了一种可靠且一致的非控制性出血模型。该模型操作简便，但有一些关键步骤需要细致考虑。模型中技术上最具挑战性的部分是股血管的插管，用于血流动力学监测以及液体/药物给予。在分离神经和进行动脉/静脉切开时必须格外小心。分离血管时应避免接触神经，以防造成神经损伤和可能的瘫痪，尤其是在需要存活的模型中。动脉和静脉切开需要对血管进行精细操作。我们建议使用显微血管剪以防止意外完全切断血管。
尽管肝脏裂伤在技术上难度较低，但在模型操作中保持一致性非常重要，以确保小鼠出血的可重复性和一致性。本模型的建立旨在测试复苏过程中促止血药物的效果，因此在操作时需特别注意，应将吸收性明胶海绵三角放置在远离裂伤部位的位置，以避免产生填塞或机械性止血作用。在手术的这一阶段，应避免对其他器官及肝脏其他叶进行不必要的操作，以防造成意外损伤或出血。完成裂伤后应迅速关闭腹腔，以防止血液丢失到腹腔外。
在整个操作过程中应密切监测小鼠，尤其是在造成撕裂伤后，因为它们会出现显著的血流动力学变化，这一点我们在图2中...
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披露
作者声明无任何经济利益冲突。
致谢
本手稿的研究工作得到了血管医学研究所止血与血管生物学试点项目计划（P3HVB）以及美国创伤外科协会（AAST）研究奖学金对Neal博士的资助。本研究还获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目1 R35 GM119526-01和UM1HL120877-01的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SS/45 Dumont 镊子 | Fine Science Tools | 11203-25 | |
| 手术剪 | Fine Science Tools | 14068-12 | |
| 止血钳 | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| 显微剪刀 | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 0.8 mm 弯头镊子 | 精细科学工具 | 11009-13 | |
| 6-0 缝合线轴 | 精细科学工具 | 18020-60 | |
| 4-0 丝线缝合针 | Owens Minor | K188H | |
| 4 x 4 纱布 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 棉签 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 30 G 针头 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 23 G 针头 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 10 cc 注射器 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 50 cc 圆锥形管 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 1 cc 注射器配 25G 针头 | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| 聚乙烯10号管（PE-10） | Fisher Scientific | 14-170-12P | |
| 聚乙烯50号导管100`(PE-50) | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| 三通旋塞阀 | Fisher Scientific | NC9779127 | |
| 手术用蓝色垫单 | Fisher Scientific | 50-7105 | |
| 无菌敷料 | Fisher Scientific | NC9517505 | |
| 胶带卷 1" | 企业快线 | MMM26001 | |
| 直边广口瓶 | VWR | 159000-058 | |
| 不锈钢托盘 8" ×11" | VWR | 62687-049 | |
| 雄性-雄性leur锁三通 | VWR | 20068-909 | |
| 灭菌袋 3" × 8" | VWR | 24008 | |
| 灭菌袋 5" × 10" | VWR | 24010 | |
| 吸收三角形 | 精细科学工具 | 18105-03 | |
| 7 mm 伤口夹施加器 | Fisher Scientific | E0522687 | |
| 1,000 个 7 mm 伤口夹 | Fisher Scientific | E0522687 | |
| 聚维酮碘（4 盎司） | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 无菌手套 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 离心管 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 1/2 cc 低剂量胰岛素注射器 | Fisher Scientific | 12-826-79 | |
| 小型称量皿 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 乳酸林格液 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 肝素化生理盐水溶液（.1 µL; hep + 9.9 µL; NaCl | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 磷酸盐缓冲液 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 戊巴比妥钠 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| Wild M650 显微镜配支架底座 | Leica | ||
| Digi-Med BPA-400 分析仪 &和系统集成商 | Micro-Med | SYS-400 | |
| TXD-310（Digi-Med 传感器） | Micro-Med | TXD-300 | |
| 计算机 | 戴尔 | ||
| 微珠仪器灭菌器 | VWR | 11156-002 | |
| Oster A5 剪毛机，配 40 号刀头 | VWR | 10749-020 | |
| 循环加热垫 18 x 26 | 哈佛大学 | py872-5272 | |
| 直肠温度计 | Kent Scientific | RET-3 |
参考文献
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