不受控制的出血是创伤患者死亡的重要原因，可通过小鼠模型中的标准肝损伤来模拟。该模型可产生稳定的失血量和存活率，并可用于止血剂的测试。本文提供了实施这一重要模型的逐步操作流程。
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本文内容
摘要
摘要
无法控制的出血是创伤患者可预防性死亡的重要原因。我们已建立了一种小鼠无法控制出血的模型 通过 导致持续失血、血流动力学改变和存活的肝裂伤。
小鼠接受标准化的左中叶肝切除术。手术后允许其自由出血，不进行机械干预。根据研究者的兴趣，可将止血剂作为预处理或抢救治疗给予。在出血期间，通过左侧股动脉导管进行实时血流动力学监测。随后处死小鼠，量化失血量，采集血液用于进一步分析，并获取器官以评估损伤情况。实验设计支持对多只动物同时进行测试。
肝脏出血作为非控制性出血的模型在文献中已有报道，主要见于大鼠和猪模型。其中一些模型采用血流动力学监测或量化失血量，但缺乏一致性。本模型在小鼠模型中结合了失血量的量化和实时血流动力学监测，具有可利用转基因品系以及高通量机制的优势，有助于进一步研究非控制性出血中的病理生理机制。
引言
创伤是全球青年人死亡和残疾的首要原因。1 严重创伤患者死亡的主要原因之一是无法控制的出血。2 出血性创伤患者的管理包括两个方面：外科止血以及失血的复苏与替代治疗。
出血性休克的动物模型一直是创伤研究的基石，可用于评估创伤性/出血性休克的病理生理机制及治疗方法。3,4 动物模型中的休克大致可通过两种方法建立：控制性失血和非控制性失血。5,6 控制性失血通过移除固定体积的血液，或持续放血至达到特定血压水平（固定压力法）来实现。尽管这些模型在研究出血性休克的机制和免疫改变方面具有价值，但它们不适用于止血药物的测试，也无法模拟创伤后临床实际中的出血情况。为此，我们致力于建立一种非控制性出血模型，以便在小鼠模型中检测止血变化及促凝药物的效果。肝脏是实施非控制性出血的理想选择之一，部分原因在于其具有双重血供，且在钝性伤和穿透伤中均为最常见的腹腔内受损器官之一。鉴于其高度的临床相关性，肝脏已被广泛用作非控制性出血的模型，最常见于大鼠和猪模型，近年来也应用于灵长类动物模型。7,
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方案
小鼠饲养条件符合匹兹堡大学（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）和美国国立卫生研究院（NIH；美国马里兰州贝塞斯达）的动物护理指南，饲养环境为特定病原体-free条件，光照-黑暗周期为12小时，可自由获取标准饲料和水。所有动物实验均经匹兹堡大学动物研究与护理委员会批准，并严格按照其制定的指南进行。
1. 手术区域与器械准备
- 在手术前对所有手术器械、缝合线、纱布、棉签、导管和导管连接件进行灭菌。
- 将手术器械、缝合线、纱布和棉签放入高压灭菌器中进行灭菌；使用环氧乙烷对导管和导管连接件进行灭菌。
- 手术区域准备
- 打开循环水加热垫并设置温度为 37 °C，在其上方放置一块外科蓝色垫巾，再在其上覆盖无菌手术单。
- 将所有已灭菌的器械打开并放置于无菌手术单上。操作时佩戴无菌手套，避免在此过程中破坏无菌状态。
- 用一个不锈钢容器盛装 70% 乙醇并置于一旁备用，用于在不同动物之间清洁器械。
- 开启微珠灭菌器，并使其加热至 150 °C，也用于在不同动物之间对器械进行清洁。若手术涉及超过 5 只小鼠，务必更换为一套新的无菌器械。
- 传感器装置设置
- 连接一个无菌....
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结果
肝脏裂伤模型可在小鼠中产生可重复且一致的失血量。图1A展示了采用该模型获得的裂伤肝脏重量具有一致性，其标准差仅为0.02 g。裂伤肝脏重量的一致性使得该模型可在不同小鼠及不同实验设置（如不同的复苏方案）中重复使用。此外，裂伤肝脏重量的可重复性（标准误仅为0.01 g）为难以在动物模型中实现的非控制性出血提供了更为标准化的模型。
该模型中不同治疗方案止血效果的验证结果如图1B所示。小鼠预先接受肝素（66单位，作为失血阳性对照）或抗纤溶药物氨甲环酸（TXA）（作为阴性对照），以及一种经验证的促止血纳米颗粒（此前已在小鼠尾静脉出血实验中测试过）处理。15 这些结果表明，该模型可用于评估在出血情况下止血或抗凝血的效果。
不受控.......
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讨论
本文所述的小鼠肝脏裂伤模型提供了一种可靠且一致的非控制性出血模型。该模型操作简便，但有一些关键步骤需要细致考虑。模型中技术上最具挑战性的部分是股血管的插管，用于血流动力学监测以及液体/药物给予。在分离神经和进行动脉/静脉切开时必须格外小心。分离血管时应避免接触神经，以防造成神经损伤和可能的瘫痪，尤其是在需要存活的模型中。动脉和静脉切开需要对血管进行精细操作。我们建议使用显微血管剪以防止意外完全切断血管。
尽管肝脏裂伤在技术上难度较低，但在模型操作中保持一致性非常重要，以确保小鼠出血的可重复性和一致性。本模型的建立旨在测试复苏过程中促止血药物的效果，因此在操作时需特别注意，应将吸收性明胶海绵三角放置在远离裂伤部位的位置，以避免产生填塞或机械性止血作用。在手术的这一阶段，应避免对其他器官及肝脏其他叶进行不必要的操作，以防造成意外损伤或出血。完成裂伤后应迅速关闭腹腔，以防止血液丢失到腹腔外。
在整个操作过程中应密切监测小鼠，尤其是在造成撕裂伤后，因为它们会出现显著的血流动力学变化，这一点我们在图2中.......
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披露
作者声明无任何经济利益冲突。
致谢
本手稿的研究工作得到了血管医学研究所止血与血管生物学试点项目计划（P3HVB）以及美国创伤外科协会（AAST）研究奖学金对Neal博士的资助。本研究还获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目1 R35 GM119526-01和UM1HL120877-01的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SS/45 Dumont 镊子 | Fine Science Tools | 11203-25 | |
| 手术剪 | Fine Science Tools | 14068-12 | |
| 止血钳 | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| 显微剪刀 | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 0.8 mm 弯头镊子 | 精细科学工具 | 11009-13 | |
| 6-0 缝合线轴 | 精细科学工具 | 18020-60 | |
| 4-0 丝线缝合针 | Owens Minor | K188H | |
| 4 x 4 纱布 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 棉签 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 30 G 针头 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 23 G 针头 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 10 cc 注射器 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 50 cc 圆锥形管 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 1 cc 注射器配 25G 针头 | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| 聚乙烯10号管（PE-10） | Fisher Scientific | 14-170-12P | |
| 聚乙烯50号导管100`(PE-50) | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| 三通旋塞阀 | Fisher Scientific | NC9779127 | |
| 手术用蓝色垫单 | Fisher Scientific | 50-7105 | |
| 无菌敷料 | Fisher Scientific | NC9517505 | |
| 胶带卷 1" | 企业快线 | MMM26001 | |
| 直边广口瓶 | VWR | 159000-058 | |
| 不锈钢托盘 8" ×11" | VWR | 62687-049 | |
| 雄性-雄性leur锁三通 | VWR | 20068-909 | |
| 灭菌袋 3" × 8" | VWR | 24008 | |
| 灭菌袋 5" × 10" | VWR | 24010 | |
| 吸收三角形 | 精细科学工具 | 18105-03 | |
| 7 mm 伤口夹施加器 | Fisher Scientific | E0522687 | |
| 1,000 个 7 mm 伤口夹 | Fisher Scientific | E0522687 | |
| 聚维酮碘（4 盎司） | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 无菌手套 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 离心管 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 1/2 cc 低剂量胰岛素注射器 | Fisher Scientific | 12-826-79 | |
| 小型称量皿 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 乳酸林格液 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 肝素化生理盐水溶液（.1 µL; hep + 9.9 µL; NaCl | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 磷酸盐缓冲液 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| 戊巴比妥钠 | 可通过任何全球供应商购买 | ||
| Wild M650 显微镜配支架底座 | Leica | ||
| Digi-Med BPA-400 分析仪 &和系统集成商 | Micro-Med | SYS-400 | |
| TXD-310（Digi-Med 传感器） | Micro-Med | TXD-300 | |
| 计算机 | 戴尔 | ||
| 微珠仪器灭菌器 | VWR | 11156-002 | |
| Oster A5 剪毛机，配 40 号刀头 | VWR | 10749-020 | |
| 循环加热垫 18 x 26 | 哈佛大学 | py872-5272 | |
| 直肠温度计 | Kent Scientific | RET-3 |
参考文献
- Chang, R., Cardenas, J. C., Wade, C. E., Holcomb, J. B. Advances in the understanding of trauma-induced coagulopathy. Blood. 128 (8), 1043-1049 (2016).
- Kutcher, M. E., et al. A paradigm shift in trauma resuscitation: evaluation of evolving massive transfusion practices. JAMA surgery. 148 (9), 834-840 (2013).
- Tsukamoto,....
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重印与许可
