一种基于串联液相色谱-质谱法的代谢物分析方法 金黄色葡萄球菌

摘要

本文介绍了一种从金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中提取代谢物，并通过液相色谱-质谱联用技术进行后续分析的实验方案。

摘要

为了抑制细菌病原体，宿主通常会限制感染部位营养物质的可利用性。这种限制可改变关键代谢物的丰度，而调控因子会响应这些变化，进而调整细胞代谢。近年来，多种蛋白质和RNA被发现是毒力基因表达的重要调控因子。例如，CodY蛋白可响应支链氨基酸和GTP的水平，在低G+C含量的革兰氏阳性菌中广泛保守。作为一种全局性调控因子，CodY在 金黄色葡萄球菌CodY 调控数十个毒力基因和代谢基因的表达。我们假设 S. aureus 利用CodY部分地改变其代谢状态，以适应在宿主环境中可能遇到的营养受限条件。本文描述了一种从样品中提取和分析代谢物的方法。 S. aureus 使用液相色谱-质谱联用技术，该方法是为验证此假设而开发的。本方法还强调了确保实验严谨性和可重复性的最佳实践，例如在不使用连续恒化培养的条件下维持生物稳态和恒定通气。相对于USA200型甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌 S. aureus 分离 UAMS-1 亲本菌株及其同基因型菌株 codY 突变体中源自天冬氨酸的氨基酸显著增加（例如，苏氨酸和异亮氨酸）及其前体物质的减少（例如，天冬氨酸和 O乙酰高丝氨酸）。这些发现与通过RNA-seq分析获得的转录组数据高度一致：这些通路中的基因表达上调了10至800倍。 codY 空突变体。整合转录组和代谢组的全局分析，可以揭示细菌在面临环境或营养胁迫时如何改变其代谢，从而为感染过程中因营养耗竭所引发的生理变化提供潜在见解。此类发现可能为新型抗感染药物和治疗手段的开发铺平道路。

引言

细菌病原体必须应对宿主环境中的诸多挑战。除了免疫细胞的直接攻击外，宿主还会螯合对细菌生存和增殖至关重要的营养物质，从而形成营养性免疫^1,2。为了在这些不利环境中存活，细菌病原体会表达毒力因子。其中一些因子可使细菌逃避宿主免疫应答；另一些因子则包括分泌型消化酶，如透明质酸酶、耐热核酸酶和脂肪酶，这些酶可能通过降解组织来源的成分来帮助细菌补充缺失的营养物质^3,4,5。事实上，细菌已进化出多种调控系统，可将细胞的生理状态与毒力因子的表达相偶联^6,7,8,9,10。

越来越多的证据表明，CodY 是一种关键的调控因子，能够连接代谢与毒力。尽管 CodY 最初是在 Bacillus subtilis 中被发现，作为二肽转运蛋白（dpp）基因的阻遏蛋白¹¹，但现在已知几乎所有低 G+C 含量的革兰氏阳性菌均能产生 CodY^12,13，并调控数十个参与碳和氮代谢的基因^{14,15,16,17,18,19}。在致病菌中，CodY 还调控一些最重要毒力基因的表达^{20,21,22,23,24,25,26,27}。CodY 作为 DNA 结合蛋白，其活性由两类配体激活：支链氨基酸（BCAAs；异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸 [ILV]）和 GTP。当这些营养物质充足时，CodY 抑制（或在某些情况下促进）转录；当这些营养物质变得受限时，CodY 活性逐步降低，从而引发分级的转录响应，将前体物质重新导向与中心代谢相关的多种代谢通路^28,29,30。
串联液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）是一种强大的分析方法，能够准确鉴定和定量细胞内小分子代谢物³¹。当与转录组分析（例如，RNA-Seq）相结合时，该分析流程可揭示生物体在环境或营养胁迫下发生的生理变化。本文介绍了一种从 Staphylococcus aureus 细胞中提取代谢物并进行 LC-MS 分析的方法。该方法已被用于证明 CodY 对 S. aureus 生理功能的多效性影响。

方案

1. 缓冲溶液的配制

1. 通过将10倍浓度的磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4）储备液用超纯水（经蒸馏和去离子处理）稀释至1倍终浓度，制备磷酸盐缓冲液（PBS）。
2. 通过混合2 mL乙腈、2 mL甲醇、1 mL超纯H₂O和19 µL甲酸（终浓度0.1 mM），制备淬灭溶液。
3. 通过向超纯水中加入甲酸（终浓度0.2% [v/v]），制备液相色谱-质谱联用溶剂A。
4. 通过向乙腈中加入甲酸（终浓度0.2% [v/v]），制备液相色谱-质谱联用溶剂B。
   注意：所有溶液应使用可获得的最高纯度试剂（通常为高效液相色谱级）配制。溶液应在每次实验前新鲜配制，并在使用前置于冰上保存。

2. 建立金黄色葡萄球菌（S. aureus）的稳态生长

1. 从冷冻甘油菌种中将感兴趣的 S. aureus 菌株划线接种于胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板上进行分离培养。在 37 °C 下培养 16–24 小时。
2. 用各菌株的单菌落接种 4 mL 无菌玻璃培养管中的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）或其他合适培养基。在 37 °C、约 70° 倾斜、以每分钟 60 转（rpm）振荡的条件下培养 16–20 小时。
   注意：采用标准方法（包括步骤 2.2 中所述方法）培养的过夜培养物容易产生氧气梯度，从而影响细胞生理状态。因此，我们采用多次回传稀释策略以确保达到生物学稳态（见下文步骤 2.4–3.2）。
3. 使用分光光度计在 600 nm 处测定步骤 2.2 中培养物的光密度（OD₆₀₀），以无菌培养基作为空白对照。将细胞分别稀释至 OD₆₀₀ 为 0.05，并接种于 50 mL 预热至 37 °C 的无菌 TSB 培养基中，置于 250 mL DeLong 培养瓶中。
4. 将培养物置于 37 °C 水浴中，以 280 rpm 振荡培养。
5. 每隔 30 分钟测定一次 OD₆₀₀；随着光密度增加，可能需要用 TSB 稀释培养物，以确保其保持在分光光度计的线性吸光度范围内。
6. 当步骤 2.5 中的培养物达到 OD₆₀₀ 约为 0.8–1.0 时，将其转接到 50 mL 37 °C 的 TSB 培养基中，使初始 OD₆₀₀ 为 0.01–0.05，然后重复步骤 2.4 和 2.5。

3. 样本采集设置

1. 在合适的容器中准备一层粉碎的干冰例如， 玻璃培养皿、冰桶或冷藏箱
2. 当菌液的光密度接近目标收获点时，向一个35 mm未经处理的培养皿中加入1 mL淬灭溶液，并在干冰上预冷不少于5分钟。
   注意： "期望收获时间点" 将根据实验目标的不同而有所变化。例如，若要研究有氧生长期间的代谢物，该状态的关键指标包括在指数后期生长阶段排出乙酸以及重新同化乙酸^32,33通常，该时间点应处于特定的生长阶段（例如， 指数生长期）。特定的OD₆₀₀ 不同菌株和培养基条件下，与此阶段相关的数值可能存在差异。
3. 将一个已预冷至 -20 °C 的不锈钢滤芯放入橡胶塞中，并将其置于连接至中央真空系统或真空泵的抽滤瓶上。
4. 施加真空，将混合纤维素酯膜（0.22 µm 孔径）置于其上。
   注意：必须使用与烧结滤片直径相同的滤膜，并正确居中放置，以确保样品通过滤膜被抽吸，而非从滤膜边缘溢出。用冰浴的无菌 H₂O 可能有助于膜的定位。

4. 样品采集

1. 在 OD₆₀₀ 当 OD 值约为 0.4–0.5 时，使用刻度移液管从锥形瓶中移除 13 mL 培养液，并将样品加至滤膜上。
2. 样品完全过滤后，立即用 ≥5 mL 冰冷的 PBS 冲洗滤膜，以去除与培养基相关的代谢物。
3. 断开真空，用无菌镊子将滤膜从砂芯上取下。将滤膜（细胞面朝下）倒置放入预冷的淬灭溶液中。
   注意：必须迅速执行上述步骤（即， 在数秒内并在液体移除后立即进行，以确保细胞快速淬灭，终止代谢活动。
4. 将滤膜置于干冰上的淬灭溶液中孵育不少于20分钟。
5. 使用无菌镊子将滤膜（细胞面朝上）倒置放入培养皿中，然后用微量移液器将细胞从膜上冲洗下来，使其进入淬灭液中。
6. 将细胞重悬于淬灭溶液中，然后将细胞悬液转移至含有约 100 µL 0.1 mm 玻璃珠的无菌 2 mL 耐冲击管中。置于干冰或 -80 °C 保存。

5. 代谢物提取

1. 将样品置于湿冰上解冻，使用匀浆器以6,000 rpm进行四次、每次30秒的破碎处理，每次循环间在干冰上冷却2分钟。
2. 在预冷的低温微量离心机中以最大转速离心15分钟，澄清裂解液即， 18,213 × g，≤4 °C
3. 将上清液转移至洁净的微量离心管中。
4. 使用移液器将样品的一小部分转移至微量离心管中，用于第6步残留肽含量的定量；其余样品储存于-80 °C。
   注意：预留样品的体积因第6.1步中所使用的BCA检测方法而异。该样品应置于湿冰上用于 immediate 分析，或在 -80 °C 冻存。

6. 双辛可宁酸（BCA）测定

1. 按照试剂盒制造商的建议，使用第5.4步的样品进行BCA检测，以确定每个样品的残留肽浓度。

7. 液相色谱-质谱联用（LC-MS）

1. 混合 75 µL 的 S. aureus 用75 µL在步骤1.4中配制的LC-MS溶剂B进行萃取。
2. 涡旋混匀，然后在13,000 × g离心5分钟。
3. 将100 µL上清液加入液相色谱（LC）样品瓶中并盖上瓶盖。确保样品中无气泡残留。
4. 将液相色谱小瓶装载到液相色谱-质谱自动进样器上，并在软件中编辑运行列表 "离线工作列表编辑器"
   1. 填写 "样本名称" (例如， 野生型-1) "样本位置" (例如， P1-A1) "方法" (例如， 甲酸阴性法），以及 "数据文件" (例如， 野生型-1）列。点击按钮 "保存工作列表" 按钮。打开 "质谱数据采集工作站" 软件并输入先前保存的工作列表。点击 "开始工作列表运行" 单击按钮以开始连续的液相色谱-质谱（LC-MS）测量。
5. 在色谱柱上分离样品，将色谱柱连接至飞行时间（TOF）质谱仪，并将TOF质谱仪与液相色谱系统耦合。采用以下流动相梯度：0–2 min，85% 溶剂B；3–5 min，80% 溶剂B；6–7 min，75% 溶剂B；8–9 min，70% 溶剂B；10–11.1 min，50% 溶剂B；11.1–14 min，20% 溶剂B；14.1–24 min，5% 溶剂B；最后在85% 溶剂B条件下以0.4 mL/min流速平衡10 min^-1.
6. 使用等度泵将参考质量溶液与运行样品一同注入，以实现质荷比轴的同步校准。
   注意：此步骤基于标准的飞行时间质谱仪操作手册。
   1. 使用乙酸-D4与六(1H,1H,3H-四氟丙氧基)磷杂苯作为参考质量溶液进行实时校准。使用等度泵，流速为2.5 mL min⁻¹^-1 用于输注。

8. 离子计数的批次校正

1. 指定任一样本作为批次校正的参考样本（例如，野生型，重复1）。
2. 计算参考样本中所有代谢物的离子计数总和。对所有样本重复此计算。
3. 将每个样本的总离子计数除以参考样本的总离子计数，得到一个比值。
4. 将样本中每个代谢物的离子计数除以该样本与参考样本的比值，从而获得每个代谢物的批次校正后离子计数。

9. 肽段归一化

1. 将第8步获得的各样本批次校正后的离子计数值除以第6步通过BCA测定法确定的肽浓度，从而得到每个代谢物的标准化值。
   注意：第9.1步获得的每个代谢物的标准化、批次校正后的离子计数值可在不同菌株间直接比较，并进行统计分析（例如，Mann-Whitney U检验）。或者，可选用一种已知在处理或遗传背景影响下保持不变的代谢物作为标准化参照，以检测因代谢物降解引起的变化。在提取缓冲液中加入已知量的L-正缬氨酸或戊二酸，可用于校正样品处理过程中的损失³⁴。

结果

我们已分析了细胞内代谢物库 S. aureus 在……期间 体外 在富含营养的复杂培养基中生长。作为概念验证，我们比较了对甲氧西林敏感的菌株之间的代谢物谱 S. aureus 骨髓炎分离株 UAMS-1（野生型 [WT]）及缺失全局转录调控因子 CodY 的同基因型菌株（ΔcodY)²⁶. 野生型和稳态指数生长期培养物 codY 菌株在TSB培养基中建立，具体步骤如方案第2步所述。野生型和 codY- 空白突变体培养物表现相似，仅在生长得率和生长速率上存在轻微差异（图1）。利用RNA-Seq和微阵列技术，我们及其他研究者发现，参与由天冬氨酸衍生的氨基酸生物合成的多种酶编码基因在该条件下发生去抑制。 codY与野生型细胞相比，-null 突变体在期间 体外 TSB 中的生长图2)^25...

讨论

所有小分子代谢物都通过其在中心代谢通路中的共同来源相互关联。在指数生长期，细菌细胞处于生物学和代谢稳态，能够提供特定条件下生理状态的一个快照。CodY通过响应异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸（ILV）以及GTP来监测营养充足性。当ILV和GTP池下降时，CodY的活性可能逐步降低，从而调节其靶基因的表达，以适应日益加剧的营养匮乏³⁰。CodY缺陷型菌株的行为表现如同环境中ILV和GTP已被耗尽，但其生长行为与CodY功能完整的菌株相比仅表现出极轻微的差异（图1）。因此，比较这两种菌株中代谢物的稳态水平，为我们提供了一个独特的机会，揭示在营养匮乏时代谢网络被重新配置的程度。需要指出的是，我们的实验研究的是CodY活性达到最大时的代谢物丰度（此时ILV和GTP在指数生长期最为丰富）。然而，其他生长阶段可能适用于回答其他科学问题。例如，在指数生长期，三羧酸（TCA）循环的活性非常低；而在指数后期，TCA循环被激活³⁶。许多表型特征，包括代谢物丰度，都依赖于这一激活过程。此外，agr群体感应系统在从指数生长...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料/设备a
DeLong培养瓶（250 mL）	Belco	2510-00250
侧臂烧瓶，500 mL	派热克斯	5340
3孔橡胶塞，#7	Fisher	14-131E
不锈钢滤器/烧结滤芯	VWR	89428-936
培养皿，35 mm	康宁	430588	未经组织培养处理
混合纤维素酯膜，0.22 μm 孔径	Millipore	GSWP02500
耐冲击管，2 mL	USA Scientific	1420-9600
二氧化硅珠，0.1 毫米	Biospec 产品公司	11079101Z
Precellys 24 匀浆器	Bertin Instruments	EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA 蛋白定量检测试剂盒	Pierce（Thermo Scientific）	23235
Cogent Diamond 氢化物型 C 柱	安捷伦	70000-15P-2
准确质量飞行时间（TOF）液相色谱-质谱，6200 系列	安捷伦	G6230B
Quat 泵，1290 系列	安捷伦	G4204A
二元泵，1290 系列	安捷伦	G4220A
阀动装置，1290 系列	安捷伦	G1107A
等度泵，1290 系列	安捷伦	G1310B
TCC，1290 系列	安捷伦	G1316C
Sampler, 1290 系列	安捷伦	G4226A
恒温器，1290 系列	安捷伦	G1330B
化学
胰蛋白胨大豆肉汤	Becton Dickinson	211825
Difco 琼脂，颗粒状	Becton Dickinson	214530	固体培养基含有1.5% [w/v] 琼脂
磷酸盐缓冲液（pH 7.4）10倍浓缩液	Ambion	AM9624	用超纯水将新鲜溶液稀释至1倍浓度
乙腈	Fisher Scientific	A955-500	Optima LC-MS
甲醇	Fisher Scientific	A456-500	Optima LC-MS；有毒
甲酸	Sigma Aldrich	94318	对于质谱分析，98%
软件
MassHunter	安捷伦	G3337AA
细菌菌株	物种	菌株	基因型
SRB 337	金黄色葡萄球菌	USA200 甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌 UAMS-1	野生型
SRB 372	金黄色葡萄球菌	USA200 甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌 UAMS-1	ΔcodY::erm
a所列出的化学品和材料均针对所述方法，不包括常规实验室化学品或耗材。