方法文章

一种用于定量软骨细胞去分化过程中DNA甲基化水平的5-甲C点斑杂交检测方法 体外

DOI：

10.3791/55565

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2017年5月17日

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1Guangzhou Medical University, 2Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Laboratory of Digital Orthopeadic Engineering, Department of Orthopedics, Shenzhen Second People's Hospital (The First Hospital Affiliated to Shenzhen University), 3Department of Chemistry, The Chinese University of Hong Kong, 4School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, 5Renji Hospital Clinical Stem Cell Research Center, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 6Shantou University Medical College

本文内容

摘要

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我们介绍一种基于5-甲基胞嘧啶（5-mC）点印迹法的DNA甲基化定量方法。我们测定了软骨细胞去分化过程中的5-mC水平。这种简单技术可用于快速确定自体软骨细胞移植（ACI）治疗中软骨细胞的表型。

摘要

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透明软骨细胞在单层扩增过程中常发生去分化，转化为成纤维样软骨细胞 体外软骨细胞的全局DNA甲基化水平被认为可作为软骨细胞表型丢失的合适生物标志物。然而，基于不同实验方法所得结果可能存在不一致。因此，建立一种精确、简便且快速的定量方法以检测软骨细胞去分化过程中的全局DNA甲基化水平具有重要意义。

目前的全基因组甲基化分析技术在很大程度上依赖于亚硫酸氢盐基因组测序。由于亚硫酸氢盐转化过程中会导致DNA降解，这些方法通常需要较大的样本量。其他用于定量全基因组DNA甲基化水平的方法包括高效液相色谱法（HPLC）。然而，HPLC需要对基因组DNA进行完全消化。此外，HPLC仪器高昂的成本限制了其更广泛的应用。

本研究从不同传代次数培养的人软骨细胞中提取基因组DNA（gDNA），并采用甲基化特异性点印迹法检测gDNA的甲基化水平。在此点印迹方法中，含有待检测甲基化DNA的gDNA混合物被直接点样到N+膜上，形成预先绘制的圆形模板内的点状信号。与基于凝胶电泳的其他印迹方法及其他复杂的印迹程序相比，点印迹法可显著节省时间。此外，点印迹法可利用 commercially available 5-mC 抗体检测总体DNA甲基化水平。我们发现，单层继代培养的软骨细胞之间DNA甲基化水平存在差异，因此该差异可能在软骨细胞去分化过程中发挥关键作用。5-mC点印迹法是一种可靠、简单且快速的检测总DNA甲基化水平的方法，可用于评估软骨细胞表型。

引言

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自体软骨细胞移植（autologous chondrocyte implantation, ACI）是一种相对较新且先进的治疗关节软骨缺损的手术方法1,2ACI 中的一个关键步骤是通过单层培养扩增软骨细胞 体外在扩增过程中，透明软骨细胞容易失去其表型并发生去分化，这对自体软骨细胞移植（ACI）治疗是不利的3,4为了优化自体软骨细胞植入术（ACI）的治疗效果，应在细胞重新植入前确定软骨细胞去分化的程度。建立一种经济且快速的方法来评估软骨细胞的状态至关重要。近年来，DNA甲基化与软骨细胞去分化之间的关联已引起广泛关注4,5,6DNA甲基化是一种将甲基基团添加到DNA上的过程，导致胞嘧啶残基转化为5-甲基胞嘧啶（5-mC）。

为了阐明软骨细胞去分化过程中DNA甲基化的生物学机制，首要步骤是评估软骨细胞的DNA甲基化水平，但迄今为止这一过程仍具挑战性。亚硫酸氢盐基因组测序是目前分析DNA甲基化最广泛使用的技术7,8。该实验中，亚硫酸氢盐转化会导致DNA降解，因此必须提供大量样本。此外，高效液相色谱法（HPLC）也被用于定量全基因组DNA甲基化水平9,10。然而，HPLC分析需要对基因组DNA进行消化处理，并且需要先进且昂贵的实验仪器。因此，这些实验方法不仅成本高昂，而且耗时较长。目前，抗5-mC抗体已实现商业化供应，这使得通过免疫印迹法检测复杂基因组中含5-mC的基因组DNA成为可能。

本研究中，我们从一系列单层培养的软骨细胞中提取了基因组DNA，并采用点杂交法检测不同传代次数的人软骨细胞中5-甲基胞嘧啶（5-mC）的含量。结果发现，高度去分化的软骨细胞中5-mC含量较低度去分化的软骨细胞有所升高。此外，我们还确定了去分化状态与5-mC水平之间的关联。最后，我们报道了5-mC含量的变化与软骨细胞表型相关。因此，5-mC点杂交法是一种可靠、简便且快速检测软骨细胞DNA甲基化水平的方法。

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方案

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本研究经深圳市第二人民医院人体伦理委员会批准。

1. 人关节软骨组织采集与软骨细胞培养

  1. 材料准备
    1. 准备添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。配制1 mg/mL胶原酶II、0.25%胰蛋白酶-EDTA、磷酸盐缓冲液（PBS）以及细胞筛网（40 µm尼龙）。
  2. 人关节软骨组织采集
    1. 从创伤后供体患者的膝关节中分离关节软骨。所有参与者均需签署知情同意书。
    2. 使用无菌手术刀将软骨切成1-2 mm3大小的组织块，并在DMEM中加入1 mg/mL胶原酶II，在37 °C条件下消化12-16小时以释放软骨细胞。
    3. 将所得细胞悬液通过细胞筛网（40 µm）过滤，并用PBS洗涤两次。
    4. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并以20,000-30,000个细胞/cm2的密度接种于含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中。
    5. 在37 °C培养箱中进行培养。
  3. 单层软骨细胞扩增
    1. 使用0.25%胰蛋白酶-EDTA收集未完全融合的细胞，并以6,600个细胞/cm2的密度重新接种。每周更换两次培养基。
    2. 将软骨细胞以单层形式培养至多六代，并在第1、2、3、4和5代时进行评估。

2. 基因组DNA（gDNA）提取

  1. 收集细胞，并按每1000万个细胞加入500 µL裂解缓冲液（15 mM Tris pH 8.0，10 mM EDTA pH 8.0，0.5% SDS，200 µg/mL RNase A）重悬。通过移液和快速颠倒混匀细胞，然后在37 °C孵育1小时。
  2. 向细胞裂解液中加入蛋白酶K，终浓度为160 µg/mL，剧烈颠倒混匀。在55 °C孵育6小时。
  3. 向样品中加入等体积的Tris pH 7.9饱和酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），涡旋振荡或手动充分摇动约20秒。
  4. 在室温下以13,000 × g离心5分钟。小心移取上层水相，转移至新离心管中。
  5. 用等体积氯仿抽提以去除酚，将上层水相转移至新的离心管中。
  6. 加入0.1倍样品体积的3 M乙酸钠（pH 8.0）和2倍体积的100%乙醇，沉淀DNA。
  7. 将离心管置于-20 °C过夜，以沉淀基因组DNA（gDNA）。
  8. 在4 °C以16,000 × g离心10分钟，使gDNA沉淀。
  9. 用70%乙醇洗涤样品三次，每次在4 °C以13,000 × g离心2分钟。
  10. 小心弃去上清液，空气干燥后将DNA重悬于10 mM Tris pH 8.0、0.1 mM EDTA溶液中。

3. DNA甲基化谱分析

  1. 根据制造商的说明书，使用DNA甲基化试剂盒对总共500 ng基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化反应。用10 µL洗脱缓冲液洗脱（50 ng/µL）。
  2. 根据制造商的说明书，使用商业试剂盒进行DNA甲基化谱分析。

4. 点印迹分析

  1. 将分离的DNA（每份样品1 mg）在0.1 M NaOH中于95 °C变性10分钟。用冰上预冷的1 M NH4OAc中和DNA，然后进行两倍稀释。将系列稀释的基因组DNA每孔点样2 µL于N+膜上。
  2. 将膜在80 °C烘烤30分钟。
  3. 将N+膜浸泡于含5% BSA的TBS-T溶液中，室温下孵育1小时，以封闭非特异性抗体结合位点。使用直径10 cm的培养皿作为反应容器。
  4. 用TBST洗涤膜3次，每次5分钟，随后在4 °C下用小鼠抗5-甲基胞嘧啶（5-mC）单克隆抗体（1:1,000稀释）在TBS-T中孵育过夜。
  5. 用TBS-T洗涤膜3次，每次5分钟，然后在室温下用辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（1:5,000稀释）在TBS-T中孵育1小时。
  6. 用TBS-T洗涤膜3次，每次5分钟。
  7. 向膜上加入酶底物，孵育5–10分钟。根据制造商说明书，使用化学发光检测试剂盒显影二抗信号。

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结果

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软骨细胞在单层培养中传代至第6代（P6）。随着单层培养的连续传代，软骨细胞表现出渐进性的表型变化。P0代软骨细胞呈圆形，而随着传代次数增加至P6，细胞逐渐变得细长且扁平化（图1）。这种形态学改变是软骨细胞去分化过程的典型特征。同时，热图结果显示，CpG位点的总体甲基化水平随着连续传代培养的延长而升高。5-mC点杂交分析进一步表明，软骨细胞扩增过程中伴随有较高的CpG甲基化水平（图2）。这些结果提示，总体甲基化水平的升高与软骨细胞去分化之间存在关联。

细胞形态学研究；显微镜图像显示不同汇合度的成纤维细胞培养；分析。
图1：使用倒置显微镜观察到的人软骨细胞形态。...

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讨论

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软骨细胞去分化 体外 严重损害自体软骨细胞移植（ACI）在软骨缺损修复治疗中的疗效11,12为优化自体软骨细胞移植（ACI）的效果，必须避免使用去分化的软骨细胞13研究表明，总体DNA甲基化水平与软骨细胞去分化的程度相关。4,6因此，在临床应用之前，建立一种可靠且快速的方法来检测软骨细胞的总体DNA甲基化状态至关重要。

为了检测去分化的软骨细胞中总体的DNA甲基化水平，我们可以测定连续传代的软骨细胞中的5-mC水平。5-mC对亚硫酸盐处理引起的脱氨作用具有抗性，该特性被用于通过亚硫酸盐测序方法分析DNA胞嘧啶的甲基化模式14。亚硫酸盐基因组测序和甲基化敏感性限制性酶切长期以来被视为检测DNA甲基化的金标准技术

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披露

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

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本工作获得以下基金资助：国家自然科学基金（编号 81572198；编号 81260161；编号 81000460）；广东省自然科学基金（编号 2015A030313772）；中国博士后科学基金资助项目（编号 2013M530385）；广东省医学科研基金（编号 A2016314）；深圳市科技计划项目（编号 JCYJ20160301111338144；编号 JSGG20151030140325149；编号 JSGG20140519105550503；编号 GJHZ20130412153906739；编号 JCYJ20140414170821160；编号 JCYJ20140414170821200）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
DMEMGibco Inc.11965–092使用前在 37 °C 水浴中预热
磷酸盐缓冲液 (PBS)HyClone Inc.SH30256.01BD-PBS，不含 Ca2+/Mg2+
FBSGibco Inc.10099-141
0.25% 胰蛋白酶/EDTAGibco Inc.25200-056
1% 青霉素-链霉素Gibco Inc.15140-122
氯仿Mallinckrodt4440
异戊醇SigmaI-3643
苯酚Gibco BRL15513-039
蛋白酶KGibco BRL24568-2
TAE 缓冲液 Bio Whittaker16-011V
蒸馏水Gibco BRL15230-170
1 M Tris-HClBiosharp Inc.BL514A
Tween20Biotopped Inc.C58H114O26
BSAProliant Inc.68700
胶原酶 II 型Sigma-AldrichC6885
[header]
设备
血细胞计数板ISOLAB Inc.075.03.001
Falcon 100 mm 培养皿Corning353003
离心管TPP AG91050γ射线灭菌
高速离心机Eppendorf5804R
恒温混匀仪MIULABMTH-100
二氧化碳细胞培养箱Thermo scientific3111
化学发光成像分析系统UVITEC CambridgeALLIANCE

参考文献

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  1. Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
  2. Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
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  4. Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
  5. Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
  6. Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , [Epub ahead of print] (2016).
  7. Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
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  13. Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
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重印与许可

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5 DNA DNA 5 mC DNA

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