应激颗粒（Stress Granules, SGs）是细胞在多种应激条件下形成的无膜细胞质结构，包含mRNA、RNA结合蛋白、小核糖体亚基、翻译相关因子以及多种细胞信号蛋白。本实验方案描述了一套工作流程，结合多种实验方法对SGs进行检测、表征与定量分析。 真正 应激颗粒。
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摘要
摘要
细胞经常面临突发的环境变化。应激颗粒（Stress Granules, SGs）是细胞在应激条件下形成的细胞质核糖核蛋白复合物，参与调控细胞代谢和存活的多个方面。SGs 可调节细胞信号通路、转录后基因表达以及应激反应程序。这些含 mRNA 颗粒的形成与细胞翻译过程直接相关。翻译起始受抑制会触发 SG 的组装，而翻译激活或翻译延伸受抑制则促进 SG 的解聚。这种关系也体现在 SG 的组成上。SG 的核心组分包括停滞的翻译前起始复合物、mRNA 以及特定的 RNA 结合蛋白（RBPs）。SG 组装的目的是通过隔离处于翻译停滞状态的管家基因 mRNA 来节约细胞能量，从而促进应激响应蛋白的高效翻译。除了停滞的翻译前起始复合物等核心成分外，SGs 还包含大量其他蛋白质和信号分子。SG 形成缺陷会损害细胞对压力的适应能力，从而可能导致细胞死亡。SGs 及类似的含 RNA 颗粒已被发现与多种人类疾病相关，包括神经退行性疾病和癌症，这促使近年来人们开始关注对 RNA 颗粒亚型进行分类和定义。本实验方案描述了用于表征和定量哺乳动物细胞中应激颗粒的检测方法。
引言
细胞采用多种机制来应对压力。其中一些反应发生在转录后水平，涉及对mRNA翻译和/或稳定性的调控1,2。受压力调控的mRNA翻译抑制及其降解过程与特定的无膜细胞焦点结构的形成相关，其中研究最为清楚的是应激颗粒（Stress Granules, SGs）3。SGs是存在于细胞质中的焦点结构，在响应压力（例如，氧化应激、热休克、营养缺乏和病毒感染）而发生翻译停滞的细胞中，可富集非翻译状态的mRNPs4。除了非翻译mRNA外，SGs还包含翻译起始因子、RNA结合蛋白以及多种信号转导蛋白5。SGs是蛋白质翻译受抑和RNA代谢改变的生物标志物，且已被证实与细胞存活和凋亡、信号通路以及核内过程相关5。
应激颗粒是动态结构，其形成与细胞翻译状态密切相关6尽管应激颗粒（SG）在外观上看似结构稳定，但其大多数蛋白质组分会快速进出，停留时间仅为数秒。虽然应激颗粒可持续存在数分钟至数小时，但其大部分组分始终处于快速动态交换状态。翻译起始的抑制以及随之而来的正在翻译的多聚核糖体解聚，会促进应激颗粒的形成；因此，应激颗粒与正在翻译的多....
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方案
1. 细胞准备
- 按照 图1A 所示，将已灭菌的盖玻片加入24孔板的12个孔中；可使用连接真空装置的无菌巴斯德吸管逐个吸取盖玻片。轻轻将盖玻片在孔壁上轻触，释放负压，使盖玻片自然落入孔底。
- 每孔接种1 × 105 个U-2 OS（U2OS）骨肉瘤细胞，终体积为500 µL培养基。将培养板左右、上下轻轻晃动数次，确保细胞均匀分布。
- 用洁净的P1000枪头轻轻按压盖玻片，确保其完全贴附于孔底，且盖玻片下方无气泡。
2. 细胞应激处理
- 次日，使用倒置组织培养显微镜配合10倍物镜，目视检查培养板，确保细胞在盖玻片上均匀分布且融合度一致，因为样品间的差异可能对实验结果的可重复性产生不利影响。
- 将培养基预热至37 °C。避免向细胞中添加过冷或过热的培养基，以免分别引起冷休克或热休克。
- 用预热的培养基稀释药物。针对每种不同的药物浓度，准备2个含有500 µL培养基的孔，并额外准备500 µL以补偿移液过程中的损耗。分装4个离心管，每管含1.5 mL。
- 对于亚砷酸钠：向每个含500 µL培养基的孔中加入1.5 µL的100 mM亚砷酸钠（终浓度：100 µM），或加入0.75 µL的100 mM亚砷酸钠（终浓度：50 µM）。 ....
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结果
应激诱导的焦点并不一定是应激颗粒（SG）。应激颗粒被定义为含有mRNA、翻译起始因子和RNA结合蛋白的细胞质焦点，且与活跃的翻译过程处于动态平衡状态。上述方案可作为模板，用于鉴定某种特定应激是否诱导形成真正的应激颗粒（bona fide SGs）。
应激颗粒（SGs）与其它已知的SG标志物共定位，包括蛋白质和mRNA。SA和VRB可诱导形成含有G3BP1、eIF4G和eIF3b的细胞质焦点（图2A）。通过线扫描分析以及更高倍数的单通道图像，进一步证实了这些标志物的共定位（图2A）。此外，这些焦点还含有mRNA，这由polyA FISH检测证实，其中寡聚(dT)信号与G3BP1免疫荧光信号共定位（图2B）。关键是要证明polyA-FISH信号与已知的SG标志物重叠，因为应激可能促进多种类型的焦点形成。
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讨论
正如多种疾病的免疫组织学研究所示，慢性应激可导致不同类型的细胞内焦点结构形成。例如，大多数神经退行性疾病均以细胞内不溶性蛋白聚集为特征。当此类聚集物中存在应激颗粒（SG）相关蛋白时，通常据此推断这些焦点结构即为应激颗粒。当在经新型应激刺激处理的细胞中观察到SG标志物阳性的胞质焦点时，也常得出类似结论。本方案提供了一种简便的工作流程以鉴定 真正有效的 应激颗粒。
要确认假定的应激颗粒（SG）确实为SG，必须满足若干标准，包括对其组成和动态特征的表征。首先，SG是细胞质中的焦点结构，含有翻译停滞的mRNP复合物。因此，第一步是利用两种基于显微镜的技术——polyA-FISH和免疫荧光（IF）——来分析其组成。FISH是一种可靠的方法，可用于可视化与SG共定位的mRNA。使用寡核苷酸(dT)40探针检测在应激条件下聚集到SG中的多聚腺苷酸化mRNA。由于寡核苷酸(dT)不能检测去腺苷酸化的mRNA（后者是P小体（Processing Bodies, PBs）的核心组分），因此在细胞质焦点中出现强烈的寡核苷酸(dT)信号是这些焦点可能为SG的第一个提.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Ivanov和Anderson实验室的成员对本手稿提出的有益讨论和反馈意见。本研究得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的资助[PA获得GM111700和CA168872，PI获得NS094918]，以及波兰国家科学中心（National Science Centre in Poland）的资助[项目号UMO-2012/06/M/NZ3/00054，授予WS]。WS还感谢波兰科学与高等教育部（Mobility Plus项目）以及波美富布赖特委员会（Polish-American Fulbright Commission）对其在美国开展研究工作的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| U-2 OS | ATCC | ATCC®HTB-96™ | 常用写法 "U2OS" 在37℃培养 °5% CO₂条件下，37°C2 在含10% FBS的DMEM中 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | 康宁 | 10-013-CV | 含 4.5 g/L 葡萄糖、丙酮酸钠和酚红 添加10% FBS、10 mM HEPES及青霉素/链霉素 预热先前的药物稀释液 |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma | F2442-500ml | 用于补充培养基 |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | 用于补充培养基 |
| 青霉素 链霉素 | Sigma | P0781-100ml | 用于补充培养基 |
| 24孔板 | Costar | 3524 | |
| 实验室用纸巾（Kimwipes） | KIMTECH SCIENCE | 34120 | |
| 用于生长盖玻片的盖玻片 | Fisher Scientific | 12-545-82 | 使用前已高压灭菌 在组织培养罩中保持无菌 |
| 亚砷酸钠 ≥90%（SA） | Sigma | S7400-100G | 溶于水配制成 1 M 浓度，然后稀释至 100 µM 作为工作储备液 |
| 长春瑞滨（Vinorelbine，VRB） | TSZ CHEM | RS055 | 溶于水至 10 mM |
| 嘌呤霉素 | Sigma | P9620 | 用于评估翻译水平（核糖体嘌呤霉素化） -用于评估应激颗粒与活跃翻译之间的关联 用水稀释至 10 mg/mL |
| 盐酸依米丁水合物 | Sigma | E2375 | 与嘌呤霉素联用以评估总体翻译水平 用于评估应激颗粒与活跃翻译之间的关联 -用水稀释至10 mg/mL |
| 环己酰亚胺（Cycloheximide, CHX） | Sigma | C4859 | 用于评估应激颗粒与活跃翻译之间的关联 用水稀释至 10 mg/mL |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Lonza / VWR | 95042-486 | 免疫荧光洗涤缓冲液 |
| 试剂级多聚甲醛，结晶状（PFA） | Sigma | P6148-500G | 在通风橱中，用热 PBS 配制 4% 溶液，搅拌至完全溶解 分装样品可在 -20 ℃ 保存 °数月 危险，使用通风橱 丢弃至特殊废物容器 |
| 甲醇，ACS级 | BDH / VWR | BDH1135-4LP | 预冷至 -20 °使用前置于 C 丢弃至特殊废物容器 |
| 正常马血清（NHS） | Thermo Fisher Scientific | 31874 | 用 PBS 稀释至 5% 加入叠氮化钠以用于4℃保存 °C 免疫荧光封闭液 |
| 乙醇，纯品，200 proof（100%），USP，KOPTEC | Decon Labs / VWR | 89125-188 | 用水稀释至70% |
| Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片 | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 小鼠抗 G3BP1 抗体（TT-Y） | Santa Cruz | sc-81940 | 4°C 保存 °C 1/100 稀释 |
| 兔抗 eIF4G 抗体（H-300） | Santa Cruz | sc-11373 | 4°C 保存 °C 1/250 稀释度 |
| 山羊抗 eIF3η (N-20) 抗体 | Santa Cruz | sc-16377 | eIF3η 也称为 eIF3b 4°C 保存 °C 1/250 稀释度 |
| 小鼠抗嘌呤霉素 12D10 抗体 | Millipore | MABE343 | 4°C 保存 °C 1/1,000 稀释度 |
| Cy2 AffiniPure 驴抗小鼠 IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 715-225-150 | 按制造商说明用水溶解’s 指示后，于 4 ℃ 保存 °C 1/250 稀释 |
| Cy3 AffiniPure 驴抗兔 IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-165-152 | 根据制造商说明用水溶解’s 指示后，于 4 ℃ 保存°C 1/2,500 稀释度 |
| Cy5 AffiniPure 驴抗山羊IgG（H+L） | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | 根据制造商说明用水溶解’s 指示后，于 4 ℃ 保存°C 1/250 稀释度 |
| Hoechst 33258 溶液 | Sigma | 94403-1ML | 孵育二抗 dH2O 中配制的 0.5 mg/mL 储存液20，避光保存 -4 ℃保存 °C |
| Cy3 链霉亲和素 | Jackson Immunoresearch | 016-160-084 | 按制造商说明用水溶解’s 指示操作，然后于 4 ℃ 保存 °C 1/250 稀释度 |
| oligo-(dT)40x 探针生物素化 | Integrated DNA Technologies (IDT) | / | 用水重悬至 100 ng/mL，分装后于 -20 ℃ 保存 °C 使用前用杂交缓冲液按1/50比例稀释 定制订单 |
| 杂交盒 | / | / | 使用任意储存载玻片盒，在底部加入湿润的滤纸以制作湿化 chamber - 使用前将盒子预热 |
| 20x SSC缓冲液 | Thermo Fisher Ambion | AM9763 | 用无RNase水（DEPC处理）稀释至2x SSC 室温保存 FISH 洗涤缓冲液 |
| PerfectHybPlus 杂交缓冲液 | Sigma | H7033-50ml | FISH 实验用封闭与探针孵育缓冲液 |
| 封片介质 | 自制 | / | 将5 g的 “冷可溶性” 聚乙烯醇（poly(vinyl alcohol)）溶于20 mL PBS中 经超声处理混匀，随后室温下搅拌过夜 加入5 mL甘油和0.2 mL 20%叠氮化钠，室温下搅拌16 h 20,000 g 离心 20 分钟，弃去大沉淀 分装黏稠液体，-20℃长期保存 °C，4℃下保存1周 °C |
| Parafilm "M" | Sigma | P7793-1EA | |
| 聚乙烯醇 | Sigma | P-8136-250G | 用于制备乙烯醇的试剂 |
| 甘油 | Sigma | G5516-100ML | 用于制备乙烯醇的试剂 |
| 叠氮化钠 | Fisher Scientific | S2002-5G | 封闭液和明胶的防腐剂 在水中配制20%的稀释液 |
参考文献
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Yamasaki, S., Anderson, P. Reprogramming mRNA translation during stress. Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).
- Buchan, J. R.
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