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细胞外基质的糖蛋白质组学：一种利用质谱进行完整糖肽分析的方法

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DOI：

10.3791/55674

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2017年4月21日

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1King's British Heart Foundation Centre, King's College London

本文内容

摘要

本文描述了一种用于制备心血管组织样本以进行质谱分析的方法，该方法能够实现：（1）分析细胞外基质（ECM）蛋白质组成；（2）鉴定糖基化位点；（3）对糖链形式进行组成表征。该方法经少量修改后，亦可应用于其他组织中细胞外基质的研究。

摘要

纤维化是许多心血管疾病的特征，与细胞外基质（ECM）分泌和沉积的加剧密切相关。通过蛋白质组学方法，我们此前已在心血管组织中鉴定出超过150种ECM及ECM相关蛋白。值得注意的是，许多ECM蛋白存在糖基化修饰。这种翻译后修饰会影响蛋白质的折叠、溶解性、结合能力及降解过程。我们开发了一种适用于完整糖肽后续液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析的ECM蛋白逐级提取与富集方法。该策略基于依次使用NaCl、用于组织去细胞化的SDS，以及用于ECM蛋白溶解的盐酸胍进行孵育。近年来LC-MS/MS技术的进步包括多种碎裂方法，例如高能碰撞解离（HCD）与电子转移解离（ETD）的联用，可实现对ECM蛋白糖肽的直接组成分析。本文中，我们描述了一种从组织样本中制备ECM的方法。该方法不仅可用于蛋白质谱分析，还可通过质谱分析对糖基化进行评估与表征。

引言

纤维化是许多疾病的显著特征。成纤维细胞增殖并分化为高度合成的表型，导致细胞外基质（ECM）的过度分泌和沉积1。即使初始损伤已消退，ECM 的过度沉积仍可能持续，从而导致器官功能受损。通过蛋白质组学方法，我们此前已在心脏组织中鉴定出超过 150 种 ECM 及 ECM 相关蛋白2,3。这些蛋白不仅包括结构蛋白，还包括基质细胞蛋白和蛋白酶，它们共同参与心脏的持续重塑与动态适应过程。值得注意的是，许多 ECM 蛋白存在糖基化修饰4。这种翻译后修饰（PTM）是指将糖残基添加至特定氨基酸位点，影响蛋白的折叠、溶解性、结合能力及降解过程5。

哺乳动物体内存在两种主要的糖基化类型。（1）N-糖基化发生在天冬酰胺残基（Asn）的羧酰胺氮上，其序列基序为 Asn-Xaa-Thr/Ser，其中 Xaa 可为除脯氨酸以外的任何氨基酸。（2）在 O-糖基化中，糖基连接在丝氨酸和苏氨酸残基（Ser、Thr）上，或较少情况下连接在羟脯氨酸和羟赖氨酸上。尽管 O-糖基化可出现在多种蛋白质中，但 N-糖基化仅限于分泌蛋白或膜蛋白的胞外结构域5。这使得 N-糖基化在研究细胞外基质（ECM）时成为一个有吸引力的靶点。

蛋白质组学为疾病中蛋白质变化的分析设立了新标准。迄今为止，大多数蛋白质组学研究集中于细胞内蛋白质6。这主要基于以下原因：首先，丰富的细胞内蛋白质会阻碍稀有细胞外基质（ECM）组分的鉴定，这一点在心脏组织中尤为关键，因为线粒体和肌原纤维蛋白质占该组织蛋白质总量的很大比例7；其次，完整的ECM蛋白质高度交联，难以溶解；最后，大量存在的翻译后修饰（即糖基化）会改变肽段的分子量、电荷及电泳特性，从而影响液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析中的分离与鉴定效果。近年来，我们开发并优化了一种适用于后续质谱（MS）分析的ECM蛋白质逐级提取与富集方法。该策略基于一系列连续的孵育步骤。

第一步使用 NaCl 进行，NaCl 是一种离子缓冲液，有助于提取与细胞外基质（ECM）相关联的、松散结合的 ECM 蛋白以及新合成的 ECM 蛋白。该步骤不含去垢剂，不引起蛋白质变性，不破坏细胞膜，且适用于后续的生物化学分析8。接着，使用十二烷基硫酸钠（SDS）实现去细胞化。在此步骤中，低浓度的 SDS 可确保细胞膜失稳并释放胞内蛋白，同时避免破坏更易溶解的非整合型 ECM 组分。最后，使用盐酸胍缓冲液（GuHCl）提取 ECM 蛋白。GuHCl 在从肌腱9、软骨10、血管11,12,13 和心脏2,3 等组织中提取高度交联的蛋白质和蛋白聚糖方面具有高效性。我们已将这种生化分级分离方法与液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）联用，用于研究心血管疾病中的 ECM 重塑过程2,3,11,12,13,14。质谱技术的最新进展包括新型裂解方法，例如高能碰撞解离（HCD）与电子转移解离（ETD）的联用，可实现对完整糖肽的直接分析3,15。

本文描述了一种用于质谱分析的细胞外基质（ECM）制备方法，该方法可用于分析蛋白质组成、鉴定糖基化位点以及表征糖链形式。与先前对ECM糖基化的分析16相比，该方法能够通过质谱技术以位点特异性的方式直接评估糖基化谱的组成变化。我们已将该方法应用于心血管组织，但经过少量修改后，也可用于其他组织样本中ECM的研究，从而为ECM生物学提供前所未有的深入见解。

方案

本研究获得了旺兹沃思当地研究伦理委员会（参考编号：06/Q0803/37）的批准，并获得了研究与开发办公室的机构批准。所有患者均签署了书面知情同意书。

1. 细胞外基质蛋白的提取

注意：本实验所用的人类心房组织来自体外循环手术期间心脏停搏后的心耳组织。所有样本均采集自英国伦敦圣乔治医院。所有组织样本必须在 -80 °C 下冷冻保存。请勿使用经甲醛等可交联蛋白质的固定剂保存的样本。

  1. 实验前预先配制所有提取缓冲液，按照 表1，以尽量缩短各提取步骤之间的时间。所有孵育均在温度受控的室温（RT）下进行。即， ~20 °C）以确保各次提取之间的一致性。
  2. 称取20–50 mg组织。若需提取多个样品，应逐个切割并称重，以避免组织完全解冻。使用解剖刀将组织切成3–4个小块。即， 2–3 mm），并将它们一同放入 1.5 mL 离心管中。
  3. 加入500 µL 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS；参见 表1 以及 材料表）并进行五次洗涤以最大限度减少血液污染。
  4. 提取步骤1：NaCl缓冲液孵育
    1. 用 PBS 洗涤后，将样品放入带螺口盖的 1.5 mL 管中。 加入 NaCl 缓冲液 （参见 表1) 按组织重量的10倍体积（v:w）加入。在室温下以最低转速涡旋振荡试管1小时即， 600 rpm
      注意：低速涡旋振荡对于避免此步骤中组织的机械性破坏至关重要。提取过程中使用泡沫适配器放置所有离心管。
    2. 将提取物转移至新离心管中，在 4°C 下以 16,000 x g 离心 10 分钟 °C. 将提取物于 −20 ℃ 保存 °C 保存备用。用新鲜的 NaCl 缓冲液短暂洗涤剩余的组织沉淀。使用相同类型的缓冲液（即， 100 µL NaCl缓冲液）进行洗涤，以防止提取出具有不同溶解度的其他蛋白质（即， 无法用 NaCl 提取的蛋白质。
    3. 洗涤后，确保完全去除缓冲液，以尽量减少与后续提取步骤中蛋白质成分的重叠。弃去用于洗涤的 NaCl 缓冲液。
      注意：缓冲液体积与组织重量的比例对于可重复的提取至关重要。NaCl 和 SDS 提取步骤采用 10:1（体积:重量）的比例，GuHCl 步骤采用 5:1 的比例，可在不使缓冲液饱和的情况下获得足够的蛋白量。蛋白浓度约为 1–2 µ克µ提取后L
  5. 提取步骤2：使用SDS缓冲液进行去细胞化
    1. 加入SDS缓冲液（表1) 为组织重量的十倍（体积:重量）；使用低浓度 SDS（即， 0.1%）至关重要，以避免脱细胞过程中细胞外基质（ECM）蛋白的丢失。在室温下以最低转速涡旋振荡试管至少16 h（即， 600 rpm
      注意：低速涡旋可最大限度减少对细胞外基质（ECM）的机械破坏。
    2. 将提取物转移至新管中，在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 10 分钟 °C；于 -20 ℃ 保存 °C 保存至使用。用预冷的 PBS 短暂洗涤剩余的组织沉淀 ddH2O 以去除 SDS。洗涤后确保完全移除液体。
  6. 提取步骤3：与GuHCl缓冲液孵育
    1. 加入 GuHCl 缓冲液（表1) 为组织重量的五倍（体积:重量）。在室温下以最大速度涡旋振荡管子 72 小时（即， 3,200 转/分钟）；剧烈涡旋有助于机械破坏细胞外基质。
    2. 将提取物转移至新离心管中，于16,000 × g条件下离心 × 4℃下，10分钟，g离心 °C，并在 -20 保存 °C，直至使用。

2. 蛋白质定量与沉淀

注意：由于含有去垢剂，SDS 缓冲液无法直接通过测量 280 nm 处的吸光度进行蛋白质定量。为确保定量结果的可重复性，应对所有蛋白质提取物使用比色法测定17。

  1. 定量分析。
    1. 使用适当的提取缓冲液对牛血清白蛋白（BSA）进行系列稀释，制备用于标准曲线的样品即， NaCl、SDS 或 GuHCl17. 在此期间，解冻样品提取物。
    2. 用提取缓冲液稀释样品，使浓度处于吸光度的线性范围内；1:10（v:v）的稀释比例可获得满意结果。用等体积的ddH₂O稀释GuHCl样品。2用于定量，因为比色法与高浓度不兼容 >4 M GuHCl
    3. 使用基于二辛可宁酸（BCA）的比色法测定17 （参见） 材料表），按照96孔板检测的制造商说明书进行操作；建议至少进行重复测量两次。
    4. 孵育30分钟后，在570 nm波长处测定吸光度，利用BSA标准曲线计算蛋白浓度17.
  2. 蛋白质沉淀
    1. 室温下解冻GuHCl提取物。分装10 µ将每份样品的蛋白质各取 g 置于新管中。如需进行直接糖肽分析，分装 50 µg. 加入10倍体积的乙醇，于-20℃孵育过夜 °C.
      注意：盐酸胍（GuHCl）与后续的酶促反应及大多数电泳应用不兼容。在去糖基化和胰蛋白酶消化前，必须去除盐酸胍。由于盐酸胍在乙醇中具有良好的溶解性，而蛋白质在乙醇中溶解度较低，因此可通过该性质有效去除盐酸胍，同时实现约98%的蛋白质回收率。18.
    2. 将样品在16,000离心 × 4℃下30分钟3000 × g离心 °C，吸去上清液，注意不要扰动沉淀的沉淀物。使用真空浓缩仪干燥沉淀物15分钟（参见 材料清单室温下
      注意：本实验步骤可在此暂停，将干燥后的沉淀物于 -20 ℃ 保存。 °C，直至使用。
    3. 可选地，进行凝胶电泳作为质量控制（QC，参见下文） 补充方法).

3. 用于评估N-糖基化位点占据率的连续去糖基化

  1. 在样品干燥期间（见步骤 2.2.2），根据说明配制含有去分支糖苷酶的去糖基化缓冲液， 表1。参见 材料表 有关产品详情。
  2. 加入10 µ每份样品中加入含有酶的去糖基化缓冲液 L。通过快速涡旋震荡并离心样品，确保沉淀充分重悬。
    注意：使用去分支酶去除单糖是后续彻底去除O-连接复杂糖链并促进PNGase-F进一步切割N-连接糖链的关键步骤。
  3. 在25℃下孵育2小时 °C，以便通过肝素酶II去除硫酸乙酰肝素。将温度升至37 °C，并在轻柔振荡条件下孵育36小时。
    注意：由于反应体积较小且孵育时间较长，应使用摇床培养箱，并将多个1.5 mL离心管紧密包裹后放入一个50 mL锥形管中，再将锥形管倾斜约45°置于培养箱内°.
  4. 36小时后，在16,000 x g离心1分钟 并蒸发 H2在室温下使用真空浓缩仪将样品中的 O 浓缩约 45 分钟。
  5. 用10 μL溶液重悬干燥的样品 µL of H218O 含有 50 U/mL 的 PNGase-F，可在脱氨反应中切割所有连接在天冬酰胺上的糖链。
    注意：生成的天冬氨酸带有2.98 Da的额外质量，提示在质谱分析中存在N-糖基化。
  6. 37℃孵育36小时 °在恒定振荡的培养摇床中于 C 下孵育。

4. 溶液中胰蛋白酶消化

注意：此步骤应同时针对未去糖基化（non-deglycosylated）样本即， 用于直接糖肽分析）以及去糖基化样品（即， 用于评估糖链占据情况。

  1. 使用 10 µ用于评估N-糖基化位点占据情况的总蛋白量（如前一步所示）。对于拟进行直接糖肽分析的样品，使用50 µ以 g 为蛋白质起始用量。
    注意：以下步骤以10 µg 蛋白。按比例扩大体积（即， 5 次，每次 50 µg）根据需要。
  2. 使用9 M尿素和3 M硫脲对每个样品等分试样中的蛋白质进行变性，使其终浓度分别为6 M尿素和2 M硫脲（例如， 对于 10 µL 样本，20 µL 的尿素/硫脲。
  3. 加入100 mM二硫苏糖醇（DTT，3.33 µL，终浓度：10 mM）。37℃孵育 °在240 rpm振荡条件下，于C中孵育1小时。
  4. 将样品冷却至室温，然后加入 0.5 M 碘乙酰胺（3.7 µL，终浓度：50 mM）。避光孵育1小时。
  5. 使用预冷的（-20 °C）丙酮 °C）加入6倍于样品体积的丙酮，在-20℃孵育样品过夜 °C. 在 4℃ 下以 14,000 × g 离心 25 分钟以沉淀 °C.
  6. 吸出上清液，注意不要扰动沉淀的蛋白沉淀物。使用真空浓缩仪在室温下干燥蛋白沉淀物30分钟。
  7. 重悬于 20 µ0.1 M 三乙基碳酸氢铵（TEAB）缓冲液（pH 8.2）1 L，含胰蛋白酶（0.01 µ克/µL）并在 37℃ 过夜消化 °C 和 240 转/分钟。
  8. 用10%三氟乙酸（TFA，2 µL，使其终浓度为1% TFA）。

5. 使用 C18 柱进行肽段纯化

注意：在消化后从肽混合物中去除干扰性污染物可减少离子抑制，提高信噪比和序列覆盖度。此步骤应同时适用于未去糖基化和去糖基化的样品。

  1. 使用 C18 离心板（参见材料表）上的树脂，每孔加入 200 µL 甲醇活化，并在 1,000 x g 条件下离心 1 分钟。
  2. 每孔加入 200 µL 含 80% 乙腈（ACN）和 0.1% 三氟乙酸（TFA）的水溶液（H2O）进行洗涤，在 1,000 x g 条件下离心 1 分钟。
  3. 每孔加入 200 µL 含 1% 乙腈（ACN）和 0.1% 三氟乙酸（TFA）的水溶液（H2O）进行平衡，在 1,000 x g 条件下离心 1 分钟。重复此步骤两次。
  4. 将第 4 步所得全部体积的样品加入含树脂的孔中，在 1,500 x g 条件下离心 1 分钟。将流出液重新加载一次，并重复离心步骤。
  5. 每孔加入 200 µL 含 1% 乙腈（ACN）和 0.1% 三氟乙酸（TFA）的水溶液（H2O）进行洗涤，在 1,500 x g 条件下离心 1 分钟。重复此步骤两次。
  6. 每孔使用 170 µL 含 50% 乙腈（ACN）和 0.1% 三氟乙酸（TFA）的水溶液（H2O）洗脱样品，在 1,500 x g 条件下离心 1 分钟。重复上一步操作，并合并收集的洗脱液。
  7. 在室温下使用真空浓缩仪干燥洗脱液，持续 2 小时。若不立即使用，将干燥后的样品保存于 -80 °C 直至使用。
    注意：仅用于蛋白质鉴定的去糖基化样品在此步骤后即可用于 LC-MS/MS 分析。此类样品无需进行第 6 和第 7 步。
  8. 将去糖基化样品在含 2% 乙腈（ACN）和 0.05% 三氟乙酸（TFA）的水溶液（H2O）中解冻并重悬，使最终蛋白浓度为 0.5 µg/µL。对于未去糖基化的样品，继续进行第 6 步以实现糖肽的直接分析。
  9. 可选：在使用串联质量标签（TMT）标记前对肽段进行过滤；参见补充方法中的肽段过滤步骤。

6. TMT标记（仅用于直接糖肽分析）

  1. 解冻后，用 50 µL 的 50 mM TEAB 重悬干燥的沉淀物，使其浓度达到 1 µg/µL。
  2. 用 41 µL 乙腈（ACN）重悬 TMT Zero（TMT0，参见材料表）试剂的 0.8-mg 西林瓶。请遵循制造商关于重悬的推荐方法。
  3. 按每 50 µg 肽对应 0.4 mg TMT0 的比例进行标记（即，50 µL 肽溶液加 20.5 µL TMT0）。室温孵育 1 小时。
  4. 通过加入 5% 羟胺终止标记反应，添加比例为 6:100（即，4.23 µL 的 5% 羟胺）。室温孵育 15 分钟。
  5. 使用真空浓缩仪在室温下干燥 TMT0 标记的肽样品 1 小时。然后用 10 µL ddH2O 重悬。
    注意：由于含有糖链残基，糖肽的分子量高于非糖基化肽。TMT0 可增加糖肽的电荷态，从而降低其相对质荷比（m/z），有利于电子转移解离（ETD）碎裂。

7. 糖肽富集

  1. 使用试剂盒中提供的反应缓冲液（参见 材料清单).
  2. 加入50 µ10 微升结合缓冲液 µ步骤6.5中的L样品。涡旋混合糖捕获树脂溶液至均一状态。采用基于两性离子亲水相互作用液相色谱（ZIC-HILIC）的捕获方法15.
  3. 分装 50 µ将树脂悬液各 1.5 mL 分装至新的 1.5 mL 离心管中。在 2,500 × g 条件下离心 1 分钟，弃去上清液。加入 60 µ样本的 L（即， 将样品与结合缓冲液加入含有树脂沉淀的离心管中。使用移液器混匀，并在室温下以1,200 rpm振荡孵育20分钟。
  4. 在 2,000 × g 下离心 2 分钟，将上清液转移至新管中。保留原管。加入 150 µ将 1 L 洗涤缓冲液加入树脂管中。使用移液器混匀，并在室温下以 1,200 rpm 振荡孵育 10 分钟。
  5. 在2,500 × g下离心2分钟。将上清液转移至同一试管（步骤7.4中的试管）。重复洗涤步骤两次。
  6. 加入75 µ加入洗脱缓冲液，用移液器混匀。室温下以1,200 rpm振荡5分钟，然后以2,500 × g离心2分钟。将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。重复洗涤步骤，随后将洗脱液上清转移至同一管中。
  7. 将含有洗脱液的管子离心即， 以2,500 × g离心2分钟，收集上清液。将上清液转移至新管中，以确保彻底去除前步残留的树脂。
  8. 将总共 150 µL的洗脱液，使用真空浓缩仪在室温下浓缩约2小时。将干燥后的糖肽重悬于15 µL 的 2% 乙腈和 0.05% 三氟乙酸水溶液2O.
  9. 进行 LC-MS/MS 分析，采用 HCD 碎裂以分析 ECM 蛋白组成，并采用 HCD 与 ETD 碎裂相结合的 LC-MS/MS 进行糖肽表征。参见第 8 节。

8. 质谱分析

  1. 使用 HCD 碎裂法进行 LC-MS/MS 分析 ECM 蛋白质组成；具体细节参见补充方法。
  2. 使用 HCD 和 ETD 碎裂法进行 LC-MS/MS 以表征糖肽（详见补充方法）；富集后的样品应与未经富集的原始材料进行比较15。
    注意：补充方法中提供了用于间接糖肽分析、直接糖肽分析及数据库搜索的 LC-MS/MS 方法的详细描述。建议希望利用质谱技术表征 ECM 蛋白质和聚糖组成的研究人员参考以往的出版物3,11,15。

结果

本方案的示意图流程见图1。

细胞外基质提取方案

可通过将各提取物的等分试样在Bis-Tris丙烯酰胺凝胶上电泳，并使用银染显色来监测提取效率。图2A展示了依次提取后NaCl、SDS和GuHCl提取物之间的互补性。该质量控制步骤可用于识别样品质量的潜在问题，例如蛋白质过度降解。提取后，细胞外基质糖蛋白在GuHCl提取物中含量丰富（图2B）。

去糖基化

为评估去糖基化效率，应同时运行未去糖基化的对照样本。去糖基化时间必须适当，以实现糖残基的完全且均一的去除，如图3A所示。图3B展示了一个代表性示例，即通过添加用于去除糖胺聚糖（GAG）的酶以及针对较小N-和O-连接寡糖的去糖基化酶，实现高效去糖基化的样本。

糖蛋白质组学

NxT/S序列基序占据情况的评估方案在质谱分析后（图3C）可提高细胞外基质糖蛋白的蛋白质序列覆盖度，并可用于糖蛋白存在的初步筛选。这有助于缩短糖肽的搜索时间，因为数据库可定制为仅包含先前已鉴定的糖蛋白。采用HCD-ETD串联碎裂技术对连接在细胞外基质糖蛋白上的寡糖进行鉴定和组成表征。图4A展示了去糖基化后带有18O标记的肽段所获得的代表性质谱图（间接糖肽分析）。图4B为来自细胞外基质提取物完整糖肽分析后获得的质谱图的代表性示例（直接糖肽分析）。

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图 1：方法概述。（A）在对细胞外基质（ECM）蛋白进行连续富集后，对去糖基化的提取物进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。（B）或者，对未去糖基化的ECM提取物进一步富集糖肽。请点击此处查看此图的放大版本。

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图 2：细胞外基质蛋白的提取。（A）顺序提取程序（“English Quickstep”）获得的三种不同提取物在蛋白质组成上具有互补性。SDS 提取物富含细胞内蛋白，而 GuHCl 提取物则包含大部分细胞外基质（ECM）蛋白。成功的组分分离可通过不同的银染图谱直观显示。（B）诸如核心蛋白聚糖（decorin）、双糖链蛋白聚糖（biglycan）和mimecan等小分子富含亮氨酸的蛋白聚糖主要存在于 GuHCl 提取物中，在 SDS 和 NaCl 提取物中含量极少。请点击此处查看本图的放大版本。

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图3. 糖基化分析。（A）完全去糖基化需要适当的孵育时间。该示例展示了从糖蛋白decorin中去除糖胺聚糖链过程中孵育时间的影响。（B）细胞外基质（ECM）糖蛋白带有长而重复的糖胺聚糖链以及短而多样的N-和O-连接寡糖。每张免疫印迹图中的第1道为未经处理的心脏组织提取物，第2道为经糖胺聚糖消化酶处理的提取物，第3道样品 additionally 含有去除N-和O-连接寡糖的酶。Galectin-1未被糖基化，因此其蛋白大小无迁移。改编自Lynch M, et al.4（C）在LC-MS/MS分析中，使用PNGase-F并在H218O存在下处理的样品相比未去糖基化的样品具有更高的序列覆盖率（%，右侧所示）。深绿色区域表示LC-MS/MS检测到的序列覆盖范围。红色虚线表示糖基化位点，数字表示其氨基酸位置。图4详细展示了在Asn211（N，加粗高亮）位点decorin糖基化的检测结果。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4. 通过质谱进行糖肽分析。（A）对富含细胞外基质（ECM）的提取物采用鸟枪法蛋白质组学策略，可通过NxT/S序列基序中脱酰胺的天冬酰胺并结合18O标记来鉴定糖肽。图中示例为一个含有先前发生糖基化的Asn211的 decorin 肽段的HCD二级质谱图。所获得的数据可用于构建细胞外基质糖蛋白的定制化数据库。（B）采用HCD-ETD串联碎裂技术分析富集后的糖肽ECM提取物。ETD二级质谱可用于表征糖链组成。请点击此处查看该图的放大版本。

A. 储存液
DTT（二硫苏糖醇，C4H10O2S2)100 mM DTT in ddH₂O2O.1
EDTA（乙二胺四乙酸，C10H16N2O8)250 mM EDTA 溶于 ddH₂O2O，pH 8.0。
盐酸胍（GuHCl，CH6ClN3)8 M GuHCl 溶于 ddH₂O2O.
IAA（碘乙酰胺，C2H4INO500 mM IAA 溶于 ddH₂O2O.1,2
Na醋酸盐（醋酸钠，C2H3NaO2)1 M 醋酸钠，溶于ddH₂O2O，pH 5.8。
氯化钠（NaCl） 1 M NaCl 溶于 ddH₂O2O.
磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）2H2PO4)1 M 磷酸氢二钠溶液 ddH2O，pH 6.8。
SDS（十二烷基硫酸钠，NaC12H25SO4)1% SDS（35 mM）溶于ddH₂O2O.3
TFA（三氟乙酸，C2HF3O2)10% TFA (1.2 M)  在 ddH₂O 中2O.
TEAB（三乙基碳酸氢铵，C7H17一氧化氮3)1 M TEAB 溶于 ddH₂O，pH 8.5
硫脲（硫脲，CH4N2SddH₂O 中的 3 M 硫脲2O.
Tris-HCl（Tris-盐酸盐（NH11C4O3[HCl]ddH₂O 中的 100 mM Tris–HCl2O，pH 7.5。
尿素（Urea, CH4N2O)ddH₂O 中含 9 M 尿素2O.
B. 反应缓冲液
C18 净化平衡缓冲液1% 乙腈，0.1% 三氟乙酸溶于ddH₂O2O
C18 净化柱洗涤缓冲液80% 乙腈，0.1% 三氟乙酸水溶液2O
C18 净化洗脱缓冲液50% 乙腈，0.1% 三氟乙酸溶于ddH₂O2O
去糖基化缓冲液（4x）600 mM NaCl 和 200 mM Na磷酸盐，溶于ddH₂O2O，pH 6.8。
GuHCl 缓冲液44 M 盐酸胍，50 mM 醋酸钠和 25 mM EDTA 溶于 ddH₂O2O，pH 5.8。使用前按1:100（v:v）加入蛋白酶抑制剂混合物。
NaCl 缓冲液40.5 M NaCl，10 mM Tris-HCl 和 25 mM EDTA 溶于 ddH₂O2O，pH 7.5。使用前按1:100（v:v）加入蛋白酶抑制剂混合物。
PBS（1×）1.7 mM KH2PO4，5 mM Na2HPO4，150 mM NaCl，pH 7.4。使用前加入25 mM EDTA和1:100（v:v）的蛋白酶抑制剂混合物。
4x 样品缓冲液100 mM Tris，2% SDS，40% 甘油，0.02% 溴酚蓝溶于ddH₂O2O，pH 6.8。使用前加入10% β-mercaptoethanol。
SDS缓冲液4 0.1 % SDS 和 25 mM EDTA 溶于 ddH₂O2O. 使用前按1:100（v:v）比例加入蛋白酶抑制剂混合物。
C. 酶
硫酸软骨素酶ABC5 0.5 U/mL，置于去糖基化缓冲液（1x）中
角蛋白酶50.1 U/mL，置于去糖基化缓冲液（1x）中
肝素酶 II50.1 U/mL，置于去糖基化缓冲液（1x）中
α2-3,6,8,9-神经氨酸酶（唾液酸酶）50.025 U/mL，置于去糖基化缓冲液（1x）中
β1,4-半乳糖苷酶50.015 U/mL，置于去糖基化缓冲液（1x）中
βN-乙酰氨基葡萄糖苷酶50.25 U/mL，置于去糖基化缓冲液（1x）中
内切-α-N-乙酰半乳糖胺酶（O-糖苷酶）50.013 U/mL，置于去糖基化缓冲液（1x）中
PNGase-F（N-糖苷酶-F）650 U/mL in H218O
胰蛋白酶0.01 µg/µL 在TEAB缓冲液中
表格说明。
1 将储备液在 -20 °C 冻存20 °C.
2 IAA 应避光保存。
3 SDS 在室温下极易结晶 < 20 °C为了促进1% SDS（储存液）的溶解，用热水冲洗缓冲液使其升温。 
4 提取缓冲液可在室温下保存。使用前按说明加入广谱蛋白酶抑制剂混合物。
5 这些酶应在首次去糖基化步骤中加入。
6 PNGase-F 仅应在第二次去糖基化步骤中加入。

表1：储备溶液、反应缓冲液和酶。 本表格列出了在质谱分析前提取及后续处理（包括酶解）心脏细胞外基质蛋白所需的每种储备溶液和反应缓冲液的组成。

讨论

近年来，本实验室已对该蛋白质组学方案进行了优化。本文中我们使用了心脏组织，但该方法应用于其他组织时可能仅需进行少量调整。例如，提取方案需要考虑组织的细胞含量。与血管组织相比，心脏组织的细胞含量较高。使用血管组织时，SDS浓度可更低（即 0.08%），去细胞化时间也更短（即 4 h）11,12,13。在LC-MS/MS分析细胞外基质（ECM）组成时，去糖基化酶的使用至关重要。然而，不同组织类型所需的孵育时间需相应调整。例如，当使用富含基底膜蛋白（如 agrin、perlecan）的皮肤样本时，肝素酶II在25 °C下需要更长的孵育时间（未显示数据）。直接糖肽分析可在培养细胞的条件培养基上进行15。对于这种简化的亚蛋白质组分析，可能无需富集步骤。与GuHCl提取物类似，NaCl提取物也可通过少量修改用于糖蛋白质组学分析。其他用于富集ECM蛋白的提取方案也可经调整后用于表征ECM糖肽19,20。

糖基化是最复杂的翻译后修饰（PTM）5。糖肽的间接鉴定可通过检测在 NxT/S 序列模体中掺入18O 的脱酰胺化天冬酰胺（Asn）实现。在其他位置出现的脱酰胺化 Asn 可能构成假阳性结果。同样，在蛋白质本体论背景下必须考虑 N-糖基化：含有 NxT/S 序列模体的胞内蛋白并不会发生糖基化，但仍可能产生假阳性信号。由于当前的搜索算法无法仅针对预定义序列（即 NxT/S 位点的 Asn）筛选翻译后修饰，因此需要对数据进行人工筛选。这些位点糖基化存在与否的鉴定结果可在疾病样本与对照样本之间进行比较。目前尚无类似于 PNGase F 酶的工具可用于 O-去糖基化（即 在苏氨酸或丝氨酸上引入质量偏移）。因此，O-糖基化的鉴定仅限于直接糖肽分析。直接糖肽分析可用于获取连接在蛋白质上的糖基组成信息，但无法提供糖链的结构信息。此外，糖链的组成是糖链合成及其分泌后加工过程的最终结果。

我们用于细胞外基质（ECM）蛋白的三步提取法（“English Quickstep”）6 已成功实现对多种心血管组织中 ECM 的表征。如其他文献所述6，为获得简化的 ECM 蛋白质组，需将组织分步提取成多个组分。否则，细胞内蛋白会引入过宽的蛋白丰度动态范围，从而阻碍低丰度 ECM 蛋白的鉴定。此外，细胞内蛋白携带 O-糖基化修饰5，这将干扰 ECM 糖肽的富集及后续质谱分析。其他研究者曾采用类似的提取方法用于表征肺21 和软骨组织10，但并未深入分析糖基化修饰。以往对糖基化的分析主要集中于糖基化位点的鉴定，且需将糖链从蛋白骨架上切除，因而无法评估 O-糖基化22,23。凝集素芯片和化学富集技术可根据结合特异性用于评估生物样本中糖链类型的组成，但这些方法无法将特定糖链类型归因于具体蛋白24，也不能确定糖基化位点。

最初，我们在进行细胞外基质（ECM）蛋白质的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析前采用凝胶电泳。尽管凝胶分离有助于获得适合LC-MS/MS分析的简化蛋白组分，但最新的仪器已具备更快的扫描速度，因此可省略电泳分离步骤。这一改进还带来额外优势：那些在凝胶顶部滞留的大分子ECM蛋白能够更高效地被分析。然而，完整蛋白质的分子量（Mw）信息将因此丢失。在PNGase F去糖基化前进行蒸发步骤，可确保完全去除普通H2O，以最大限度减少假阴性结果。糖残基（即 可变的糖链质量）会干扰液相色谱的分离效果，并影响后续的质谱/质谱（MS/MS）肽段鉴定。对于不专注于糖基化研究的ECM蛋白组学分析，也建议采用广谱去糖基化方案。

蛋白质组学可以为细胞外基质（ECM）提供前所未有的深入见解。除了提供结构支持外，连接在ECM上的糖链对于宿主与病原体相互作用、细胞间通讯以及免疫应答均具有重要作用。25, 即 器官移植后的同种异体移植物排斥反应。糖蛋白质组学将成为糖生物学中的一项重要工具。

致谢

JBB 是英国心脏基金会伦敦国王学院中心的职业发展研究员。MM 是英国心脏基金会的高级研究员（FS/13/2/29892）。本研究得到了奥地利研究促进署 FFG 的卓越计划（卓越技术 Competence Centers for Excellent Technologies - COMET）的支持：“血管衰老卓越研究中心——蒂罗尔，VASCage”（K-项目编号 843536），以及由盖伊医院和圣托马斯国家医疗服务体系基金会信托、伦敦国王学院与国王学院医院合作建立的英国国家健康研究所（NIHR）生物医学研究中心的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A. 化学试剂
乙腈，质谱级 （乙腈，C2H3N)Thermo Scientific511015.2-5.8，6.2，7.11，补充 2、3、4
蛋白酶抑制剂混合物Sigma-AldrichP83401.3,  1.4.1, 1.5.1, 1.6.1
磷酸氢二钠（Na2H2PO4)Sigma-AldrichS79073.1
二硫苏糖醇（DTT，C4H10O2S2)Sigma-AldrichD06324.3
乙二胺四乙酸（EDTA，C10H16N2O8)Sigma-AldrichE98841.3,  1.4.1, 1.5.1, 1.6.1
乙醇（C2H6O)VWR437433T2.2.1
盐酸胍（GuHCl，CH6ClN3)Sigma-AldrichG32721.6.1
甘油（C3H8O3)阿科斯有机158920025补充材料 1.1
H2O LC-MS CromasolvSigma-Aldrich39253-1L-R在整个实验方案中
H218O中国台湾日氧FO3-00273.5
羟胺（HA, H3无Sigma-Aldrich4678046.4
碘乙酰胺（IAA, C2H4INOSigma-AldrichA32214.4
磷酸盐缓冲液（PBS），10倍浓缩液Lonza512261.3
乙酸钠（C2H3NaO2)Sigma-AldrichS75451.6.1
氯化钠（NaCl）Sigma-AldrichS98881.4.1, 3.2
十二烷基硫酸钠（SDS，NaC12H25SO4)Sigma-Aldrich4661431.5.1
三乙胺碳酸氢盐（TEAB, C7H17无3)Sigma-Aldrich112684.7, 6.1
三氟乙酸（TFA，C2心力衰竭3O2)Sigma-AldrichT622004.8，5.2-5.8，7.11，补充材料2，3
硫脲（CH4N2S)Sigma-AldrichT86564.2
Tris-盐酸（Tris-HCl，NH11C4O3[HCl]Sigma-AldrichT32531.4.1，增刊 1.
尿素（CH4N2O)Sigma-AldrichU12504.2
名称公司货号评论
B. 酶
α2-3,6,8,9-神经氨酸酶（唾液酸酶）EDM Millipore362280 (KP0012)3.1
β1,4-半乳糖苷酶EDM Millipore362280 (KP0004)3.1
β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶EDM Millipore362280 (KP0013)3.1
Chondroitinase ABCSigma-AldrichC36673.1
内切-α-N-乙酰半乳糖胺酶（O-糖苷酶）EDM Millipore362280 (KP0011)3.1
肝素酶IISigma-AldrichH65123.1
角蛋白酶Sigma-AldrichG69203.1
PNGase-F（N-糖苷酶 F）EDM Millipore362280 (KP0001)3.5
胰蛋白酶Thermo Scientific900574.7
名称公司目录编号评论
C. 试剂盒
30 kDa 分子量截留值离心过滤器 Amicon，Millipore102567445.9，增刊2
Macro SpinColumn C-18，96孔板哈佛仪器74-56575.1
NuPAGE Novex BisTris 丙烯酰胺凝胶赛默飞世尔科技NP0322PK2补充材料1
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒Thermo Scientific232272.1.3
ProteoExtract 糖肽富集试剂盒默克密理博721037
串联质谱标签 0（TMT0)赛默飞世尔科技9000676.2, 6.3
名称公司货号评论
D. 仪器与软件
Acclaim PepMap100 C18 捕获柱，5 mm x 300 µ米，5 µ米，100 Å赛默飞世尔科技160454补充材料 3，4
Acclaim PepMap100 C18，50 cm × 75 µ米，3 µ米，100 Å赛默飞世尔科技164570补充材料3
Byonic 搜索引擎蛋白质组学指标版本 2.9.30增刊 5
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano赛默飞世尔科技n/a补充材料 3，4
EASY-Spray 离子源 赛默飞世尔科技ES081增刊 4
EASY-Spray PepMap RSLC C18  50 cm × 75 µ米，2 μ米，100 ÅThermo ScientificES803补充材料 4
Mascot 搜索引擎基质科学版本 2.3.01补充材料 3
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 质谱仪Thermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMBHQ补充材料 4
Proteome Discoverer 软件赛默飞世尔科技版本 2.1.1.21增刊 3, 5
Picoview 纳喷雾离子源新目标550补充材料3
Q Exactive HF 质谱仪Thermo ScientificIQLAAEGAAPFALGMBFZ增刊3
Savant SpeedVac 浓缩仪赛默飞世尔科技SPD131DDA2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11
Scaffold 软件蛋白质组学软件 版本 4.3.2补充材料3

参考文献

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