寡肽竞争法测定磷酸化位点

摘要

肽竞争实验在多种分子和免疫学实验中被广泛应用。本文描述了一种详细的肽竞争实验方法 体外 寡肽竞争性激酶检测及其相关验证程序，可用于发现特异性磷酸化位点。

摘要

蛋白质在特定位点的磷酸化决定了其构象以及与其他分子的相互作用，因此影响细胞的生物学功能和特性。目前，发现磷酸化位点最常用的方法是液相色谱-质谱联用（LC/MS）分析，该方法具有快速且灵敏的优点。然而，在片段化过程中，磷酸基团相对不稳定，常从磷酸化肽段上脱落，导致出现假阴性信号。在此类情况下，传统的 体外 使用定点突变进行激酶活性检测会更加准确，但该方法费时且工作量大。因此，采用肽段竞争的替代方法可能更具优势。5'腺苷单磷酸激活的蛋白激酶（AMPK）的共识识别基序已有明确界定。¹ 并使用位置扫描肽库实验进行了验证²因此，可通过肽段竞争实验预测并验证AMPK对新底物的磷酸化位点。在本报告中，我们详细描述了相关步骤与操作流程 体外 通过展示AMPK介导的核因子红系2相关因子2（Nrf2）磷酸化，进行寡肽竞争性激酶活性检测。为验证磷酸化位点，我们进行了连续的 体外 使用位点特异性突变体进行激酶活性检测。总体而言，多肽竞争实验提供了一种筛选多个潜在磷酸化位点的方法，并可用于鉴定需通过磷酸化位点突变体进一步验证的位点。

引言

特定残基上的蛋白质磷酸化在多种细胞过程中发挥着重要作用。因此，要理解信号转导网络，就必须鉴定具体的磷酸化位点。此外，磷酸化位点决定了对蛋白质功能的影响，因为蛋白质内的各个结构域具有不同的结构和功能。核因子红系2相关因子2（Nrf2）是一种关键的抗氧化转录因子，其活性通过在不同位点的磷酸化实现双向调控。我们的研究集中于催化Nrf2磷酸化的激酶。Nrf2针对氧化应激的应答反应迅速，主要通过丝氨酸40位点的磷酸化实现，该过程由蛋白激酶C（PKC）-δ介导，从而激活Nrf2^3,4。相反，Fyn则催化Nrf2在酪氨酸568位点的抑制性磷酸化，以实现对其活性的严格调控⁵。

发现磷酸化位点最常用的方法是液相色谱-质谱联用（LC/MS）分析。该方法可快速、高灵敏度地生成磷酸化位点定位数据；然而，其存在若干技术局限性，常产生假阴性信号。LC/MS分析中经常出现序列覆盖度低的问题。为鉴定磷酸化位点，需要获得蛋白质最大氨基酸覆盖度的信息⁶。在消化步骤中，使用多种蛋白酶对目标蛋白进行蛋白水解，可能有助于提高序列覆盖度。另一个阻碍磷酸化残基鉴定的因素是丝氨酸和苏氨酸磷酸化肽段中磷酸基团容易丢失，这一现象较为常见^6,

方案

1. 安全

警告：本实验方案使用[γ-³²P]-ATP来评估AMPK活性。磷-32是一种放射性同位素，主要释放β射线。由于β粒子的尺寸极小，可轻易穿透衣物和皮肤。外部或内部暴露于β射线均可能对人体健康造成危害，包括引起皮肤灼伤和组织损伤。

1. 进行所有需要使用[γ-³²使用适当的防护措施（如丙烯酸防护罩）处理放射性标记的ATP。
2. 确保所有人员在进行各项操作时均配备电子个人剂量计（EPD），以监测有害辐射暴露程度。
3. 仅在完成适当培训并获得监管批准后，方可操作开源放射源。
   注意：此处所有实验均在首尔国立大学完成开源辐射使用培训，并获得韩国政府批准（nssc.go.kr/nssc/en）后进行。
4. 根据当地法规处理放射性废物。
   注意：此处为环境保护研究所的指示 & 遵循了首尔国立大学的安全规范。以下是美国和欧洲部分国家监管机构的列表：美国，美国核管理委员会（http://www.nrc.gov/）；英国，健康与安全执行局（HSE）（http://www.hse.gov.uk）；法国，核安全局（Autorité de sûreté nucléaire）（https://www.asn.fr/）；德国，联邦环境、自然保护、建筑和核安全部（BMU）（http://www.bmu.de）。

结果

图1 和 图2 展示先前已发表论文中重复实验的结果⁸. 合成三种不同的10个残基寡肽，分别模拟AMPK潜在的靶位点（#1，148-157，包含Ser153；#2，330-339，包含Ser335；#3，553-562，包含Ser558），并将其用作竞争剂 体外 激酶活性检测。在寡肽#3存在下，AMPK对Nrf2的磷酸化作用显著减弱。图1）。接下来，通过定点突变实验验证肽模拟物实验的结果。鉴于寡肽#3对AMPK介导的Nrf2磷酸化的抑制作用（图1），我们构建了S558A-Nrf2突变体。通过使用 体外 AMPK激酶活性检测。Nrf2的单个氨基酸替换（558位丝氨酸→丙氨酸）阻止了AMPK对Nrf2的磷酸化，表明AMPK在Ser558位点直接磷酸化Nrf2。.......

讨论

作为一种简单且便捷的方法来评估AMPK介导的预测磷酸化位点的真实性，本文描述了一种in vitro激酶活性检测方法，该方法可利用竞争性肽段发现特异性磷酸化位点，并通过位点特异性突变体进行验证。来自in vitro竞争性AMPK活性检测的代表性数据与使用定点突变蛋白的实验结果一致，表明肽段竞争检测是确定磷酸化位点的有效工具。该方法还曾用于鉴定PKCδ特异性磷酸化位点的研究中，PKCδ可在丝氨酸40位点磷酸化Nrf2³。由于肽段可与蛋白质发生竞争性结合，该原理也可应用于in vitro GST pull-down实验，以鉴定结合基序^10,11。此外，这种肽模拟方法也可能适用于鉴定其他翻译后修饰，例如赖氨酸残基的乙酰化修饰。

使用本方案时，某些疏水性多肽可能难以溶解。如果多肽在激酶缓冲液中不溶，可尝试将其溶于20% DMSO中。对于极疏水的多肽，应首先尝试将其溶于100%.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEPES	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	15630
MgCl2	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	208337
EGTA	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	E3889
DTT	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	D9779
β-甘油磷酸	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	G9422
Na3VO4	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	450243
蛋白酶抑制剂混合物	Calbiochem，英国诺丁汉	539134
ATP	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	A2383
AMP	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	A1752
AMPK	Upstate Biotechnology，美国纽约州莱克普拉西德	14-840
Nrf2（野生型）	Abnova，中国台湾台北市	H00004780-P01
[γ-32P]-ATP	PerkinElmer Life and Analytical Sciences，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	NEG502A
EZblue 染色试剂	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	G1041
Pfu turbo DNA 聚合酶	Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉	600250
dNTP 混合物	Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉	200415-51	避免反复冻融
DpnI	New England Biolabs，美国马萨诸塞州伊普斯威奇	R0176S
LB 培养基	Duchefa Biochemie BV，荷兰哈勒姆	L1704
氨苄青霉素	Affymetrix，美国加利福尼亚州圣克拉拉	11259
低电渗琼脂糖	iNtRON Biotechnology，韩国城南	32034
HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit	Real Biotech Corporation，中国台湾	QDF100
考马斯亮蓝 R-250	Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫克力士	161-0400
牛血清白蛋白	Bovogen Biologicals，澳大利亚维多利亚州	BSA100
谷胱甘肽 Sepharose 4B	GE Healthcare，美国马萨诸塞州马尔伯勒	17-0756-01
冰醋酸	Duksan 纯化学公司，韩国安山
甲醇	Daejung Chemicals & Metals，韩国始兴	5558-4410
[header]
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare，美国马萨诸塞州马尔伯勒	28-9558-09
SDS-PAGE 试剂盒	Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫克力士	1658001FC
真空泵	Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫克力士	165-178
凝胶干燥仪	Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫克力士	165-1746
摇床	FINEPCR，韩国首尔	CR300	该仪器用于洗涤步骤
PCR 仪	Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫克力士	T100
培养摇床	N-BIOTEK，韩国京畿道	NB-205L
微量离心机	LABOGENE，韩国首尔	1730R
层析柱	Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫克力士	732-1010