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方法文章

寡肽竞争法测定磷酸化位点

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DOI：

10.3791/55708

⸱

2017年5月18日

 ,  ,  ,  , 
1College of Pharmacy and Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Seoul National University, 2College of Pharmacy and Institute of Pharmaceutical Science and Technology, Hanyang University

本文内容

摘要

肽竞争实验在多种分子和免疫学实验中被广泛应用。本文描述了一种详细的肽竞争实验方法 体外 寡肽竞争性激酶检测及其相关验证程序，可用于发现特异性磷酸化位点。

摘要

蛋白质在特定位点的磷酸化决定了其构象以及与其他分子的相互作用，因此影响细胞的生物学功能和特性。目前，发现磷酸化位点最常用的方法是液相色谱-质谱联用（LC/MS）分析，该方法具有快速且灵敏的优点。然而，在片段化过程中，磷酸基团相对不稳定，常从磷酸化肽段上脱落，导致出现假阴性信号。在此类情况下，传统的 体外 使用定点突变进行激酶活性检测会更加准确，但该方法费时且工作量大。因此，采用肽段竞争的替代方法可能更具优势。5'腺苷单磷酸激活的蛋白激酶（AMPK）的共识识别基序已有明确界定。1 并使用位置扫描肽库实验进行了验证2因此，可通过肽段竞争实验预测并验证AMPK对新底物的磷酸化位点。在本报告中，我们详细描述了相关步骤与操作流程 体外 通过展示AMPK介导的核因子红系2相关因子2（Nrf2）磷酸化，进行寡肽竞争性激酶活性检测。为验证磷酸化位点，我们进行了连续的 体外 使用位点特异性突变体进行激酶活性检测。总体而言，多肽竞争实验提供了一种筛选多个潜在磷酸化位点的方法，并可用于鉴定需通过磷酸化位点突变体进一步验证的位点。

引言

特定残基上的蛋白质磷酸化在多种细胞过程中发挥着重要作用。因此，要理解信号转导网络，就必须鉴定具体的磷酸化位点。此外，磷酸化位点决定了对蛋白质功能的影响，因为蛋白质内的各个结构域具有不同的结构和功能。核因子红系2相关因子2（Nrf2）是一种关键的抗氧化转录因子，其活性通过在不同位点的磷酸化实现双向调控。我们的研究集中于催化Nrf2磷酸化的激酶。Nrf2针对氧化应激的应答反应迅速，主要通过丝氨酸40位点的磷酸化实现，该过程由蛋白激酶C（PKC）-δ介导，从而激活Nrf23,4。相反，Fyn则催化Nrf2在酪氨酸568位点的抑制性磷酸化，以实现对其活性的严格调控5。

发现磷酸化位点最常用的方法是液相色谱-质谱联用（LC/MS）分析。该方法可快速、高灵敏度地生成磷酸化位点定位数据；然而，其存在若干技术局限性，常产生假阴性信号。LC/MS分析中经常出现序列覆盖度低的问题。为鉴定磷酸化位点，需要获得蛋白质最大氨基酸覆盖度的信息6。在消化步骤中，使用多种蛋白酶对目标蛋白进行蛋白水解，可能有助于提高序列覆盖度。另一个阻碍磷酸化残基鉴定的因素是丝氨酸和苏氨酸磷酸化肽段中磷酸基团容易丢失，这一现象较为常见6,7。不稳定的磷酸基团常在磷酸肽的碎裂过程中脱落7。寻找磷酸化位点的第二种方法是使用肽微阵列技术。可通过包含目标蛋白衍生肽片段的微阵列芯片来筛选激酶作用位点。然而，由于微阵列芯片的制备与检测需要特殊设备，肽微阵列方法被认为耗时且昂贵。

为了克服这些挑战，一种 体外 寡肽竞争性激酶检测可用于已知识别基序的蛋白激酶研究。若某激酶的保守识别基序已被确定，则可据此预测候选底物蛋白的潜在磷酸化位点，并验证这些位点的真实性。验证该过程最有力的方法是证明：在将预测位点的残基突变为非磷酸化氨基酸后，该突变蛋白的磷酸化作用被完全阻断。即， 丝氨酸或苏氨酸突变为丙氨酸；酪氨酸突变为苯丙氨酸）。然而，突变蛋白的制备与分离耗时较长。在研究初期阶段，可采用竞争性肽段激酶活性检测作为替代方法，该方法操作简便、直接。本文中，我们描述了一种 体外 多肽竞争实验及磷酸化位点的验证

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方案

1. 安全

警告：本实验方案使用[γ-32P]-ATP来评估AMPK活性。磷-32是一种放射性同位素，主要释放β射线。由于β粒子的尺寸极小，可轻易穿透衣物和皮肤。外部或内部暴露于β射线均可能对人体健康造成危害，包括引起皮肤灼伤和组织损伤。

  1. 进行所有需要使用[γ-32使用适当的防护措施（如丙烯酸防护罩）处理放射性标记的ATP。
  2. 确保所有人员在进行各项操作时均配备电子个人剂量计（EPD），以监测有害辐射暴露程度。
  3. 仅在完成适当培训并获得监管批准后，方可操作开源放射源。
    注意：此处所有实验均在首尔国立大学完成开源辐射使用培训，并获得韩国政府批准（nssc.go.kr/nssc/en）后进行。
  4. 根据当地法规处理放射性废物。
    注意：此处为环境保护研究所的指示 & 遵循了首尔国立大学的安全规范。以下是美国和欧洲部分国家监管机构的列表：美国，美国核管理委员会（http://www.nrc.gov/）；英国，健康与安全执行局（HSE）（http://www.hse.gov.uk）；法国，核安全局（Autorité de sûreté nucléaire）（https://www.asn.fr/）；德国，联邦环境、自然保护、建筑和核安全部（BMU）（http://www.bmu.de）。

2. 体外 竞争性激酶实验

  1. 竞争性肽段的构建
    1. 确定AMPK磷酸化的共有基序。
      注：AMPK识别的共有基序为Φ-[X,β]-X-X-Ser/Thr-X-X-X-Φ。在此共识序列中，Φ代表疏水性氨基酸（即缬氨酸 [V]、亮氨酸 [L]、甲硫氨酸 [M] 和异亮氨酸 [I]），β代表碱性氨基酸（即赖氨酸 [K]、精氨酸 [R] 和组氨酸 [H]）1。
    2. 根据上述共有基序，从目标序列中选择丝氨酸或苏氨酸残基。选用人源Nrf2的三个假定位点（#1，148-157，包含Ser153；#2，330-339，包含Ser335；#3，553-562，包含Ser558）8。
    3. 商业合成模拟这些假定位点的10个残基肽段。每种肽段以冻干粉末形式获得，纯度需大于98%。
    4. 使用激酶缓冲液溶解肽段，使其浓度达到71.667 g/L。若某肽段在激酶缓冲液中不溶解，可将其溶于20% DMSO中。若仍不溶解，可考虑延长模拟假定位点的肽段以提高其溶解性。
  1. 体外 竞争性AMPK激酶活性检测
    1. 配制5×激酶缓冲液如下：100 mM HEPES，pH 7.4；25 mM MgCl₂2；5 mM EGTA；5 mM DTT；125 mM β-甘油磷酸钠（丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂）；5 mM Na3视频操作4 （酪氨酸磷酸酶抑制剂）；0.5%（v/v）蛋白酶抑制剂混合物III，1 mM冷ATP；和500 µM AMP。
      注意：AMP 是检测 AMPK 活性所需激酶缓冲液中的必需组分。该缓冲液可用于测定丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶的活性。
    2. 将以下重组蛋白和合成肽置于冰上解冻：AMPK；Nrf2；以及寡肽#1、#2和#3。
    3. 在冰上配制反应缓冲液：加入0.15 µg AMPK、0.4 µg Nrf2（约4 pmol）、0.43 mg寡肽（约300 nmol）和6 µL 5×激酶缓冲液，用无菌蒸馏水（DW）定容至终体积30 µL。
      注意：[γ-32准备反应缓冲液后加入[P]-ATP可能会因激酶自磷酸化而降低放射性信号。
  2. 运行反应物
    注意：以下所有操作必须在丙烯酸防护罩、支架或挡板保护下进行，同时佩戴适当的个人防护装备。
    1. 实验开始前将加热块预热至 30 °C。
    2. 加入1 µL的[γ-32将 [P]-ATP（1 µCi）加入预冷的反应管中。用移液器吹打数次，混匀反应缓冲液。
      注意：放射性活度的 32P 的半衰期较短，约为 14 天9. 根据半衰期调整体积（例如， 自[γ-32P]-ATP，加入4 µL的[γ-32P]-ATP 以获得 1 µCi）。
    3. 将样品置于加热块中，在 30 °C 下孵育 15–30 分钟。在此步骤期间，制备 7.5% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶。根据目标蛋白的大小调整凝胶的浓度。
    4. 通过加入3 µL 10× SDS上样缓冲液（10% (v/v) 甘油、20% (w/v) SDS、15.42% (w/v) 二硫苏糖醇、90% (v/v) 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) 和 0.02% (w/v) 溴酚蓝）终止激酶反应。用移液器反复吹打数次以混匀反应体系。
    5. 在7.5% SDS-PAGE凝胶中以70 V电泳20分钟，随后以140 V持续电泳1小时。
      注意：凝胶末端的溴酚蓝条带含有极高的放射性信号。建议在进行下一步操作前切除蓝色条带下方的凝胶，以降低背景信号。
    6. SDS-PAGE 电泳结束后，轻轻将凝胶从制胶板上取下，放入玻璃管中以进行下一步操作。
    7. 用固定液（50% 甲醇和 10% 冰醋酸）固定凝胶 20 分钟。
    8. 将凝胶轻轻转移至滤纸上，并用透明包装膜覆盖。注意此步骤中凝胶可能容易撕裂。使用真空凝胶干燥仪在80 °C下干燥1小时。
  3. 可视化
    1. 将凝胶置于磷屏或X射线胶片下曝光过夜（通常约16 h）。
      注意：磷光屏在暴露于强光后可重复使用。若使用X射线胶片，需将凝胶曝光两天。X射线胶片的灵敏度低于磷光屏。
    2. 使用磷屏成像仪扫描磷屏。将图像导出为高分辨率的TIFF或位图文件。
    3. 染色可视化后，将凝胶转移至玻璃或塑料容器中进行考马斯亮蓝（CBB）染色。
    4. 用去离子水洗涤凝胶。弃去去离子水，加入染色试剂染色1小时。
    5. 弃去试剂，用去离子水脱色1小时或过夜。将凝胶置于透明塑料膜之间（或等效材料），使用办公扫描仪进行扫描。

3. 体外 使用位点特异性突变体的激酶活性检测

  1. pGEX-Nrf2的定点突变
    1. 诱变引物设计
      注意：设计合适的突变引物对于突变实验的成功至关重要。以下是设计突变引物时需考虑的一些要点：引物长度应为25至45个碱基，所需突变应位于引物的中间位置。引物的GC含量应为40%-60%，并以一个或多个G或C碱基结尾。确保Tm 引物的退火温度根据公式计算等于78 °C或更高m= 81.5 + 0.41(% GC) - (675/碱基长度) - %错配
      注意：请纯化引物，因为其纯度对突变效率至关重要。目前有多个网站可用于设计突变引物。
      1. 打开引物设计程序 "设计用于定点突变的引物" （http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp）
      2. 粘贴人 Nrf2 DNA 序列（Access No. NM_006164.4）并选择 "上传翻译" 按钮
      3. 选择翻译后的氨基酸序列中的丝氨酸558位点，将其突变为丙氨酸。使用突变引物将丝氨酸的密码子从agc替换为丙氨酸的密码子gcc。
      4. 考虑引物长度、Tm，以及GC含量。
        注意：最终设计的诱变引物序列为 5'-ctactgaaaaaacaactc gccaccttatatctcgaag-3'
    2. 利用聚合酶链式反应（PCR）进行突变链合成的反应
      1. 在冰上配制PCR反应体系：10×反应缓冲液，50 ng pGEX-GST-Nrf2，125 ng 正向引物，125 ng 反向引物，1 µL dNTP混合物（各10 mM），2.5 U Pfu DNA聚合酶和无菌去离子水定容至50 µL。
      2. 使用以下循环程序进行pGEX-GST-Nrf2-突变链合成的PCR反应：95 °C预变性30 s，1个循环；随后进行18个循环：95 °C变性30 s，55 °C退火1 min，68 °C延伸90 s；最后68 °C延伸5 min，1个循环。
        注意：根据质粒长度，可调整扩增循环参数。
      3. 将其置于冰上冷却2分钟，以降低反应物温度，用于下一步操作。或者，也可在4 °C下保存过夜。
    3. Dpn I 消化与突变型质粒的筛选
      1. 加入 1 µL 的 Dpn I 在冷却后，向每种反应物中加入限制性内切酶（10 U/µL）。用移液器轻轻吹打充分混匀，并离心1分钟。
      2. 37 °C孵育2小时，以消化亲本pGEX-GST-Nrf2双链DNA。
      3. 轻柔地解冻 DH5α 冰上的超感受态细胞。
      4. 向150 µL预冷的溶液中加入50 µL反应物 DH5α 超感受态细胞，冰上孵育至少30分钟。
      5. 将试管转移至预热至 42 °C 的加热块中，孵育 90 秒。随后置于冰上 2 分钟。
      6. 加入预热的溶菌肉汤（LB）至转化后的菌体 DH5α 细胞并在37 °C、180 rpm振荡条件下孵育1小时。
      7. 将转化后的细胞涂布于LB-氨苄青霉素琼脂平板上，37 °C过夜培养。
        注意：由于质粒GEX-GST-Nrf2带有氨苄青霉素抗性标记，因此使用氨苄青霉素进行筛选。应根据突变质粒所携带的抗性标记选择合适的抗生素。
      8. 从平板上挑取单个菌落，转移至5 mL含氨苄青霉素的LB培养基中，于37 °C、180 rpm振荡条件下过夜培养。为验证突变序列，应至少检测三个菌落。
      9. 使用DNA小量提取试剂盒提取DNA用于DNA序列分析；遵循制造商提供的操作说明。
      10. 使用自动DNA测序仪，按照制造商提供的方案验证诱变DNA序列。用于突变序列验证的DNA质粒至少需200 ng。
  2. 纯化重组GST-Nrf2蛋白
    1. 表达诱变型GST-Nrf2融合蛋白 大肠杆菌
      1. 将诱变的 pGEX-GST-Nrf2 质粒转化进入 BL21 细胞。挑取单克隆接种于25 mL含氨苄青霉素（100 µg/mL）的LB液体培养基中，37 °C恒温摇床过夜培养。
      2. 将培养的细胞按1:100的稀释比例接种于100 mL含有氨苄青霉素（100 µg/mL）的LB液体培养基中。
      3. 在旋转仪上37 °C孵育，直至600 nm处的吸光度达到约0.4–0.8（约4小时）。
      4. 向100 mL培养细胞中加入100 µL的1 M IPTG，使IPTG终浓度为1 mM。
      5. 在30 °C下将细胞置于旋转摇床中孵育6小时或过夜以进行蛋白表达。
      6. 在冰上以 5,000 x g 离心 20 分钟，收集细胞沉淀，并用 1 mL 细菌裂解缓冲液（25 mM HEPES、5 mM EDTA、2 mM DTT、0.1% CHAPS、1 µg/mL pepstatin、0.5 µg/mL leupeptin 和 1 mM PMSF）重悬细胞沉淀。
      7. 使用超声波匀浆器以最大输出功率的50%对细胞沉淀进行裂解，每次2秒，间隔进行，总时长2分钟。
      8. 在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 15 分钟，收集上清液。
    2. 纯化重组GST-Nrf2蛋白
      1. 准备200 µL 50% (v/v) 谷胱甘肽-琼脂糖珠，用1 mL PBS (pH 7.3; 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4，以及 1.8 mM KH2PO4通过离心（500 × g，1 分钟）收集珠子。重复洗涤步骤三次。
      2. 将细胞裂解液加入预先准备的200 µL 50% (v/v) 谷胱甘肽-琼脂糖珠中，于4 °C在翻转摇床中孵育2小时。
      3. 以500 × g离心1分钟，收集与GST-Nrf2蛋白结合的谷胱甘肽琼脂糖珠。使用带31 G针头的1 mL注射器吸除上清液。
      4. 用1 mL PBS（pH 7.3）洗涤磁珠，步骤同第1步。
      5. 向结合了GST-Nrf2的谷胱甘肽-琼脂糖珠中加入500 µL洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl和10 mM还原型谷胱甘肽，pH 8.0），在4 °C下于翻转摇床中孵育30分钟。
      6. 以 500 × g 离心 1 分钟，收集上清液。
      7. 再次加入 300 µL 洗脱缓冲液至珠子中，并重复步骤 3.2.2.5–3.2.2.6 两次。
    3. 纯化GST-Nrf2蛋白的验证
      1. 准备5 µL样品，并加入0.5 µg标准蛋白BSA，用于蛋白定量的可视化。
      2. 在7.5% SDS-PAGE凝胶中以70 V电泳20分钟，然后以140 V电泳60分钟。
      3. 用0.1%考马斯亮蓝染色液（0.1 g考马斯亮蓝R250，40 mL 99%甲醇，10 mL冰醋酸，50 mL蒸馏水）染色凝胶2O）中孵育2小时，然后脱色（30 mL甲醇，10 mL冰醋酸和60 mL蒸馏H2O）直至条带清晰显现。
      4. 将脱色后的凝胶置于滤纸上，覆盖透明塑料膜，于80 °C下用真空凝胶干燥器干燥1小时。
      5. 通过密度测定法确定突变型 GST-Nrf2 蛋白的含量 体外 AMPK激酶活性检测
  3. 体外 AMPK活性检测结合位点特异性突变体
    注意： 体外 根据步骤2.2–2.4进行AMPK激酶活性检测，使用0.4 µg纯化的野生型GST-Nrf2或GST-Nrf2-S558A突变体，不添加肽类抑制剂。遵循步骤1中所述的所有放射安全指南。
    1. 在冰上配制反应缓冲液，其中包含0.15 µg AMPK、0.4 µg突变型或野生型GST-Nrf2以及6 µL 5倍激酶缓冲液，用无菌去离子水定容至30 µL。
    2. 加入1 µL的[γ-32将 [P]-ATP（1 µCi/µL）加入冰上的反应管中。用移液器吹打数次以混匀反应缓冲液，然后离心。
    3. 将样品在30 °C的加热块中孵育30分钟。
    4. 加入3 µL 10× SDS上样缓冲液以终止激酶反应。
    5. 在7.5% SDS-PAGE凝胶中，先以70 V电泳20分钟，再以140 V电泳1小时。
    6. 用固定缓冲液固定凝胶20分钟，将凝胶转移至滤纸上，并用透明薄膜覆盖。
    7. 使用真空凝胶干燥器在 80 °C 下干燥凝胶 1 小时，然后将凝胶置于磷屏或X射线胶片中曝光过夜。
    8. 使用磷屏成像仪扫描磷屏，在按步骤2.4完成成像后，将凝胶转移至玻璃管中进行考马斯亮蓝染色。

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结果

图1 和 图2 展示先前已发表论文中重复实验的结果8. 合成三种不同的10个残基寡肽，分别模拟AMPK潜在的靶位点（#1，148-157，包含Ser153；#2，330-339，包含Ser335；#3，553-562，包含Ser558），并将其用作竞争剂 体外 激酶活性检测。在寡肽#3存在下，AMPK对Nrf2的磷酸化作用显著减弱。图1）。接下来，通过定点突变实验验证肽模拟物实验的结果。鉴于寡肽#3对AMPK介导的Nrf2磷酸化的抑制作用（图1），我们构建了S558A-Nrf2突变体。通过使用 体外 AMPK激酶活性检测。Nrf2的单个氨基酸替换（558位丝氨酸→丙氨酸）阻止了AMPK对Nrf2的磷酸化，表明AMPK在Ser558位点直接磷酸化Nrf2。...

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讨论

作为一种简单且便捷的方法来评估AMPK介导的预测磷酸化位点的真实性，本文描述了一种in vitro激酶活性检测方法，该方法可利用竞争性肽段发现特异性磷酸化位点，并通过位点特异性突变体进行验证。来自in vitro竞争性AMPK活性检测的代表性数据与使用定点突变蛋白的实验结果一致，表明肽段竞争检测是确定磷酸化位点的有效工具。该方法还曾用于鉴定PKCδ特异性磷酸化位点的研究中，PKCδ可在丝氨酸40位点磷酸化Nrf23。由于肽段可与蛋白质发生竞争性结合，该原理也可应用于in vitro GST pull-down实验，以鉴定结合基序10,11。此外，这种肽模拟方法也可能适用于鉴定其他翻译后修饰，例如赖氨酸残基的乙酰化修饰。

使用本方案时，某些疏水性多肽可能难以溶解。如果多肽在激酶缓冲液中不溶，可尝试将其溶于20% DMSO中。对于极疏水的多肽，应首先尝试将其溶于100%...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由韩国政府（MSIP）资助的韩国国家研究基金会项目（编号：2015R1A2A1A10052663 和编号：2014M1A3A3A02034698）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HEPESThermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆15630
MgCl2Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯208337
EGTASigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯E3889
DTTSigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯D9779
β-甘油磷酸Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯G9422
Na3VO4Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯450243
蛋白酶抑制剂混合物Calbiochem，英国诺丁汉539134
ATPSigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯A2383
AMPSigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯A1752
AMPKUpstate Biotechnology，美国纽约州莱克普拉西德14-840
Nrf2（野生型）Abnova，中国台湾台北市H00004780-P01
[γ-32P]-ATPPerkinElmer Life and Analytical Sciences，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆NEG502A
EZblue 染色试剂Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯G1041
Pfu turbo DNA 聚合酶Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉600250
dNTP 混合物Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉200415-51避免反复冻融
DpnINew England Biolabs，美国马萨诸塞州伊普斯威奇R0176S
LB 培养基Duchefa Biochemie BV，荷兰哈勒姆L1704
氨苄青霉素Affymetrix，美国加利福尼亚州圣克拉拉11259
低电渗琼脂糖iNtRON Biotechnology，韩国城南32034
HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini KitReal Biotech Corporation，中国台湾QDF100
考马斯亮蓝 R-250Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫克力士161-0400
牛血清白蛋白Bovogen Biologicals，澳大利亚维多利亚州BSA100
谷胱甘肽 Sepharose 4BGE Healthcare，美国马萨诸塞州马尔伯勒17-0756-01
冰醋酸Duksan 纯化学公司，韩国安山
甲醇
 
 		Daejung Chemicals & Metals，韩国始兴5558-4410
[header]
Typhoon FLA 7000GE Healthcare，美国马萨诸塞州马尔伯勒28-9558-09
SDS-PAGE 试剂盒Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫克力士1658001FC
真空泵Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫克力士165-178
凝胶干燥仪Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫克力士165-1746
摇床FINEPCR，韩国首尔CR300该仪器用于洗涤步骤
PCR 仪Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫克力士T100
培养摇床N-BIOTEK，韩国京畿道NB-205L
微量离心机LABOGENE，韩国首尔1730R
层析柱Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫克力士732-1010

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