量化腹部色素沉着 黑腹果蝇

摘要

本研究介绍了一种利用数字图像分析快速、精确量化黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）腹部色素沉着的方法。该方法简化了表型获取与数据分析之间的操作流程，包括样本固定、图像采集、像素值提取和性状测量等步骤。

摘要

色素沉着是一种形态上简单但高度可变的性状，通常具有适应性意义。它被广泛用作研究形态表型发育与进化的模型。黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的腹部色素沉着尤其具有研究价值，使研究人员能够鉴定出导致种间和种内形态差异的基因位点。然而迄今为止，对黑腹果蝇（D. melanogaster）腹部色素沉着的研究主要依赖评分方式进行定性分析，而非定量分析，这限制了可应用于色素沉着数据的统计分析方法。本研究描述了一种新方法，可对成年黑腹果蝇（D. melanogaster）腹部色素沉着模式的多个方面进行量化。该实验方案包括样本制备、图像采集、数据提取和分析。所有用于图像采集和分析的软件均包含为开源图像分析平台编写的宏程序。该方法的优势在于能够以高度可重复的方式，在不同成像系统之间精确测量色素沉着性状。尽管该技术已被用于测量成年黑腹果蝇（D. melanogaster）背板色素沉着模式的变异，但该方法具有灵活性，可广泛适用于多种不同生物的色素沉着模式研究。

引言

色素沉着在物种间、种群间、个体间以及个体发育过程中均表现出巨大的表型变异^1,2,3,4,5,6尽管已有大量关于多种动物色素沉着的研究，但色素沉着现象在 黑腹果蝇，其中充分利用了分子遗传学的力量，以阐明调控色素沉着的发育与生理机制，以及这些机制的演化过程^1,6. 关于调控色素生物化学合成的基因，人们已了解甚多 D. melanogaster^7,8 控制该生物合成时空分布的基因^{9,10,11,12,13}此外，遗传作图已鉴定出控制种内和种间色素沉着差异的遗传位点 D. melanogaster^14,15,16,17色素沉着与行为等多效性性状之间的关系^18,19 和免疫^19,20，色素模式的适应性意义也已被探讨^15,21,22因此，色素沉着在 D. melanogaster 已成为复杂表型发育与进化研究中一种强大而简便的模型。

成年 D. melanogaster 的体色特征表现为身体各部位黑化模式的明显差异，尤其体现在翅膀以及背部的胸部和腹部。然而，最受研究关注的是其背腹部每一节体节（背板）的体色表现。图1A-F 显示了该体色存在显著变异，这受到遗传^17,23 和环境^24,25 因素的共同影响。腹部背板的表皮由前、后两个发育区室组成（图1G），每个区室还可根据体色和装饰特征进一步细分²⁶。前区室包含六种表皮类型（a1–a6），后区室包含三种（p1–p3）（图1G）。其中，p1、p2 和 a1 表皮在未伸展的腹部通常折叠于背板下方而不可见。稳定可见的表皮具有一条明显的深色色素带，此处称之为"色素带"，由 a4 型（具中等刚毛的被毛表皮）和 a5 型（具粗大刚毛的被毛表皮）构成，且色素带的后缘着色比前缘更深（图1G）。在该色素带前方是一片浅色素的被毛表皮区，其后部具有刚毛（a3），前部无刚毛（a2）。果蝇个体间的体色差异主要体现在色素沉积的强度以及色素带的宽度上。总体而言，最显著的变异出现在最靠后的体节（腹部第5、6和7节），而较靠前的体节（腹部第3和4节）变异较小²⁴。此外，D. melanogaster 的体色存在性别二态性，雄性通常在第五和第六腹节背板上具有完全着色的色素带（图4C）。

在大多数关于黑腹果蝇（D. melanogaster）腹部色素沉着的研究中，色素沉着通常被视为分类性或有序性性状，其模式通过定性方式^27,28,29或在量表上进行半定量评估^{14,15,16,17,24,30,31,32,33,34,35,36,37}。这些方法不可避免地存在精度不足的问题，且依赖于对色素沉着的主观判断，因此难以在不同研究之间进行数据比较。一些研究者已对色素沉着的空间维度^38,39、特定表皮类型的色素沉着强度^23,25,39,40，或整个腹部背板上色素沉着的平均强度^41,42,43进行了量化。然而，这些量化方法无法同时测量腹部色素沉着的强度及其空间分布，因而不能捕捉色素沉着在腹部背板上变化的细微特征。此外，其中一些量化方法^38,41,42,43需要解剖并制备腹部表皮，这不仅耗时，而且会破坏样本，使其无法用于进一步的形态学分析。随着对腹部色素沉着发育与进化机制的理解不断深入，将需要更为精密的工具，以快速、精确地同时测量色素沉着的空间分布和强度。

本方法的总体目标是利用数字图像分析，对黑腹果蝇（D. melanogaster）的腹部色素沉积进行可重复且更精确的量化测量。该方法包括三个步骤：首先，将成虫以非破坏性方式固定，并拍摄其背部腹部的数字图像；其次，使用 ImageJ 宏程序，用户在第三和第四腹节上分别定义一条从前端 a2 表皮延伸至后端 a5 表皮的前后方向像素条带（绿色框，图 1G），然后沿该条带长轴方向提取其横向平均像素值，生成一条反映色素沉积从腹节前端到后端空间分布及强度变化的曲线；第三，使用 R 脚本通过三次样条函数对色素沉积曲线进行数学描述，并利用该样条函数及其一阶和二阶导数，提取 a2–a5 表皮的宽度、色素带的宽度，以及色素沉积的最大值和最小值。因此，该方法可同时量化腹部色素沉积的空间特征和色素深度。

该方法可定量测量第三和第四腹节背板的色素沉着，这些结构在以往众多研究中已被作为重点，无论是单独研究还是与其他更靠后的背板联合研究^{1,15,23,24,25,28,33,39,42}。尽管第三和第四背板的变异程度低于第五和第六腹节背板，但在雄性个体中并未完全色素化，因此本方案适用于雄性和雌性。然而，如本文所示，该方案也可用于测量雌性个体中第五和第六腹节背板的色素沉着。此外，对用于提取色素沉着特征的脚本进行轻微修改后，该方法还可用于量化多种其他生物中色素沉着的变异情况。

方案

1. 标本制备

注意：成像前将死亡的果蝇保存在70%乙醇水溶液中。

1. 在60 mm × 15 mm的培养皿中倒入10 mL溶解于沸水中的1.25%琼脂溶液，静置使其凝固。
2. 在解剖显微镜下，使用一对尖头镊子在凝胶表面制作一条长约20 mm、宽2 mm、深1 mm的沟槽。用尖头镊子将成蝇的腹面嵌入沟槽中，使蝇体的背面向上突出于凝胶表面。
   注意：凝胶的松软质地便于在不损伤标本的情况下进行重新定位。同一条沟槽可多次用于放置标本，但随着时间推移会变得污浊、破碎而无法使用。此时可在同一块凝胶上重新制作新的沟槽。每个培养皿可用于拍摄约200只果蝇。
3. 用70%乙醇水溶液完全覆盖标本，以减少蜡质表皮产生的光反射，并防止在操作过程中损伤翅膀。

2. 显微镜设置

注意：图像使用体视显微镜、透射光源底座、数码相机和连接至运行图像采集控制软件的计算机的鹅颈式冷光源获取。软件操作说明针对开源软件 Micro-Manager v1.4.20⁴⁴，该软件集成了 ImageJ⁴⁵。

1. 打开显微镜、数码相机、双蛇形冷光源和计算机。
2. 运行图像采集软件，打开 Micro-Manager 窗口和 ImageJ 窗口。在 ImageJ 窗口中，点击“图像” > “类型” > “8 位”，将所有图像设置为 8 位。在 Micro-Manager 窗口中点击“实时”按钮，打开“拍摄/实时”窗口，显示来自相机的实时预览。
   1. 如有必要，最大化“拍摄/实时”窗口的尺寸。在 Micro-Manager 窗口的“对比度”选项卡中，从下拉菜单“显示模式”中选择“灰度”。
3. 将冷光源调至最大亮度，并将两个蛇形灯管的灯头分别置于载物台左右两侧，距离载物台约 120 mm。
   注：用户也可使用环形照明器，但可能会在果蝇腹部周围产生一圈反射光。
4. 手动将显微镜放大倍数设为 60X，使视野覆盖载物台上直径约 3 mm 的区域。
5. 将一个 2 mm 的载物台测微尺放置在载物台上（如有必要，将背景切换为白色）。在观察实时预览的同时，对测微尺进行对焦，并在 Micro-Manager 窗口的“曝光”框中输入以毫秒为单位的曝光时间，以调整曝光。
6. 为对相机进行空间校准，在 ImageJ 窗口中选择“直线”工具，沿测微尺的长度绘制一条直线。在 ImageJ 窗口中点击“分析” > “设定比例”以打开“设定比例”窗口，在“已知距离”框中输入测微尺的长度（单位为 µm），并在“长度单位”框中输入“µm”。
   1. 确认“设定比例”窗口中显示的比例单位为“像素/µm”，记录该比例值，然后点击“确定”。
7. 在“拍摄/实时”窗口中，先点击“停止”，再点击“拍摄”，以获取测微尺的图像。
8. 将图像保存为 8 位灰度 TIFF 格式，以便在必要时可重新进行空间校准。在 ImageJ 窗口中点击“文件” > “另存为” > “Tiff...”，在文件浏览器中指定保存位置，命名文件，然后点击“保存”。
9. 将载物台背景切换为黑色，并将盛有以琼脂固定的果蝇（步骤 1.1–1.2）的培养皿放置在载物台上。
10. 通过显微镜观察，调整果蝇位置，确保其背中线垂直向上，以最佳观察色素分布模式。移动翅膀和其他附肢，确保腹部视野无遮挡。若色素化表皮（a2–a5）不可见，可从侧面轻压腹部直至可见（但保存于水中 70% 乙醇中的果蝇腹部会自然伸展，因此通常无需此操作）。
    注：在调整果蝇位置时，用户可能需要使用较低放大倍数（20X）。在继续操作前，必须将放大倍数恢复至 60X。
11. 手动对果蝇的背部腹部进行对焦。手动调节光源灯头位置，以最小化背部腹部的阴影和反光。
12. 在观察计算机屏幕上的实时预览时，结合 Micro-Manager 窗口“对比度”选项卡中的像素值直方图，按照步骤 2.4 所述调整曝光，以最大化预览图像的像素值范围。
13. 移除果蝇和培养皿，替换为一个光谱输出范围为 430–660 nm 的 LED，并将其连接至电压表，使 LED 位于视野中央，位置与果蝇相同。将 LED 和电压表用作光度计⁴⁶，记录 LED 受光照射后产生的电压（约 125 mV）。
    注：使用 LED 和电压表可确保单次实验中多次成像会话的光照强度保持一致。
14. 在整个实验过程中，不得再改变光源的位置或强度、显微镜的放大倍数或相机的曝光参数。

3. 标本成像

1. 将盛有以琼脂固定的果蝇（步骤1.1–1.3）的培养皿置于黑色显微镜载物台上。调整果蝇位置，使其第三和第四腹节可见，且背中线垂直向上，如步骤2.9所述。继续操作前，确保放大倍数为60倍。
2. 手动调节显微镜，使第三和第四背侧腹部节片清晰对焦。按照步骤2.6所述，使用图像采集软件以8位灰度TIFF格式获取图像。
   注意：图像可以彩色拍摄，随后转换为灰度图像用于分析。
3. 将图像保存为 "SESH000_sampleID.tiff" 如步骤 2.7 所述
   注意：此处 [SESH] 为固定值，[000] 为会话编号，长度必须为三位数字且可变，[sampleID] 由用户自定义，但不得包含额外的下划线（_）字符，且长度必须固定。[sampleID] 应包含用于色素沉着数据分析的因素详情例如， 温度或谱系），以连字符（-）等非字母字符分隔。这使得这些因素能够通过标准统计软件从[sampleID]中轻松解析出来。
4. 从载物台上取下培养皿，将果蝇更换为下一个样本。重复步骤3.1–3.3，直至所有样本均完成成像，在此过程中不再调整光照强度、放大倍数或曝光时间。

4. 多次实验会话中的成像

1. 如果需要在多个会话中拍摄图像，请在各会话之间保持光照强度、曝光和放大倍数的一致性。在每次会话开始时，检查相机的空间校准（步骤 2.4）以及载物台处的光照强度（通过 LED/电压表测量，步骤 2.12）。
2. 拍摄并保存载物台显微尺的图像（步骤 2.5–2.7），以便在必要时能够重新对图像进行空间校准。
3. 每个会话中至少使用 15 个对照样本，并随机重新成像，以检测并消除会话间效应。确保不同会话之间的重复对照样本具有相同的 [sampleID]，但不同的 [SESH000]。
   注：对照样本是指与实验样本以相同方式采集、保存和封片的果蝇，但在不同会话中被重复成像。对照样本的具体数量取决于用户的实验设计。详见讨论部分。

5. 图像分析

注意：图像分析在 ImageJ⁴⁵ 中进行，并使用作为补充文件提供的“Measurement of Pigmentation.ijm”宏。

1. 将所有待分析的图像放入同一文件夹中。
2. 启动 ImageJ 并运行 "色素沉着的测量.ijm" 单击宏 "插件" > "大体" > "运行，" 选择 "色素沉着的测量.ijm" 在文件浏览器中，单击 "开放"
   注意：所有后续步骤均在宏内进行。每个步骤均为独立的宏命令。
3. 请注意，一个 "操作要求" 对话框弹出，显示 "选择存储图像的文件夹。" 点击 "好的" 并使用文件浏览器选择包含图像的文件夹，然后单击 "选择"
4. 请注意，一个 "操作要求" 对话框将弹出，显示 "选择您希望存储数据的文件夹。" 点击 "好的" 并使用文件浏览器选择用于保存色素沉着谱型的所需文件夹。单击 "选择"
5. 请注意，将弹出一个对话框，询问 "您的样本编号包含多少个字符？" 在数据输入框中，输入步骤 3.3 中指定的 [SampleID] 的字符数，然后单击 "好的。"
6. 请注意，将弹出一个对话框，提示 "你的感兴趣区域（ROI）有多宽？" 在数据输入框中，输入将用于读取色素沉着分布的前后方向条带的像素宽度（绿色矩形， 图1G, 图2A，以及 2A单击（'）。 "好的；" 默认值为20像素。
   注意：为了减少因刚毛和刺毛引起的噪声，色素沉着轮廓应在一条角质层条带上读取，而非单一条线上。该条带的宽度取决于图像分辨率，但应约为1/20^th 腹部宽度，单位为像素。
7. 请注意，该宏将打开第一只果蝇的图像，随后会弹出一个对话框，询问是否测量当前果蝇（点击“是”） "是")，继续下一只果蝇（点击 "无"），或退出宏（点击 "取消").
8. 请注意，将弹出一个对话框，提示 "从前往后定义 dorsal 腹部的中线。" 该 "直线" 工具将自动被选中。从腹节前端至后端画一条线，以定义背腹部的中线。单击 "好的；" 见 图2A 和 2A，黄色线条。
   注意：此步骤用于重新调整图像方向，使背中线在屏幕上水平呈现，且前端位于左侧，以便于后续操作。
9. 请注意，将弹出一个对话框，提示 "在色素带后方定义第四背板的后缘。" 该 "直线" 工具将已被选中。从后部中线边缘向右侧面边缘画一条线，使该线的中心（以白色方块标记）恰好位于色素带后缘（a5节腹片）的稍后方。单击 "好的；"。参见 图 2A 和 2A′，品红色线条。
   注意： R 脚本将自动从色素带的色素分布曲线中检测其后缘。
10. 请注意，此时将弹出一个对话框，显示 "在色素化表皮的前缘（a2）处定义第四背板的前缘。" 该 "直线" 工具将自动处于选中状态。从腹节前中线边缘向右侧边缘画一条线，使该线的中点（以白色方块标记）位于色素化表皮（a2表皮）的前缘。单击 "好的；"。参见 图2A 和 2A'，青色线。
    注意： R 脚本将定义该点为腹板色素表皮的前缘。在图像上，宏将显示沿色素分布轮廓读取的感兴趣区域（ROI）（绿色矩形， 图2A 和 2A′，放大于 图2B 和 2B′）。该宏还将打开第二个窗口，显示选定区域（ROI）的色素沉积轮廓（图2C 和 2C′），其中x轴表示位置，以距轮廓后缘的像素数表示，y轴表示每个位置的平均像素值。
11. 查看宏将打开的色素沉着轮廓图。如有必要，单击 "活体" 在轮廓窗口中调整感兴趣区域（ROI）的位置，使其不包含任何结构（例如， 刚毛）会对色素沉着特征产生影响。当特征轮廓满意后，点击 "好的。"
12. 重复步骤 5.8–5.11 以处理第三腹板。
    注意：该宏随后会将色素沉着谱型导出为两个CSV文件，每个文件均命名为 "SESH000_samplename_TX_谱型.csv" 其中 [SESH000_samplename] 为图像名称，[TX] 为第三或第四背板，分别对应 T3 或 T4。
13. 请注意，该宏会打开下一张图像。重复步骤 5.7–5.13，直至所有图像均被分析完毕。

6. 数据预处理、分析与实验批次校正

注意：所有数据分析均在 R⁴⁷ 中进行，并使用所提供的“Analysis of Pigmentation.R”脚本。以下“L…”表示分析各部分需运行的脚本行数。有关分析方法的更多细节，请参见补充信息。

1. 编辑 R 设置工作目录的脚本（L6）以及定义包含.csv配置文件的文件夹路径（L11）。
2. 运行 L13-15 以生成存储在 profile 文件夹中的色素沉着谱列表。
3. 加载并运行 "读者" 和 "addPrimaryKey" 函数（L17-41）将轮廓读取到单个数据框中。
4. 在第43行编辑脚本，以指定图像的空间校准参数 µm/像素，由步骤 2.5 确定。
5. 加载并运行 "调整" 函数（L46-58）用于将轮廓位置（x轴， 图2C 和 2C′) 从 ROI 后缘的像素到 µm-从ROI前缘和轮廓值（y轴， 图2C 和 2C′将像素值（0 = 黑色，255 = 白色）转换为色素值（0 = 无色素，255 = 最大色素）。
6. 加载并运行 "spline.der.er" 函数（L60-71）用于生成色素沉着轮廓的三次样条曲线及其一阶和二阶导数（图2D-2F 和 二维′-2F′).
7. 加载并运行 "坐标" 和 "assmbly.coord" 功能（L74-163），首先用于提取后部（T₃）和前部（T₂色素带的边缘图2D 和 二维′）以及 a2 表皮的后缘（T₁, 图 2D 和 二维′），然后提取最大值（P_最大）和最小值（P_分钟）色素值，于T处测得₃ 和 T₁分别。
   注意：a2 表皮的前缘已在步骤 5.9 中定义。
8. 可选：加载并运行 "chek" 功能（L165-175）用于检测是否 "坐标" 功能是准确定位 T 位点_1-3 用于随机选择的色素沉着谱型。
9. 加载并运行索引和指标函数（L178-193），以生成带有标题的数据表 "实验环节，" "样本，" "腹板，" "id" （样本与背板的组合） "P_最大值," "P_分钟," "W_条带"色素带宽度，= T3 - T₂），以及 "W_背板"（第2至第5腹节色素化表皮的宽度，= T）₃).
10. 加载并运行 "校正" 函数（第196-234行）以生成校正P的数据表_最大值 和 P_分钟 以消除因实验批次效应引起的任何干扰因素。使用 P 的平均增加（或减少）值_最大 或 P_分钟 来自在时间上相邻的成像时段中重新拍摄的对照样本。

结果

该方案用于探究培育温度对腹部色素沉着的影响。先前的研究表明，在多种物种中，发育温度的升高会导致腹部色素沉着范围的减少。 果蝇，包括 D. melanogaster^30,32具体而言，在腹部第3和第4背板中，色素沉着范围（色素带宽度）从17 °C到25 °C逐渐减小，而在25 °C至28 °C之间保持不变^24,36这些研究采用1至10分的评分标准对色素沉着程度进行评分（0分：无色素带，背板完全呈黄色；5分：色素带占据背板的50%；10分：背板完全呈深色）。为验证定量方法是否能够捕捉到这种表型可塑性，对一条基因型一致的表观野生型雌性果蝇品系进行了检测，这些果蝇从卵至成虫阶段分别在17 °C（7只）、25 °C（9只）和28 °C（9只）条件下培养。为评估校正程序在消除由实验批次效应引入的干扰因素方面的有效性，...

讨论

该方法能够以适合多种下游分析的定量形式，精确、快速且可重复地获取色素沉积数据。该方法已被用于获取温度对果蝇同基因型品系腹部色素沉积影响的数据。然而，该方法也可用于正向遗传学研究，以鉴定个体、种群或物种间色素差异背后的基因，或用于反向遗传学研究，以探索特定基因对色素模式的影响。尽管如上所述，已有大量研究探讨了黑腹果蝇（D. melanogaster）色素形成的发育与进化，但本方法以定量形式精确采集色素数据的能力，使得研究者可以采用更强大的统计学方法。这反过来使研究人员在分析色素模式时能够减少样本量，或更清晰地揭示色素沉积的细微特征。此外，该方法无需解剖果蝇，因而样本可继续用于其他分析，例如形态学测量或基因分型。事实上，该方法还可潜在地应用于麻醉状态的果蝇，之后可根据其色素特征进行选择性育种。

通过图像分析测量色素沉着时可能存在一个问题，即色素沉着值可能反映的是图像拍摄时的曝光和光照条件，而非色素沉着本身的实际水平。尽管使用固定的光照强度、光源位置、放大倍数和曝光参数有助于缓解这些问题，但通常仍有必要在每次实验会话中重复拍摄多个对照图像，以充分控制会话间效应。本方法包...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜蒙特 #5 生物镊	FST	11252-30
琼脂	Sigma-Aldrich	5040
解剖显微镜	Leica	MZ16FA
底座	Leica	MDG41
相机	Leica	DFC280
鹅颈式冷光源	Schott	ACE 1
图像采集控制软件	Micro-Manager v1.3.20		https://micro-manager.org/
图像分析软件	ImageJ		https://imagej.nih.gov/ij/
数据分析软件	R 3.3.2		https://www.r-project.org/
LED	Thor Labs	LEDWE-15
万用表	Fluke	Fluke 75 Series II
60 mm × 15 mm 培养皿	Celltreat Scientific Products	229663
载物台测微尺	Klarman Rulings, Inc.	KR-867