离体心室心肌细胞肌浆网钙储备及细胞内舒张期钙清除的评估

摘要

细胞内钙离子循环在心肌细胞收缩和舒张功能的调控中起着关键作用。本文介绍了一种利用钙成像系统评估心肌细胞肌浆网Ca²⁺储备能力及舒张期钙离子清除功能的实验方案。

摘要

细胞内钙离子循环在心肌细胞收缩和舒张功能的调控中起着关键作用。心肌肌浆网（SR）作为钙离子的主要储存库，在调节钙瞬变幅度和再摄取过程中发挥核心功能。²⁺ 收缩过程中钙离子的储存库，负责重吸收细胞内 Ca²⁺ 舒张期间。肌浆网 Ca²⁺ 可用于搏动的储备量决定了心脏收缩力，而细胞内Ca²⁺的清除²⁺ 对心脏舒张功能至关重要。在某些病理生理条件下，如糖尿病和心力衰竭，钙离子清除功能受损以及肌浆网Ca²⁺ 心肌细胞中的钙库可能参与心脏功能障碍的发生发展。本文介绍了一种评估肌浆网钙含量（SRCa）的实验方案。²⁺ 储备和舒张期钙²⁺ 去除。简言之，单个心肌细胞通过酶法分离，细胞内Ca²⁺ 由钙成像系统记录Fura-2指示的荧光。使用咖啡因诱发肌浆网总钙释放²⁺ 释放，我们通过联动刺激系统与灌流系统预设了一个自动灌流切换程序。随后，采用单指数曲线拟合方法分析钙瞬变及咖啡因诱导的钙脉冲的衰减时间常数。据此，可评估肌浆网（SR）Ca²⁺-ATP酶（SERCA）和Na⁺-钙²⁺ 通过评估钠钙交换体（NCX）在舒张期钙离子清除中的作用。

引言

细胞内钙离子浓度（[Ca²⁺]_i）再循环在心肌细胞收缩和舒张功能的调控中起着关键作用¹. 如我们所知，钙诱导的Ca²⁺ 释放启动兴奋-收缩耦联，将电信号转化为收缩。膜去极化激活肌膜上的L型Ca²⁺ 通道，可诱导 Ca²⁺ 通过兰尼碱受体2（RyR2）从肌浆网释放到胞质中的钙离子。 transient升高的胞质Ca²⁺ 启动肌原纤维收缩。在舒张期，胞质中的 Ca²⁺ 通过肌质网Ca²⁺-ATP酶2（SERCA2）并通过Na⁺-钙²⁺ 交换体（NCX）²该过程导致心肌细胞的收缩-舒张循环。

心肌细胞的肌浆网（SR）是一种包绕收缩装置的细胞内膜网络结构。它在心肌收缩时作为Ca²⁺的储存库，并在舒张过程中重新摄取细胞内Ca²⁺。可用于每次搏动的SR Ca²⁺储备量决定了心肌的收缩力。同时，细胞内Ca²⁺的清除对心脏舒张功能至关重要。在某些病理生理状态下，例如糖尿病和心力衰竭，心肌细胞中Ca²⁺清除能力受损以及SR Ca²⁺储存减少，可能参与了心....

方案

所有动物实验均按照中国中医科学院实验研究中心和浙江大学机构动物护理与使用委员会批准的方案进行。

1. 溶液配制

1. 按照表1中所述配制所有溶液。

2. 左心室（LV）心肌细胞的分离

注意：左心室心肌细胞通过Langendroff灌注系统进行酶解分离，方法如前所述^7,8,9,10,11。

1. 安装朗根多夫灌流系统。用正常台氏液（NT）填充灌流系统，将温度设定为 36.5 °C，并排除管路中的所有气泡。
2. 称重并经腹腔注射（ip）水合氯醛（400 mg/kg）对Sprague-Dawley大鼠进行麻醉。注射5分钟后，通过评估尾部或脚趾夹捏反应确认麻醉状态。
3. 在剑突下方用手术剪刀打开腹腔，提起剑突，用剪刀剪开胸腔。去除心包膜，用弯头镊子轻轻提起心脏，辨认主动脉弓，从主动脉根部用剪刀剪下心脏。
4. 将心脏转移至6....

结果

              此处以链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠（DM）和年龄匹配的Sprague-Dawley（SD）大鼠为例。8周龄雄性SD大鼠（200 ± 20 g）分别通过腹腔注射单次给予STZ（70 mg/kg，ip）建立DM组，对照组则注射柠檬酸盐缓冲液。STZ给药一周后，血糖水平 > 16.7 mmol/L 的大鼠被认定为糖尿病模型。8周后，通过酶法分离左心室（LV）心肌细胞。钙离子恢复后，约有70–80%的心肌细胞保持存活状态。仅选取呈杆状、横纹清晰且收缩稳定的细胞用于记录（图1B）。如图1A所示，我们为心肌细胞设置了浴槽灌流和针式灌流系统。灌流阀门和起搏系统由预设程序自动切换，如图2A所述。细胞内钙荧光信号由钙成像系统记录。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。

讨论

肌浆网（SR）释放的钙流是心脏收缩期钙离子（Ca²⁺）的主要来源。在一定程度上，肌浆网内Ca²⁺含量的幅度以及从肌浆网中释放的Ca²⁺比例反映了可用于心肌收缩的肌浆网Ca²⁺储备量。另一方面，肌浆网的Ca²⁺储备依赖于肌浆网对Ca²⁺的再摄取能力、肌浆网的Ca²⁺泄漏以及舒张期期间两者在肌浆网膜上的动态平衡^12,13,14。在本实验中，快速施加10 mM咖啡因旨在通过开放兰尼碱受体（RyR）通道，诱导肌浆网内Ca²⁺的完全释放并阻止其再摄取。因此，咖啡因诱导的Ca²⁺瞬变幅度可作为肌浆网Ca²⁺储备量的一个指标。此外，通过1 Hz和3 Hz的基础起搏刺激，我们还可进一步研究肌浆网Ca²⁺负荷的频率依赖性特征及其潜在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Alfa Aesar	012314
MgCl2	Alfa Aesar	012315
KCl	Alfa Aesar	11595
HEPEs	Sigma	H3375
D-葡萄糖	Alfa Aesar	A16828
NaOH	Alfa Aesar	A18395
KOH	Alfa Aesar	A18854
KH2PO4	Alfa Aesar	011594
MgSO4	Alfa Aesar	3337
L-谷氨酸	Alfa Aesar	A15031
牛磺酸	Alfa Aesar	A12403
EGTA	Sigma	E3889
胶原酶A	Roche	10103586001
II型胶原酶	Worthington	LS004177
BSA	Roche	735094
咖啡因	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
显微镜	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff系统	北京赛特微科技有限公司	PlexiThermo-S-LANGC
显微操作器	Marchauser	MM33 links
灌流室	IonOptix	FHD
阀门控制重力灌流系统	ALA	VC 3-8
阀门控制软件	ALA	VC 3 1.0.1.2
精密流量调节器	Delta Med	3204315
多通道管路灌流笔	AutoMate Scientific	04-08-[360]
可更换微米级尖端	AutoMate Scientific	360um i.d.
荧光测量与细胞尺寸分析系统	IonOptix	Hyperswitch
记录软件	IonOptix	IonWizard 6.2.59
刺激器	IonOptix	MyoPacer EP
SD大鼠	北京维通利华实验动物技术有限公司	SCXK 2016-01-007436