离体心室心肌细胞肌浆网钙储备及细胞内舒张期钙清除的评估

摘要

细胞内钙离子循环在心肌细胞收缩和舒张功能的调控中起着关键作用。本文介绍了一种利用钙成像系统评估心肌细胞肌浆网Ca²⁺储备能力及舒张期钙离子清除功能的实验方案。

摘要

细胞内钙离子循环在心肌细胞收缩和舒张功能的调控中起着关键作用。心肌肌浆网（SR）作为钙离子的主要储存库，在调节钙瞬变幅度和再摄取过程中发挥核心功能。²⁺ 收缩过程中钙离子的储存库，负责重吸收细胞内 Ca²⁺ 舒张期间。肌浆网 Ca²⁺ 可用于搏动的储备量决定了心脏收缩力，而细胞内Ca²⁺的清除²⁺ 对心脏舒张功能至关重要。在某些病理生理条件下，如糖尿病和心力衰竭，钙离子清除功能受损以及肌浆网Ca²⁺ 心肌细胞中的钙库可能参与心脏功能障碍的发生发展。本文介绍了一种评估肌浆网钙含量（SRCa）的实验方案。²⁺ 储备和舒张期钙²⁺ 去除。简言之，单个心肌细胞通过酶法分离，细胞内Ca²⁺ 由钙成像系统记录Fura-2指示的荧光。使用咖啡因诱发肌浆网总钙释放²⁺ 释放，我们通过联动刺激系统与灌流系统预设了一个自动灌流切换程序。随后，采用单指数曲线拟合方法分析钙瞬变及咖啡因诱导的钙脉冲的衰减时间常数。据此，可评估肌浆网（SR）Ca²⁺-ATP酶（SERCA）和Na⁺-钙²⁺ 通过评估钠钙交换体（NCX）在舒张期钙离子清除中的作用。

引言

细胞内钙离子浓度（[Ca²⁺]_i）再循环在心肌细胞收缩和舒张功能的调控中起着关键作用¹. 如我们所知，钙诱导的Ca²⁺ 释放启动兴奋-收缩耦联，将电信号转化为收缩。膜去极化激活肌膜上的L型Ca²⁺ 通道，可诱导 Ca²⁺ 通过兰尼碱受体2（RyR2）从肌浆网释放到胞质中的钙离子。 transient升高的胞质Ca²⁺ 启动肌原纤维收缩。在舒张期，胞质中的 Ca²⁺ 通过肌质网Ca²⁺-ATP酶2（SERCA2）并通过Na⁺-钙²⁺ 交换体（NCX）²该过程导致心肌细胞的收缩-舒张循环。

心肌细胞的肌浆网（SR）是一种包绕收缩装置的细胞内膜网络结构。它在心肌收缩时作为Ca²⁺的储存库，并在舒张过程中重新摄取细胞内Ca²⁺。可用于每次搏动的SR Ca²⁺储备量决定了心肌的收缩力。同时，细胞内Ca²⁺的清除对心脏舒张功能至关重要。在某些病理生理状态下，例如糖尿病和心力衰竭，心肌细胞中Ca²⁺清除能力受损以及SR Ca²⁺储存减少，可能参与了心脏功能障碍的发生过程^2,3,4。

在心肌细胞中测量肌浆网（SR）Ca²⁺ 释放及舒张期 Ca²⁺ 清除的常用方法主要有两种：基于膜片钳技术的钠钙交换电流（NCX 电流）完整性分析^5,6，以及基于 Ca²⁺ 荧光成像的咖啡因诱导 Ca²⁺ 脉冲法^7,8,9。前一种方法依赖于肌浆网释放的 Ca²⁺ 主要通过 NCX 从细胞内泵出这一原理。然而，该方法受限于对高端设备和熟练操作技术的要求。在本研究中，我们描述了一种简便的方法，通过基于 Ca²⁺ 荧光成像系统检测咖啡因诱导的 Ca²⁺ 脉冲，来评估心肌细胞中肌浆网的 Ca²⁺ 储备量及 Ca²⁺ 清除能力。简而言之，细胞内 Ca²⁺ 荧光信号由 Fura-2 指示。通过将刺激系统与灌流系统联动，我们建立了一个可自动切换灌流和起搏程序的系统。采用 10 mM 咖啡因快速诱导肌浆网内总 Ca²⁺ 的释放。钙瞬变和咖啡因诱导钙脉冲的单指数衰减时间常数（Tau）通过单指数曲线拟合获得，分别反映 SERCA 和 NCX 在舒张期 Ca²⁺ 清除中的作用。

方案

所有动物实验均按照中国中医科学院实验研究中心和浙江大学机构动物护理与使用委员会批准的方案进行。

1. 溶液配制

1. 按照表1中所述配制所有溶液。

2. 左心室（LV）心肌细胞的分离

注意：左心室心肌细胞通过Langendroff灌注系统进行酶解分离，方法如前所述^7,8,9,10,11。

1. 安装朗根多夫灌流系统。用正常台氏液（NT）填充灌流系统，将温度设定为 36.5 °C，并排除管路中的所有气泡。
2. 称重并经腹腔注射（ip）水合氯醛（400 mg/kg）对Sprague-Dawley大鼠进行麻醉。注射5分钟后，通过评估尾部或脚趾夹捏反应确认麻醉状态。
3. 在剑突下方用手术剪刀打开腹腔，提起剑突，用剪刀剪开胸腔。去除心包膜，用弯头镊子轻轻提起心脏，辨认主动脉弓，从主动脉根部用剪刀剪下心脏。
4. 将心脏转移至60 mm培养皿中，并用NT溶液洗涤。用两把显微解剖镊夹住主动脉，将其套在Langendorff灌注插管上，然后使用外科缝合线将主动脉牢固结扎在插管上。
   注意：熟练的操作人员可在15秒内完成此过程。
5. 用30 mL NT溶液灌注心脏，以恢复冠状动脉的循环。然后，将灌注液更换为30 mL Ca²⁺无钙台氏液（10 mM 牛磺酸，1 mg/mL BSA）以停止心跳。随后，将灌注液更换为胶原酶A分离液（0.6 mg/mL）进行酶消化。
   注意：使用糖尿病大鼠进行实验时，采用胶原酶A；不使用糖尿病大鼠进行实验时，采用胶原酶II。
6. 消化 20–25 分钟后，迅速将灌流液更换为 Ca²⁺无钙台氏液以终止进一步消化。随后用镊子夹住心脏，将其从套管上剪下，并置于含有KB溶液的35 mm培养皿中（见 表1).
7. 用剪刀和镊子解剖左心室壁。剪除心房、右心室及房室交界区域。剩余组织即为左心室，将其转移至含KB溶液的新35 mm培养皿中。将左心室组织剪成小块。
8. 用带滤膜的塑料移液管轻轻吹打组织块，并重悬于10 mL KB溶液中。
9. 使用150 µm孔径的不锈钢滤网过滤细胞，并转移至15 mL离心管中。以150 × g离心30 s，弃去上清液。将心肌细胞重悬于10 mL KB溶液中，静置6 min后弃去上清液，再将沉淀重悬于10 mL KB溶液中。
   注意：所有步骤均在通入100% O₂的溶液中于36 °C下进行₂.

3. 钙离子再引入

1. 静置20分钟后，弃去KB溶液上清，用钙重灌注溶液A（0.3 mM Ca）重新悬浮心肌细胞²⁺，4.5 mL Ca²⁺无Tyrode溶液，1.5 mL NT溶液）孵育10分钟。
2. 用钙重灌注溶液 B（0.3 mM Ca²⁺，3 mL Ca²⁺无Tyrode溶液，3 mL NT溶液。
3. 用 NT 溶液（1.2 mM Ca）重复上述步骤²⁺) 以纯化可获取的心肌细胞。将分离出的左心室心肌细胞保存于该溶液中，并在4-6小时内进行实验。

4. 灌注系统的设置

1. 将灌流管路与NT溶液连接，用于灌流细胞腔室（图1A）。
2. 为对目标心肌细胞进行针尖灌流，将固定在显微操作器上的多通道灌流笔尖（例如，灌流笔，下文简称“笔”）连接至由阀门控制的灌流系统。将NT溶液和10 mM咖啡因溶液分别加入灌流笔的各通道中（图1A）。
3. 排出管路中的所有气泡，以避免气阻。
4. 计数10秒内灌流笔微管尖端的滴液滴数，并手动调节流速控制器，使流速保持在约每10秒3滴。

5. 细胞内 Ca²⁺ 瞬变和肌节缩短的测量 ^7,8,9

1. 取10 µL细胞悬液滴加到载玻片上，在显微镜下使用细胞计数器计数细胞数量，并计算密度。将心肌细胞稀释至约50,000 个细胞/mL的浓度。
2. 将Fura-2乙酰甲酯（AM）储备液（一种钙离子敏感性荧光染料）加入1 mL心肌细胞悬液中，使终浓度达到2 µM。室温避光孵育20分钟。
3. 以150 g离心30秒，用NT溶液重悬心肌细胞两次。
4. 关闭光源并保持细胞处于避光状态。将心肌细胞放入灌流腔室中静置15分钟，随后以NT溶液开始腔室灌流（流速1.5 mL/min）。使用刺激器以1 Hz场刺激（波宽4.0 ms，脉冲幅度8.0 V）刺激心肌细胞5分钟。
5. 在10倍物镜下选择形态良好（杆状、边缘清晰、横纹明显）且受刺激后收缩稳定（无自发性收缩）的心肌细胞。随后切换至40倍物镜，并调整CCD相机方向，使心肌细胞呈水平位置。
6. 调节细胞定位适配器，使单个心肌细胞位于视野中央。确保背景清晰无干扰。
7. 使用氙灯发出的光，通过340 nm或380 nm激发滤光片照射心肌细胞，并通过40倍物镜成像。在510 nm处检测荧光信号。同时，观察心肌细胞肌节长度的变化，并使用soft-edge模块同步记录。
8. 使用双激发荧光光电倍增系统记录荧光信号。运行钙成像系统的记录程序，点击"File/new File"创建新的记录文件，然后点击"start"按钮，同步记录荧光信号和肌节长度。

6. SR 钙²⁺ 储备及舒张期钙²⁺ 清除功能的评估^7,8,9

1. 相互连接 "辅助输出" 刺激器上的端口 "模拟输入" 阀门控制系统上的端口例如，阀门控制器，参见 材料表通过BNC电缆（用于同步TTL信号）。
2. 预设程序以自动切换灌注阀，方法如前所述^8,9操作的详细步骤如下所列。
   1. 根据阀门控制软件中的参数进行预设 表2，然后单击 "下载" 单击按钮以下载程序中加载的序列。单击 "触发" 按钮以启用触发功能。
      注意：阀门控制系统在接收到TTL信号后可执行该序列。
   2. 将刺激器预设为序列模式，并根据要求设置参数 表3.
3. 将刺激器设置为 "S1 步骤" 以1 Hz的频率起搏左心室心肌细胞。以1.5 mL/min的速度开始针式灌注NT溶液。
   注意：由于针头灌注流速快于腔室灌注，针头灌注的光线折射与腔室灌注的光线折射不同。这种折射差异指示了有效针头灌注的范围，该范围围绕目标心肌细胞。
4. 在低倍镜视野下选择一个目标心肌细胞（按从下游到上游的顺序），确保该细胞可被笔状微电极的微尖触及。将显微镜放大倍数调整至400倍。旋转CCD相机方向，使心肌细胞保持水平位置。调节细胞框适配器下的矩形光阑，使其形成一个恰好容纳心肌细胞的合适窗口。确保背景尽可能干净，窗口内不得包含其他心肌细胞或死细胞碎片。
5. 调整固定在显微操作仪上的铅笔位置，在400倍显微镜放大倍数下，将微尖小心地置于目标心肌细胞视野半径距离处。
6. 调整针头液流范围，使其主要覆盖目标心肌细胞，并确保心肌细胞不会被针头液流冲走。
7. 在基础起搏60秒后，将刺激器光标滚动至 "D2 步骤".
   注意：其余实验步骤将由刺激器和阀门控制系统自动执行。根据上述设置，该方案可自动运行，如同 图2A，以NT溶液进行1 Hz基础起搏60秒。随后停止起搏并延迟2秒，迅速切换为10 mM咖啡因灌注15秒（以功能性释放Ca²⁺ 储存于肌浆网（SR）中），然后切换回NT溶液。
8. 记录结束后，检测单个心肌细胞的背景荧光。点击 "暂停" 暂停文件录制按钮，将显微镜视野移至附近空白区域。单击 "记录" 单击按钮以恢复录制数秒，并记录340 nm和380 nm的强度值用于背景校正。
9. 打开 "操作/恒定" 对话框，并将数值填入其中 "背景" 分别进行校正；该软件可通过减去背景值来校正Fura 2比率值。

7. 数据分析 ⁹

1. 在基础起搏阶段进行钙瞬变和肌节缩短的测量时，需对多个搏动波形进行平均处理，然后利用软件自动分析动态参数，如钙瞬变幅度及钙瞬变衰减时间常数（Tau-1 Hz）。
   注意：若软件对衰减段拟合不佳，可导出下降相曲线进行人工单指数拟合。
2. 对于咖啡因诱导的钙瞬变波形，仅选择具有陡峭上升支的脉冲用于钙清除功能分析；排除信号干扰、脉冲异常或中途漂出视野的细胞。
3. 测量咖啡因诱导钙脉冲的振幅（Ca-caffeine，作为肌浆网Ca²⁺ 储备的指标）。
4. 通过人工单指数曲线拟合（持续时间为10秒）从软件中获取咖啡因诱导钙脉冲的衰减时间常数（Tau-caffeine）（图2C）。

结果

              此处以链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠（DM）和年龄匹配的Sprague-Dawley（SD）大鼠为例。8周龄雄性SD大鼠（200 ± 20 g）分别通过腹腔注射单次给予STZ（70 mg/kg，ip）建立DM组，对照组则注射柠檬酸盐缓冲液。STZ给药一周后，血糖水平 > 16.7 mmol/L 的大鼠被认定为糖尿病模型。8周后，通过酶法分离左心室（LV）心肌细胞。钙离子恢复后，约有70–80%的心肌细胞保持存活状态。仅选取呈杆状、横纹清晰且收缩稳定的细胞用于记录（图1B）。如图1A所示，我们为心肌细胞设置了浴槽灌流和针式灌流系统。灌流阀门和起搏系统由预设程序自动切换，如图2A所述。细胞内钙荧光信号由钙成像系统记录。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。

与SD组相比，DM组的咖啡因诱导钙脉冲（Ca-caffeine）幅度显著降低（0.332 ± 0.008 vs. 0.276 ± 0.008，t检验： p < 0.05）以及较低的肌浆网分数性钙释放（Ca-1 Hz/Ca-咖啡因）（78.5 ± 1.5% vs. 72.1 ± 1.0%，t检验： p < 0.05) (图2B）。Tau-1 Hz 和 Tau-咖啡因通过单指数曲线拟合获得；DM 组显示出显著延长的咖啡因诱导钙脉冲衰减时间常数（Tau-咖啡因）（1.822 ± 0.07 ms vs. 2.896 ± 0.088 毫秒，t 检验， p < 0.05），且 Tau-1 Hz/Tau-咖啡因比值水平更高（0.076 ± 0.003 vs. 0.086 ± 0.003，t检验， p < 0.05）低于 SD 组（图 2D）。这些结果表明，SR Ca²⁺ 储备能力降低和钙离子失衡²⁺ 糖尿病心肌细胞中的清除率。

图1. 灌流系统示意图及分离的左心室心肌细胞。（A）腔室灌流与微管灌流示意图。箭头表示灌流腔室内NT溶液的流动方向。微管可向目标心肌细胞周围灌注NT溶液或咖啡因溶液。微管尖端可在腔室上方自由操控。（B）分离的左心室心肌细胞的显微图像，呈杆状，具有清晰的横纹结构。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2. 肌浆网钙储备及钙清除功能的评估。 （A）自动切换灌流阀门与起搏系统操作流程示意图。（B）DM 组与 SD 组在 1 Hz 刺激下收缩时肌浆网 Ca²⁺ 储备及肌浆网部分 Ca²⁺ 释放的统计值。DM 组的肌浆网 Ca²⁺ 储备及部分 Ca²⁺ 释放显著低于 SD 组。（C）软件界面显示对咖啡因诱导的钙瞬变衰减过程进行手动单指数拟合，以确定衰减时间常数（Tau-咖啡因）。（D）比较 DM 组与 SD 组 Tau-咖啡因及 Tau-1 Hz/Tau-咖啡因的柱状图。DM 组的 Tau-咖啡因和 Tau-1 Hz/Tau-咖啡因值显著高于 SD 组。数据以均值 ± 标准误表示，进行 t 检验，*p < 0.05，与 SD 组比较。 请点击此处查看该图的放大版本。

溶液	含量（单位：mM）
正常台氏液（NT 溶液）	135 NaCl, 5.4 KCl, 1.2 MgCl2，10 葡萄糖，10 HEPES，1.2 Na2HPO4，1.2 CaCl2, 用 NaOH 调节 pH 至 7.35
Ca2+ 无钙台氏液	135 NaCl, 5.4 KCl, 1.2 MgCl2，10 葡萄糖，10 HEPES，1.2 Na2高通量筛选4，10 牛磺酸，用 NaOH 调节 pH 至 7.35
胶原酶分离液	胶原酶A或胶原酶II + Ca2+ 无钙台氏液
KB溶液	120 mmol/L KOH, 120 mmol/L L-谷氨酸, 5 mmol/L MgCl₂, 10 mmol/L HEPES, 1 mmol/L EGTA, 10 mmol/L 葡萄糖, 20 mmol/L 牛磺酸, 用 KOH 调节 pH 至 7.35
咖啡因灌流液	NT 溶液中的 10 咖啡因

表1. LV心肌细胞分离和细胞灌注用溶液。

阀门	时间（秒）
2	15
1	60

表2. 阀门控制系统（阀门控制器）中的参数预设。

面板显示	说明
4.0 ms 持续时间	电刺激场时间
8.0 V	电刺激电压
S1 1.0 HZ 999s	在起搏状态下找到目标心肌细胞
D2 001s	选择此步骤以暂停起搏，并在基础收缩记录后延迟 1 秒
D3 015s *	“*” 表示刺激器可输出 5V TTL 信号
D4 060s	完成咖啡因灌流，心肌细胞恢复至正常状态
END	返回至 S1 步骤

表3. 刺激器中参数的预设。

讨论

肌浆网（SR）释放的钙流是心脏收缩期钙离子（Ca²⁺）的主要来源。在一定程度上，肌浆网内Ca²⁺含量的幅度以及从肌浆网中释放的Ca²⁺比例反映了可用于心肌收缩的肌浆网Ca²⁺储备量。另一方面，肌浆网的Ca²⁺储备依赖于肌浆网对Ca²⁺的再摄取能力、肌浆网的Ca²⁺泄漏以及舒张期期间两者在肌浆网膜上的动态平衡^12,13,14。在本实验中，快速施加10 mM咖啡因旨在通过开放兰尼碱受体（RyR）通道，诱导肌浆网内Ca²⁺的完全释放并阻止其再摄取。因此，咖啡因诱导的Ca²⁺瞬变幅度可作为肌浆网Ca²⁺储备量的一个指标。此外，通过1 Hz和3 Hz的基础起搏刺激，我们还可进一步研究肌浆网Ca²⁺负荷的频率依赖性特征及其潜在机制⁶。

去除 Ca²⁺ 细胞质中的钙离子浓度对心脏舒张功能至关重要。如图所示 图2A，在1 Hz场刺激阶段，钙瞬变的下降归因于肌浆网中的SERCA、细胞膜中的NCX以及缓慢的转运系统（线粒体Ca²⁺ 单向转运体和肌膜钙²⁺-ATP酶）。由于慢速机制的贡献可忽略不计，Ca²⁺瞬变的衰减时间常数²⁺ 瞬态（Tau-1 Hz）反映的是SERCA和NCX的联合活性^7,8,9在咖啡因灌注阶段，SERCA 无法建立肌浆网钙储备。因此，咖啡因诱导的钙瞬变下降速率（Tau-咖啡因）主要归因于 NCX。相应地，NCX 功能与 Tau-咖啡因呈负相关。NCX 对舒张期 Ca²⁺ 的贡献²⁺ 去除作用与Tau-1 Hz/Tau-咖啡因的比值呈正相关。SERCA的贡献与Tau-咖啡因和Tau-1 Hz之间的差值呈正相关。^7,8,9.

为了成功完成该操作（图2），需注意一些关键技术要点。首先，建立自动化系统对于精确切换起搏和灌流系统至关重要。预设程序可准确控制延迟时间，并快速施加咖啡因灌流。其次，在操作过程中，心肌细胞有可能被灌流液冲走。为确保心肌细胞稳定贴附于灌流腔室中，在开始记录前应将细胞置于腔室中静置超过15分钟。

此外，建立一个稳定的针式灌流系统以施加咖啡因是另一个关键步骤。该步骤有三个要点：（1）快速通道切换和顺畅的针式灌流，（2）精确控制灌流流速，（3）针尖与目标心肌细胞之间保持适当距离。若流速、针尖距离设置不当，或溶液通道切换过程中产生干扰，可能导致无法获得可接受的咖啡因诱导钙瞬变信号。对于咖啡因诱导的钙瞬变，只有具有陡峭波峰的钙瞬变信号才可用于钙清除功能的分析。

基于膜片钳系统的替代方法可提供相对准确的数据。然而，某些因素，如内向整流K⁺ 电流可能影响准确性。此外，膜片钳技术对先进设备、技术人员操作技能的高要求以及耗时较长等特点，也可能限制其应用。在一定程度上，本方案的局限性在于无法直接提供肌浆网（SR）钙负荷量或SERCA及NCX活性的直接数值。这些参数（例如，Ca-咖啡因，Tau-咖啡因）仅反映舒张期Ca的肌浆网含量变化及其贡献²⁺ 去除具有间接性。然而，该方案具有操作便捷、技术与设备限制较少的优势。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Alfa Aesar	012314
MgCl2	Alfa Aesar	012315
KCl	Alfa Aesar	11595
HEPEs	Sigma	H3375
D-葡萄糖	Alfa Aesar	A16828
NaOH	Alfa Aesar	A18395
KOH	Alfa Aesar	A18854
KH2PO4	Alfa Aesar	011594
MgSO4	Alfa Aesar	3337
L-谷氨酸	Alfa Aesar	A15031
牛磺酸	Alfa Aesar	A12403
EGTA	Sigma	E3889
胶原酶A	Roche	10103586001
II型胶原酶	Worthington	LS004177
BSA	Roche	735094
咖啡因	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
显微镜	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff系统	北京赛特微科技有限公司	PlexiThermo-S-LANGC
显微操作器	Marchauser	MM33 links
灌流室	IonOptix	FHD
阀门控制重力灌流系统	ALA	VC 3-8
阀门控制软件	ALA	VC 3 1.0.1.2
精密流量调节器	Delta Med	3204315
多通道管路灌流笔	AutoMate Scientific	04-08-[360]
可更换微米级尖端	AutoMate Scientific	360um i.d.
荧光测量与细胞尺寸分析系统	IonOptix	Hyperswitch
记录软件	IonOptix	IonWizard 6.2.59
刺激器	IonOptix	MyoPacer EP
SD大鼠	北京维通利华实验动物技术有限公司	SCXK 2016-01-007436