方法文章

双向逆转录病毒整合位点PCR方法及定量数据分析流程

DOI：

10.3791/55812

⸱

2017年6月14日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UCLA AIDS Institute, University of California at Los Angeles (UCLA), 2Department of Microbiology, Immunology, & Molecular Genetics, University of California at Los Angeles (UCLA), 3Departments of Biomathematics and Mathematics, University of California at Los Angeles (UCLA), 4Personalized Genomic Medicine Research Center, Division of Strategic Research Groups, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 5Department of Medicine, University of California at Los Angeles (UCLA), 6Department of Veterinary Biosciences, College of Veterinary Medicine, The Ohio State University (OSU)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文描述了一种双向整合位点检测方法的实验流程及软件分析步骤，该方法可同时分析上游和下游的载体-宿主连接DNA。所获得的双向PCR产物可用于任何下游测序平台。所得数据可用于对整合的DNA靶标进行高通量、定量的比较分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

整合位点（IS）检测是研究逆转录病毒整合位点及其生物学意义的关键组成部分。在近期的逆转录病毒基因治疗研究中，IS检测结合高通量测序技术，已被用作细胞追踪工具，用于表征具有相同整合位点的克隆性干细胞群体。为了在不同样本内部及之间准确比较重建造血功能的干细胞克隆，检测灵敏度、数据可重复性以及检测方法的高通量能力是衡量该检测性能的最重要指标。本研究提供了一套双向IS分析的详细实验方案及数据分析流程。该双向检测方法可同时对上游和下游的载体-宿主连接区域进行测序。与传统的单向IS测序方法相比，双向方法显著提高了IS的检出率，并增强了对目标DNA两端整合事件的表征能力。本文所述的数据分析流程通过多步比对，将IS序列比对至参考基因组并识别测序错误，从而准确鉴定和统计相同的IS序列。通过优化的检测流程，我们近期已发表了一项研究，详细揭示了移植后数千个造血干细胞（HSC）克隆在恒河猴体内的重建模式，首次明确了HSC重建发生的具体时间点以及灵长类系统中HSC的功能异质性。以下方案详细描述了可准确鉴定和定量相同IS序列的逐步实验操作及数据分析流程。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

逆转录病毒会将其基因组DNA插入宿主基因组的不同位点。这一独特特性虽然可能导致癌症及其他形式的病毒致病，却也意外地使这些病毒在基因治疗和基础生物学研究的细胞工程中具有很高的应用潜力。病毒整合位点（IS）——即外源DNA（病毒）整合到宿主基因组上的位置——对整合后的病毒以及宿主细胞的命运均具有重要意义。整合位点检测技术已被广泛应用于多种生物学和临床研究中，用于研究逆转录病毒整合位点的选择性及致病机制、癌症发生、干细胞生物学以及发育生物学1,2,3,4。然而，检测灵敏度低、数据重复性差以及频繁的交叉污染是限制整合位点检测技术在当前及计划中的研究中进一步应用的关键因素。

目前已开发出多种插入位点（IS）分析技术。基于限制性内切酶的插入位点检测方法，包括连接子介导（LM）聚合酶链式反应（PCR）5、反向PCR6和线性扩增介导（LAM）PCR7，是应用最广泛的技术。然而，使用位点特异性的限制性内切酶会在插入位点的回收过程中引入偏差，导致仅能回收位于限制性酶切位点附近的部分整合组（即整合到宿主基因组中的外源DNA）4。近年来，也出现了一些可更全面评估载体插入位点的技术。这些方法采用多种策略来片段化基因组DNA并扩增插入位点，包括Mu转座子介导的PCR8、非限制性（nr）-LAM PCR9、II型限制性内切酶介导的消化10、机械剪切11以及基于随机六聚体的PCR（Re-free PCR）12。当前各种技术在检测灵敏度、基因组覆盖度、靶标特异性、高通量能力、实验操作复杂性以及检测靶位点相对频率的偏差等方面存在不同程度的差异。鉴于现有检测方法性能各异且应用场景多样，应谨慎选择最适宜的检测策略。

本研究提供了双向检测方法的详细实验步骤及计算数据分析流程，该方法通过同时分析整合靶DNA上下游的插入位点（IS），显著提高了检测率和序列定量的准确性（检测流程的示意图见图1）。该方法还可用于表征逆转录病毒整合过程（例如靶位点重复序列的保真度，以及插入序列上下游基因组序列的变异情况）。其他双向方法此前主要用于克隆和测序靶DNA的两端序列。11,13,14该检测方法经过广泛优化，可利用成熟的连接介导的PCR（LM-PCR）方法和计算分析比对技术，对载体标记的克隆进行高通量、可重复的定量分析，并可同时定量上游和下游连接区域。通过双向分析与 TaqαI 酶在干细胞基因治疗的临床前研究中已被证明对高通量克隆定量具有重要应用价值2,15. 本文描述了一种改进的方法，使用更频繁切割的限制性内切酶（RsaI/CviQI——识别序列：GTAC），与采用一种较不频繁切割酶的方法相比，该方法使检测整合子基因盒的几率提高了一倍。 TaqαI-基于检测方法的分析. 详细描述了使用 GTAC 位点酶进行慢病毒（NL4.3 及其衍生物）和γ-逆转录病毒（pMX 载体）载体插入位点（IS）分析的实验操作与数据分析流程。本实验所用的寡核苷酸列于 表1补充文件中提供了用于IS序列分析的内部编程脚本。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 生成上游（左侧）和下游（右侧）连接序列文库

  1. DNA连接子制备：
    1. 在PCR管中加入2 µL 100 µM的LINKER_A寡核苷酸（终浓度：20 µM）、2 µL 100 µM的LINKER_B寡核苷酸（终浓度：20 µM）、2 µL 5 M NaCl（终浓度：1 M）和4 µL无核酸酶水，配制10 µL连接子DNA溶液。参见 表1 用于连接序列。
    2. 将连接子DNA溶液在PCR仪中于95 °C孵育5分钟，停止运行程序，并关闭PCR仪电源。将连接子溶液留在仪器内30分钟，使连接子DNA缓慢冷却。连接子DNA溶液可于4 °C保存。
  2. LTR特异性生物素引物延伸：
    1. 使用紫外-可见分光光度计测定基因组 DNA 的 DNA 浓度及 260/280 nm 比值 体内 或 体外 实验。使用无核酸酶水将1-2 µg的样品基因组DNA稀释至终体积为170 µL的基因组DNA溶液。
    2. 通过混合各2.5 µL的10 µM HIV-1特异性生物素引物（L-BPs和R-BPs）制备200 µL PCR反应体系 表1：四种慢病毒特异性引物共10 µL，20 µL 10X耐热DNA聚合酶缓冲液，4 µL 10 mM dNTPs（终浓度：每种dNTP为200 µM），3 µL 2.5 U/µL耐热DNA聚合酶，以及163 µL基因组DNA。
      注意：对于gammaretroviral载体（pMX载体），请使用5 µL的两种10 µM pMX特异性生物素引物（L-BP和R-BP，共10 µL），替代上述四种HIV-1特异性生物素引物。
    3. 将溶液分装至四个PCR管中（每管50 µL），并在以下条件下进行一个延伸循环：94 °C 5分钟，56 °C 3分钟，72 °C 5分钟，4 °C 保存。
    4. 将全部四个PCR反应产物合并至一个2 mL微量离心管中，按照PCR纯化试剂盒的纯化步骤进行操作。使用50 µL洗脱缓冲液（试剂盒中提供的洗脱缓冲液按5倍体积水稀释）洗脱。立即进行步骤1.3.1，或在-20 °C保存洗脱后的DNA。
  3. RsaI 和 CviQI 消化
    1. 加入50 µL DNA（来自步骤1.2.4）、10 µL 10x缓冲液A和2 µL（20 U）RsaI酶，配制100 µL消化反应体系。在PCR仪中于37 °C孵育1小时。
    2. 加入1 µL（10 U）CviQI酶至反应体系中，使用PCR仪在25 °C孵育30分钟。随后立即进行步骤1.4.1。
  4. 平末端：
    1. 配制4.5 µL混合液，包含2.5 µL DNA聚合酶I大（Klenow）片段和2 µL 10 mM dNTPs。取1 µL该混合液加入步骤1.3.2的DNA样品中，总体积为102 µL。充分涡旋混匀，于PCR仪中25 °C孵育1小时。随后立即进行步骤1.6.1。
  5. 链霉亲和素磁珠的制备：
    1. 短暂涡旋混匀链霉亲和素磁珠溶液，取50 µL转移至新的2 mL微量离心管中。将管置于磁力架上，移除上清液，再用200 µL结合缓冲液洗涤磁珠。
    2. 将磁珠重悬于100 µL结合溶液中，并将离心管从磁力架上取下。立即进行步骤1.6.1。
  6. 链霉亲和素磁珠结合：
    1. 将100 µL样品DNA（步骤1.4.1）转移至100 µL重悬的磁珠溶液中（步骤1.5.2），用移液器轻轻吹打混匀，避免溶液产生气泡。将离心管置于旋转摇床或滚轴混合仪上，室温孵育3小时。
    2. 使用磁力架捕获磁珠，并弃去上清液。用400 µL洗涤液洗涤磁珠两次，再用400 µL 1x T4 DNA连接酶缓冲液（用无核酸酶水将10X溶液稀释而成）洗涤两次。
    3. 将磁珠重悬于200 µL 1x T4 DNA连接酶缓冲液（用无核酸酶水将10X溶液稀释而成）中，并将其移离磁力架。立即进行步骤1.7.1。
  7. 连接子连接：
    1. 在2 mL微量离心管中，加入0.5 µL DNA接头（步骤1.1.2）、10 µL 10x T4 DNA连接酶缓冲液、20 µL 5x T4 DNA连接酶缓冲液（含25%聚乙二醇）、5 µL T4 DNA连接酶、164.5 µL无核酸酶水和200 µL重悬的磁珠（步骤1.6.3），混匀配制总体积为400 µL的连接反应体系。将反应管置于旋转摇床上，室温（22 °C）孵育3小时，或16 °C过夜。
    2. 使用磁力架，用洗涤液洗涤磁珠两次，再用1×耐热DNA聚合酶缓冲液（用无核酸酶水将10×溶液稀释而成）洗涤两次。
    3. 将磁珠重悬于50 µL 1×耐热DNA聚合酶PCR缓冲液中，并从磁力架上移开。立即进行步骤1.8.1，或在4 °C保存不超过一天。
  8. 左右侧连接区域DNA的预扩增：
    1. 将步骤1.7.3中重悬的磁珠（50 µL）作为反应体系，加入10 µL 10 µM 1L引物、10 µL 10 µM 1R引物、20 µL 10 µM Link1引物（见表1）、10 µL 10×耐热DNA聚合酶缓冲液、4 µL 10 mM dNTPs（终浓度：每种dNTP为200 µM）、8 µL（20 U）耐热DNA聚合酶以及88 µL无核酸酶水，配制总体积为200 µL的PCR反应体系。
    2. 将反应混合物分装至4个PCR管中（每管50 µL），并按以下条件进行PCR扩增：94 °C预变性2 min；94 °C变性20 s、56 °C退火25 s、72 °C延伸2 min，循环25次；最后72 °C延伸5 min。
    3. 将全部4个PCR反应产物合并至一个2 mL微量离心管中，按照PCR纯化试剂盒的纯化步骤进行操作，用50 µL洗脱缓冲液洗脱。
    4. 使用紫外-可见分光光度计测定DNA浓度及260/280 nm吸光度比值；DNA可于-20 °C保存，直至进行下一步实验。可选择继续进行步骤1.9.1/1.10.1（可选），或直接进行步骤1.11.1/1.12.1。
  9. 移除左侧内部DNA扩增子（可选）：
    1. 将步骤1.8.4中的最多100 ng PCR DNA产物转移至一个2 mL微量离心管中，并用无核酸酶水调整体积至10 µL。
    2. 准备一种限制性内切酶反应，特异性靶向左侧内部DNA扩增子。
      注意：反应条件可能因所选酶的不同而有所差异。例如，在去除基于NL4.3的慢病毒载体中左侧的内部DNA时，加入1 µL的 pvuII，2 µL 缓冲液B，以及7 µL 无核酸酶水。在PCR仪中37 °C孵育1小时。立即进行步骤1.11.1，或于-20 °C保存。
  10. 移除右侧内部DNA扩增子（可选）：
    1. 步骤同1.9.1。
    2. 准备一个特异性靶向右侧内部DNA扩增子的限制性内切酶反应。
      注意：例如，在从基于NL4.3的慢病毒载体中去除右侧内部DNA时，加入1 µL的 sfoI，2 µL 缓冲液B，以及7 µL 无核酸酶水。在PCR仪中37 °C孵育1小时。立即进行步骤1.12.1，或于-20 °C保存。
  11. 左侧连接特异性扩增：
    1. 将5 µL步骤1.8.4的DNA（或可选步骤1.9.2的DNA）、5 µL 10 µM 2L引物（终浓度：1 µM）、5 µL 10 µM引物Link2（终浓度：1 µM）、5 µL 10×耐热DNA聚合酶缓冲液、1 µL 10 mM dNTPs（终浓度：每种dNTP为200 µM）、2 µL（5 U）耐热DNA聚合酶以及27 µL无核酸酶水混合，配制总体积为50 µL的PCR反应体系。
    2. PCR反应条件如下：94 °C 预变性3 min；进行8-15个循环，每个循环为94 °C 变性20 s、56 °C 退火25 s、72 °C 延伸2 min；最后72 °C 延伸5 min。
      注意：扩增的 DNA 可在 -20 °C 下保存。*建议优化循环次数。
    3. 按照PCR纯化试剂盒的PCR纯化步骤进行操作，用50 µL洗脱缓冲液洗脱。测定DNA浓度及260/280 nm比值。
  12. 右连接特异性扩增：
    1. 所有步骤均与 "左连接特异性扩增" （步骤1.11.1-1.11.3），但使用不同的引物；使用右连接特异性引物（2R引物，参见） 表1）在此步骤中。
  13. PCR扩增片段长度变异检测：
    1. 通过2%琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析PCR扩增片段的长度变异图2).
      注意：此步骤对于确认检测流程的完成以及根据PCR条带模式对插入位点（IS）模式进行初步评估至关重要。步骤1.11.3和1.12.3中获得的纯化PCR扩增产物可用于多种DNA测序平台。请根据所选平台进行相应的样本制备，适用于传统的链终止法（Sanger测序）或高通量测序（下一代测序）。DNA样品可保存于-20 °C。

2. 计算机化IS序列分析

  1. 数据文件的准备：
    1. 准备三个输入数据文件：一个fasta格式的序列数据文件（补充数据中的Test_data.fa），一个用于搜索载体和接头序列的基序的tsv文件（补充数据中的Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv），以及一个关于限制性内切酶信息的tsv文件（补充数据中的Enzyme.tsv）。
      注意：这些文件用于样本去混编、切除载体和接头序列，以及去除内部载体序列（图3A）。有关计算流程实施的详细逐步说明，请参见补充数据中的README.txt文件。
  2. 计算分析：
    1. 运行去混编和修剪脚本。
      注意：原始序列将进行去混编处理，并切除载体、接头和引物序列（参见补充材料README.txt文件中的STEP-1）。
    2. 运行比对命令（参见README.txt文件中的STEP-2），使用类似BLAST的比对工具（BLAT；www.genome.ucsc.edu）将处理后的序列比对到参考基因组上。
    3. 运行定量插入位点（IS）分析脚本（参见README.txt文件中的STEP-3）。
      注意：将生成两个输出文件（Initial_count_without_homopolymer_correction.txt 和 Final_count.txt）。有关比对和序列计数策略的更多细节，请参见补充数据中的"README.txt文件以及先前发表的文献2,15。

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结果

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双向IS检测可针对上游（左侧）和下游（右侧）载体-宿主连接区域生成不同大小的PCR扩增片段（图2）。PCR扩增片段的大小取决于整合子上下游最近的GTAC基序的位置。该检测还会产生内部DNA PCR扩增片段：在左侧和右侧连接区PCR过程中，分别同时扩增了靠近多聚嘌呤 tract 和引物结合位点的逆转录病毒序列。PCR扩增片段条带可通过毛细管电泳或琼脂糖凝胶（2%）电泳进行可视化。

测序完成后，使用内部开发的编程脚本对左侧和右侧连接序列进行分析，用于预处理原始序列（包括解复用、切除载体和连接子DNA）、将插入序列（IS）比对到基因组、识别并统计相同的插入序列，以及执行错误校正程序（图3）。查询序列在参考基因组中5'端的位置被定义为插入位点（IS），并用于对每个IS进行初步计数。判断两个匹配序列——上游（左侧）和下游（右侧）连接序列是否来源...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

双向检测法能够同时分析上游（左侧）和下游（右侧）的载体-宿主DNA连接序列，在多种基因治疗、干细胞及癌症研究应用中具有重要价值。与以往基于TCGA基序酶（TaqαI）的检测方法2,15以及其他单向LM-PCR方法5相比，使用GTAC基序酶（RsaI和CviQI）结合双向PCR策略显著提高了检测整合组（或克隆群体）的可能性。该双向检测法尤其改善了对插入位点（IS）的分析，适用于临床样本或小型动物模型研究中常见的有限DNA样本。

步骤 1.1-1.7 为关键步骤，应尽快完成，避免不必要的延迟。这些步骤通常在一天内完成。强烈建议在进行这些步骤前预先测试相关酶的活性。步骤 1.9 和 1.10 为可选步骤，这些步骤可减少与 IS 序列同时扩增的载体内部 DNA 序列。表 1 提供了适用于分析野生型 NL4.3 HIV-1、NL4.3 衍生载体（包括 FG12

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由美国国立卫生研究院基金 R00-HL116234、U19 AI117941 和 R56 HL126544；美国国家科学基金会基金 DMS-1516675；韩国国家研究基金会（NRF-2011-0030049、NRF-2014M3C9A3064552）以及韩国生物技术研究与开发局（KRIBB）启动计划资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
耐热DNA聚合酶Agilent600424PicoMaxx Polymerase
耐热DNA聚合酶缓冲液Agilent600424PicoMaxx Polymerase buffer
脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物New England BiolabsN0447LdNTP溶液混合物（每种10 mM）
PCR管VWR International53509-304带独立连接盖的PCR条形管
2 mL 微量离心管Molecular Bioproducts3453微量离心管
PCR纯化试剂盒Qiagen28106
RsaI New England BiolabsR0167L限制性内切酶
CviQINew England BiolabsR0639L限制性内切酶
Buffer ANew England BiolabsB7204SNEB CutSmart缓冲液
DNA聚合酶I大片段（Klenow片段） New England BiolabsM0210L末端补平
链霉亲和素磁珠溶液Invitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER试剂盒
结合溶液Invitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER试剂盒
洗涤溶液Invitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER试剂盒
磁力架ThermoFisher12321DDynaMag™-2 磁铁
T4 DNA连接酶New England BiolabsM0202LT4 DNA连接酶
10X T4 DNA连接酶缓冲液New England BiolabsB0202ST4 DNA连接酶反应缓冲液
5X T4 DNA连接酶缓冲液Invitrogen 46300-018含聚乙二醇-8000的T4 DNA连接酶缓冲液
紫外-可见分光光度计Fisher ScientificS06497Nanodrop 2000
PvuIINew England BiolabsR0151L限制性内切酶
SfoINew England BiolabsR0606L限制性内切酶
Buffer BNew England BiolabsB7203SNEB buffer 3.1
无核酸酶水Integrated DNA Technologies11-05-01-14
毛细管电泳Qiagen9001941QIAxcel毛细管电泳
Veriti 96孔快速热循环仪Thermo Fisher Scientific4375305PCR仪器
旋转轮（或滚轴）EppendorfM10534004细胞培养滚筒
DNA大小标记物Qiagen929559QX大小标记物（100 - 2,500 bp）
DNA大小标记物Qiagen929554QX大小标记物（50 - 1,500 bp）
DNA比对标记物Qiagen929524QX DNA比对标记物
基因组DNA不可用不可用来自体内或体外实验的样本基因组DNA

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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