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方法文章

脊髓缺血大鼠模型中主动脉阻断后可重复的运动功能障碍

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DOI：

10.3791/55814

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2017年7月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology and Pain Medicine, SMG-SNU Boramae Medical Center, Seoul National University College of Medicine, Seoul, 2Department of Anesthesiology and Pain Medicine, SNU Bundang Hospital, Seongnamsi, Gyeonggido, Republic of Korea

本文内容

摘要

本研究展示了在大鼠中建立微创且易于重复的脊髓缺血模型的技术。通过控制主动脉阻断时间，可产生不同程度的后肢运动功能障碍。

摘要

脊髓缺血是胸腹主动脉瘤手术后的一种致命性并发症。研究人员可利用脊髓缺血的实验模型来探讨预防和治疗该并发症的策略。本文所述模型展示了不同程度的截瘫，这些程度与在大鼠脊髓缺血模型中胸主动脉阻断后阻断时长相关。

将一根2-Fr带球囊导管经股动脉插入麻醉的雄性Sprague-Dawley大鼠的胸降主动脉，直至导管尖端置于左锁骨下动脉处。通过充盈导管球囊诱导脊髓缺血。在设定的阻断时间（9、10或11分钟）后，放空球囊。术后24小时采用运动功能障碍指数进行神经功能评估，并取脊髓组织进行组织病理学检查。

接受9分钟主动脉阻断的大鼠表现出轻度且可逆的后肢运动功能障碍。接受10分钟主动脉阻断的大鼠出现中度但可逆的运动功能障碍。接受11分钟主动脉阻断的大鼠则表现为完全且持续的瘫痪。在主动脉阻断时间较短的大鼠中，脊髓切片中的运动神经元保存得更为完好。

研究人员利用该脊髓缺血模型，通过胸主动脉阻断可诱导出可重复的后肢运动功能障碍。

引言

截瘫是胸腹主动脉瘤手术的一种致命性并发症。其原因是主动脉阻断和开放过程中发生的脊髓缺血-再灌注损伤。1 已有多种策略用于保护脊髓，包括全身低温和脑脊液引流，2,3,4 但仍有许多患者遭受此类损伤。

已有多种动物脊髓缺血模型被用于研究其发病机制并制定针对损伤的保护策略。在本研究中，我们概述了一种基于Taira和Marsala方法的大鼠脊髓缺血模型5。大鼠的脊髓循环系统与人类的脊髓血管及侧支循环系统非常相似，尽管在大小和位置上存在一些差异6,7。因此，大鼠在解剖学上是研究脊髓缺血发病机制、并发症及治疗的理想实验动物模型。此外，该脊髓缺血模型通过采用胸主动脉内球囊阻断技术，以最小的侵入性操作实现了可靠的主动脉阻断。

本研究中，我们证明了该脊髓缺血大鼠模型可诱导后肢出现可重复的运动功能障碍，其严重程度取决于主动脉阻断时间的长短。

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方案

本方案已获首尔国立大学盆塘医院机构动物照护与使用委员会批准。动物照护及实验均依照美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》进行。

1. 手术准备

  1. 手术前，用无菌生理盐水冲洗导管，以确保其通畅。
  2. 在手术台上放置加热毯，并用无菌布单覆盖手术台。
  3. 将雄性Sprague−Dawley大鼠（270–330 g）放入亚克力箱中，使用100%氧气中含3.0%–4.0%异氟烷进行麻醉。
  4. 在大鼠眼睛上涂抹润滑剂。
  5. 将大鼠仰卧位放置于手术台上，通过面罩持续吸入异氟烷（1.0%–2.5 vol.%）维持麻醉状态。
  6. 插入直肠探头以监测并维持体温在37.0–38.0 °C之间。

2. 股动脉插管

  1. 使用聚维酮碘和70%乙醇轻轻擦洗右侧腹股沟区域。
  2. 用剪刀在右侧腹股沟区域做一条2厘米长的横向皮肤切口。
  3. 使用牵开器暴露手术区域。
  4. 从周围的静脉和神经中分离股动脉，使用弯头镊子和钝头镊子隔离出约1厘米长的动脉段。
  5. 使用4.0黑色丝线缝合线，在动脉的近端和远端分别打一个松结，以最大程度地暴露操作区域。
  6. 使用显微剪刀在股动脉上做一切口。
  7. 使用显微镊子将一根2-Fr.带球囊导管插入股动脉。将导管在距离导管头约1厘米处用近端结扎线固定于血管上，然后结扎远端结扎线。

3. 颈动脉插管术

  1. 使用聚维酮碘和70%乙醇擦拭右侧前颈部，然后做皮肤切口。
  2. 使用牵开器暴露手术区域。分离出动脉约1 cm的节段，并在动脉近端和远端分别用丝线松扎，以最大程度暴露术区。
  3. 使用24 G静脉导管穿刺颈总动脉，并将导管前端1 cm向心脏方向推进。
  4. 用近端结扎线固定导管，然后结扎远端结扎线。
  5. 使用三通阀将导管远端连接至充满生理盐水的微型管和外部储液器。

4. 尾动脉插管

  1. 使用聚维酮碘和70%乙醇擦拭尾部腹侧区域，并做一条2厘米的皮肤切口。
  2. 用弯头镊子和钝头镊子将尾动脉从周围结构中分离出来，并分离出1厘米长的动脉节段。
  3. 使用4.0黑色丝线缝合线，在动脉的近端和远端分别打松结，以最大程度暴露手术区域。
  4. 使用24 G静脉导管穿刺尾动脉，并将导管推进动脉内。
  5. 用近端结扎线在距离导管头约1厘米处将导管固定于血管上，并扎紧远端结扎线。
  6. 将导管的远端连接至动脉压监测装置。

5. 脊髓缺血的诱导

  1. 导管插入完成后，将2 Fr.带球囊导管推进至胸降主动脉，使导管尖端到达左锁骨下动脉。
  2. 插入深度为距穿刺点10 cm。
  3. 通过颈动脉导管注入150单位肝素，浓度为100单位/mL。
  4. 用0.05 mL生理盐水充盈导管球囊。
  5. 同时，从颈动脉将血液引流至体外血袋，调节近端动脉压至80 mmHg。
  6. 将动脉压监测系统连接至三通阀的剩余管腔，并在监测动脉压的同时控制血液引流的量。
  7. 通过远端动脉压突然下降并持续消失来确认主动脉阻断成功。
  8. 在主动脉阻断9、10或11分钟后，放空Fogarty导管球囊，并将引流的血液回输。

6. 术后护理与神经功能评估

  1. 通过尾动脉监测动脉压的同时，移除股动脉和颈动脉的导管，并用丝线缝合伤口。
  2. 确认动脉压恢复至正常范围后，移除尾动脉内的导管并闭合伤口。
  3. 麻醉恢复后，将大鼠放回其笼中。
  4. 术后24小时采用运动功能障碍指数（表1）评估后肢运动功能。运动功能障碍指数定义为行走评分与放置/踏步反射评分之和。运动功能障碍指数为6时，表示功能缺损最严重。

7. 组织病理学评估

  1. 神经功能评估后，使用面罩输送异氟烷对大鼠进行麻醉，在麻醉状态下通过经心灌注100 mL肝素化生理盐水处死动物，并取出脊髓。8
  2. 将腰椎3-5节段的脊髓组织切片包埋于石蜡中。
  3. 对横切面进行苏木精和伊红（H & E）染色。
  4. 在显微镜下观察运动神经元损伤情况。9

8. 统计分析

  1. 使用社会科学统计软件包第20版进行统计分析。采用Kruskal-Wallis检验比较三组的运动功能缺损指数，随后进行Mann-Whitney U检验。P-值<0.05被认为具有统计学显著性。

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结果

在脊髓缺血期间，进行主动脉阻断，持续时间为9分钟（n=3）、10分钟（n=3）或11分钟（n=3）。大鼠运动功能障碍指数见表2。接受9分钟主动脉阻断的大鼠表现为轻度且可逆的后肢运动功能障碍。接受10分钟主动脉阻断的大鼠出现中度运动功能障碍，但未发生完全性瘫痪。接受11分钟阻断时间的大鼠则表现为完全且持续的瘫痪。

代表性照片显示了用H&E染色的脊髓切片，见图1。在主动脉阻断时间较短的大鼠中，脊髓切片中的运动神经元保存得更为完整。

随时间推移的组织变性；用于分析的第9、10和11分钟显微镜图像。
图1

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讨论

在本研究中，我们基于Taira和Marsala的方法5建立了一种脊髓缺血的大鼠模型，该模型可根据主动脉阻断时间的不同，诱导出后肢不同程度的运动功能障碍。

主动脉阻断的时长会影响运动功能缺损的程度。主动脉阻断时间越长，运动功能缺损越严重。因此，研究人员可通过控制该模型中的主动脉阻断时间，来实现特定程度的运动功能缺损。

本模型涉及颈总动脉和股动脉的结扎，而结扎这些动脉可能导致神经功能缺损，这是需要关注的潜在问题。然而，大鼠具有高效的侧支循环系统。因此，当颈总动脉或股动脉被结扎后，广泛的侧支网络能够提供足够的血流。据报道，单侧颈总动脉闭塞仅对脑血流量产生轻微影响。10,11 尽管单侧颈总动脉闭塞可在大鼠中引发脑卒中，但这种情况仅在合并严重全身性低氧时才会发生。12 在本实验过程中，未发生全身性低氧，且所有大鼠均未出现提示脑...

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披露

作者无竞争性财务利益。本工作由韩国政府国家研究基金会资助，资助号为2012R1A1A3014010。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
福加蒂动脉取栓导管Edward Life Sciences120602F插入股动脉的带球囊导管
BD Insyte-N Autoguard Shielded IV 导管 BD 38141124 号静脉导管
50 mL 注射器KOREA VACCINE KOVAX-SYRINGE 50mL面部口罩
1 mL 注射器KOREA VACCINEKOVAX-SYRINGE 1ml
直肠探头HARVARD APPARATUS50-7221F用于体温监测的直肠探头
微型解剖弹簧剪刀Jeung do bio & Plant co.LTD.JD-S-10微型剪刀
剪刀（锐-锐）Jeung do bio & Plant co.LTD.S-51-12-S剪刀
拉钩Jeung do bio & Plant co.LTD.JD-S-74A拉钩
微型镊子 Jeung do bio & Plant co.LTD.JD-S-29微型镊子
蚊式镊（弯型）Jeung do bio & Plant co.LTD.S-44-CPK弯型镊子
敷料镊 Jeung do bio & Plant co.LTD.S-37-16S钝头镊子
4/0 黑色丝线 Woori MedicalS4314.0 黑色丝线缝合线
三通接头Seonwon MedcalD-98-01三通旋塞阀
病人监护仪PHILIPSMP20动脉压监测装置。 
加热毯自制加热毯
微量管和外部储液器自制微量管和外部储液器
肝素JW Pharmaceutical肝素
0.9% NS 1000mlJW Pharmaceutical生理盐水
异氟烷Hana Med异氟烷

参考文献

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