本文报道了一种利用磁性激活细胞分选（MCS）从血管周围脂肪组织（PVAT）中分离脂肪细胞前体细胞（APC）群体的方法。与荧光激活细胞分选（FACS）相比，该方法可显著提高每克脂肪组织中APC的分离效率。
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摘要
摘要
血管周围脂肪组织（PVAT）通过旁分泌信号通路调节血管功能，其扩张与肥胖期间高血压的发生直接相关。脂肪细胞肥大和增生的程度取决于脂肪库的位置、性别以及存在的脂肪细胞前体细胞（APC）表型类型。过去十年中，用于分离APC和前脂肪细胞的技术已显著提高了基于特定细胞表面标志物识别单个细胞的准确性。然而，由于细胞本身较为脆弱，特别是当需要保持细胞完整性以用于细胞培养应用时，APC和脂肪细胞的分离仍具有挑战性。
磁激活细胞分选（MCS）提供了一种每单位质量脂肪组织中分离出更多可存活APC的方法。通过MCS收获的APC可用于 体外 扩增前脂肪细胞并利用生长因子混合物将其诱导分化为脂肪细胞的方案，可用于分析细胞所保留的增殖能力及脂肪生成潜能。本实验重点关注主动脉和肠系膜周围血管脂肪组织（PVAT）脂肪库，这些脂肪库在组织扩张过程中对心血管疾病的发展具有关键作用。本方案描述了分离、扩增和分化特定脂肪前体细胞（APC）群体的方法。该多细胞悬液（MCS）方案可在仅需最少设备和培训的条件下实现细胞分离，适用于任何需要细胞分选的实验。这些技术有助于进一步开展基于细胞表面标志物表达来确定特定细胞群体功能的实验。
引言
由于血管周围脂肪组织（PVAT）紧邻血管，因此在血管功能中发挥重要的旁分泌信号作用1。该脂肪组织的扩展依赖于其中存在的脂肪细胞前体细胞（APC）的表型2,3。由于原代脂肪细胞脆弱、具有浮力且大小不一，从脂肪组织中分离细胞十分困难。某些分离技术还可能通过增加炎症蛋白的合成并减少脂肪生成相关基因的表达，从而改变细胞的表型和形态4，这凸显了建立一种能够维持细胞完整性的实验方案的重要性。
原代细胞及特定前脂肪细胞亚群的培养为研究提供了简化的实验方法 体内 生长并保持相同的细胞遗传组成5，尽管由于细胞老化或衰老导致其状态逐渐下降，对这些细胞的操作时间有限6不同脂肪储存部位（包括皮下和网膜部位）的前脂肪细胞在增殖能力上也表现出差异7，这强调了从特定解剖位点收集细胞的重要性。既往研究已对非PVAT白色脂肪库中的前体细胞进行了表征。7,8,9
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方案
本文所述所有实验步骤均遵循密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）制定的指南。所有缓冲液和培养基均应避光保存。
1. 缓冲液、培养基和仪器的准备
- 配制 Krebs Ringer 碳酸氢盐缓冲液（KRBB）：135 mM 氯化钠、5 mM 氯化钾、1 mM 硫酸镁、0.4 mM 磷酸氢二钾、5.5 mM 葡萄糖、1% 抗生素/抗真菌剂（10,000 单位/mL 青霉素、10,000 µg/mL 链霉素、25 µg/mL 两性霉素 B）和 10 mM HEPES（pH = 7.4）。该溶液在无菌条件下 4 °C 保存时可稳定存放 3 周。
- 配制 I 型胶原酶溶液：在含 4% 牛血清白蛋白（BSA）的 KRBB 中配制成 1 mg/mL 浓度。该溶液应于 37 °C 保存，且在 4 小时内使用有效。
- 配制红细胞裂解缓冲液：154 mM 氯化铵、10 mM 碳酸氢钾和 0.1 mM EDTA。4 °C 条件下可保存长达一个月。
- 配制 MCS 封闭缓冲液：DMEM/F12 培养基基础液、10% 胎牛血清（FBS）、5% 正常驴血清、40 µL/mL F(ab) 片段驴抗大鼠 IgG。4 °C 条件下可保存长达一个月。
- 配制 MCS 缓冲液：磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.5）、0.5% BSA 和 2 mM EDTA。4 °C 条件下可保存长达一个月。使用前将溶液在玻....
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结果
前脂肪细胞的增殖能力及脂肪细胞前体的成脂潜能是得以维持的特性 体外11. 体外 通过定量DNA检测法评估了从雄性大鼠aPVAT、mPVAT和GON分离的SVF和APC在接种后8、24、48和96小时的增殖情况。除aPVAT来源的APC在96小时时增殖程度低于同部位SVF细胞外，其余各时间点均未观察到不同部位间SVF扩增速率的差异。图1).
汇合的APC在标准诱导前经骨形态发生蛋白4（BMP4）刺激48小时12 表现出分化，这通过荧光脂质摄取实验评估可见脂滴中脂质积累更显著图2A）以及油红O染色（图2
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讨论
本实验的核心目标是从血管周围脂肪组织（PVAT）储存库中分离、扩增并诱导脂肪前体细胞（APC）向脂肪细胞分化。本文介绍了一种基于鉴定表达表面标志物CD34和PDGFRα的细胞来分离APC的实验方案。先前研究已发现，这些表面蛋白存在于具有高增殖能力的APC中，并且这些细胞具有分化为白色或棕色脂肪细胞的潜能，广泛分布于多种脂肪组织储存库中14,15。通过选择表达上述特异性标志物的细胞，我们能够从多个脂肪组织储存库中分离出与所选PVAT中观察到的脂肪细胞表型一致的相似APC群体13。在本实验中，我们通过在培养体系中添加生长因子BMP4，优化了APC的分化效果。此前，Macotela及其同事的研究表明，内脏脂肪组织来源的特定APC群体在分化过程中，其BMP活性低于皮下脂肪组织来源的群体，除非在培养基中补充脂肪生成相关的生长因子BMP2或BMP412,16,.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Contreras 实验室、Watts 实验室以及 William Raphael 博士。本实验得到了以下资助：NHLBI F31 HL128035-01（组织消化方案的标准化）、NHLBI 5R01HL117847-02 和 2P01HL070687-11A1（动物实验）、以及 NHLBI 5R01HL117847-02（细胞分离与培养）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 组织解剖 | |||
| 解剖皿 | 硅胶手工制作 | ||
| 培养用培养皿 | Pyrex | 7740 玻璃 | |
| 硅橡胶弹性体 | Dow Corning | Sylgard 170 | 试剂盒 |
| 编织丝线缝合线 | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| 立体显微镜 MZ6 | Leica | 10447254 | |
| 立体显微镜光纤光源 | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas 剪刀 | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| 碎屑镊 | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| 组织剪刀 | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB 溶液 | |||
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 硫酸镁 | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 磷酸氢二钾 | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| 抗生素/抗真菌剂 | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| 组织消化 | |||
| Ⅰ型胶原酶 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | BioLegend | 420301 | 1X 工作液 |
| 水浴锅 | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | 往复式振荡水浴 |
| 生物安全柜 | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| 旋转式培养箱 | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm 细胞筛 | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | 黄色 |
| 40 µm 细胞筛 | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | 蓝色 |
| 血细胞计数板 | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| 台盼蓝 | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| 细胞分离 | |||
| OctoMACS 试剂盒 | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 培养基 | Corning | 90-090 | 基础培养基 |
| 胎牛血清 (FBS) | Corning | 35016CV | 美国来源 |
| 正常驴血清 | AbCam | AB7475 | |
| 抗 CD34 抗体 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC 标记 |
| 抗 PDGFRα 抗体 | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| 驴抗兔 IgG 抗体 | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) 10X | Corning | 46-013-CM | 1X 工作液 |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| 细胞培养 | |||
| CO2 细胞培养箱 | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6 孔板 | Corning | 3516 | TC 处理 |
| 48 孔板 | Corning | 3548 | TC 处理 |
| 96 孔板，黑色壁 | Corning | 353376 | TC 处理 |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC 处理 |
| 胎牛血清 (FCS) | Corning | 35011CV | 美国来源 |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| 生物素 | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| 泛酸盐 | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-谷氨酰胺 | Corning | 61-030 | |
| 骨形态发生蛋白 4 (BMP4) | Prospec Bio | CYT-081 | |
| 表皮生长因子 (EGF) | PeproTech | 400-25 | |
| 白血病抑制因子 | PeproTech | 250-02 | |
| 血小板源性生长因子 BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) | PeproTech | 450-33 | |
| 胰岛素 | Corning | 25-800-CR | ITS 溶液 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (三碘甲腺原氨酸) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| 细胞分析 | |||
| CyQUANT 增殖检测 | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed 荧光检测试剂 | Lonza | PT-7009 | |
| 油红 O 脂质染色试剂 | Sigma-Aldrich | O1391 | 溶液形式 |
| M1000 微孔板读数仪 | Tecan | ||
| Eclipse 倒置显微镜 | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qi1 相机 | Nikon |
参考文献
- Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
- Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems.
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重印与许可
