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方法文章

通过磁性激活细胞分选法分离的血管周围脂肪组织中脂肪细胞前体的扩增与脂肪生成诱导

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DOI：

10.3791/55818

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2017年6月30日

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1Department of Large Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Department of Pharmacology and Toxicology, Michigan State University

本文内容

摘要

本文报道了一种利用磁性激活细胞分选（MCS）从血管周围脂肪组织（PVAT）中分离脂肪细胞前体细胞（APC）群体的方法。与荧光激活细胞分选（FACS）相比，该方法可显著提高每克脂肪组织中APC的分离效率。

摘要

血管周围脂肪组织（PVAT）通过旁分泌信号通路调节血管功能，其扩张与肥胖期间高血压的发生直接相关。脂肪细胞肥大和增生的程度取决于脂肪库的位置、性别以及存在的脂肪细胞前体细胞（APC）表型类型。过去十年中，用于分离APC和前脂肪细胞的技术已显著提高了基于特定细胞表面标志物识别单个细胞的准确性。然而，由于细胞本身较为脆弱，特别是当需要保持细胞完整性以用于细胞培养应用时，APC和脂肪细胞的分离仍具有挑战性。

磁激活细胞分选（MCS）提供了一种每单位质量脂肪组织中分离出更多可存活APC的方法。通过MCS收获的APC可用于 体外 扩增前脂肪细胞并利用生长因子混合物将其诱导分化为脂肪细胞的方案，可用于分析细胞所保留的增殖能力及脂肪生成潜能。本实验重点关注主动脉和肠系膜周围血管脂肪组织（PVAT）脂肪库，这些脂肪库在组织扩张过程中对心血管疾病的发展具有关键作用。本方案描述了分离、扩增和分化特定脂肪前体细胞（APC）群体的方法。该多细胞悬液（MCS）方案可在仅需最少设备和培训的条件下实现细胞分离，适用于任何需要细胞分选的实验。这些技术有助于进一步开展基于细胞表面标志物表达来确定特定细胞群体功能的实验。

引言

由于血管周围脂肪组织（PVAT）紧邻血管，因此在血管功能中发挥重要的旁分泌信号作用1。该脂肪组织的扩展依赖于其中存在的脂肪细胞前体细胞（APC）的表型2,3。由于原代脂肪细胞脆弱、具有浮力且大小不一，从脂肪组织中分离细胞十分困难。某些分离技术还可能通过增加炎症蛋白的合成并减少脂肪生成相关基因的表达，从而改变细胞的表型和形态4，这凸显了建立一种能够维持细胞完整性的实验方案的重要性。

原代细胞及特定前脂肪细胞亚群的培养为研究提供了简化的实验方法 体内 生长并保持相同的细胞遗传组成5，尽管由于细胞老化或衰老导致其状态逐渐下降，对这些细胞的操作时间有限6不同脂肪储存部位（包括皮下和网膜部位）的前脂肪细胞在增殖能力上也表现出差异7，这强调了从特定解剖位点收集细胞的重要性。既往研究已对非PVAT白色脂肪库中的前体细胞进行了表征。7,8,9但对PVAT中APC表型的了解较少。

本文所述技术可对特定且明确的抗原呈递细胞（APC）群体进行分析，同时对其形态、活力以及增殖和分化潜能的影响降至最低。磁珠激活细胞分选（MCS）适用于后续实验操作（如细胞培养），因为磁珠在不改变细胞特性的前提下可自行降解。MCS 还具有成本效益，且一旦抗体浓度完成标准化，对流式细胞术检测的需求将大大减少。体外研究脂肪组织血管周围前体细胞（PVAT 前体细胞）也有助于了解这些原代细胞可能具备的潜能。

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方案

本文所述所有实验步骤均遵循密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）制定的指南。所有缓冲液和培养基均应避光保存。

1. 缓冲液、培养基和仪器的准备

  1. 配制 Krebs Ringer 碳酸氢盐缓冲液（KRBB）：135 mM 氯化钠、5 mM 氯化钾、1 mM 硫酸镁、0.4 mM 磷酸氢二钾、5.5 mM 葡萄糖、1% 抗生素/抗真菌剂（10,000 单位/mL 青霉素、10,000 µg/mL 链霉素、25 µg/mL 两性霉素 B）和 10 mM HEPES（pH = 7.4）。该溶液在无菌条件下 4 °C 保存时可稳定存放 3 周。
  2. 配制 I 型胶原酶溶液：在含 4% 牛血清白蛋白（BSA）的 KRBB 中配制成 1 mg/mL 浓度。该溶液应于 37 °C 保存，且在 4 小时内使用有效。
  3. 配制红细胞裂解缓冲液：154 mM 氯化铵、10 mM 碳酸氢钾和 0.1 mM EDTA。4 °C 条件下可保存长达一个月。
  4. 配制 MCS 封闭缓冲液：DMEM/F12 培养基基础液、10% 胎牛血清（FBS）、5% 正常驴血清、40 µL/mL F(ab) 片段驴抗大鼠 IgG。4 °C 条件下可保存长达一个月。
  5. 配制 MCS 缓冲液：磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.5）、0.5% BSA 和 2 mM EDTA。4 °C 条件下可保存长达一个月。使用前将溶液在玻璃容器中加热至 37 °C 并抽真空 15 秒以去除气体。未使用的缓冲液应密封保存。
  6. 配制基质血管组分（SVF）基础培养基：Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）:F12、15% 胎牛血清（FCS）、1% 抗生素/抗真菌剂（10,000 单位/mL 青霉素、10,000 µg/mL 链霉素、25 µg/mL 两性霉素 B）、44.05 mM 碳酸氢钠、100 µM 抗坏血酸、33 µM 生物素、17 µM 泛酸盐、2 mM L-谷氨酰胺和 20 mM HEPES。无菌条件下 4 °C 保存，最长可保存 2 周。
  7. 配制 APC 培养基：在基础培养基中添加额外的生长因子，包括表皮生长因子（10 ng/mL）、白血病抑制因子（10 ng/mL）、血小板源性生长因子 BB（10 ng/mL）和碱性成纤维细胞生长因子（5 ng/mL）。无菌条件下 4 °C 保存，最长可保存 2 周。
  8. 配制 APC 诱导培养基：在 APC 培养基中加入 10% FBS、2.5 µg/mL 胰岛素、0.5 mM 2-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、1 µM 地塞米松和 200 pM T3（三碘甲腺原氨酸甲状腺激素）。无菌条件下 4 °C 保存，最长可保存 2 周。

2. 脂肪细胞前体的分离

  1. 根据机构指南对大鼠进行麻醉。将大鼠置于仰卧位。通过夹趾测试确认麻醉深度，并观察对该疼痛刺激的反射反应是否消失。
    注意：本方案使用10周龄的Sprague Dawley大鼠，通过腹腔注射给予70 mg/kg戊巴比妥钠。
  2. 使用剪刀沿胸骨区域从胸部至会阴部做一条垂直正中切口。进入腹腔，暴露肠系膜上动脉、小肠系膜阻力血管（mPVAT）和胸主动脉（aPVAT）。
    1. 切断肠系膜和主动脉的所有连接，取出血管。使用解剖显微镜和盛有KRBB溶液的培养皿观察血管，并分离PVAT。
    2. 在本实验中，采集性腺脂肪组织（GON）作为非PVAT脂肪库的代表。将分离的脂肪垫置于含10 mM HEPES（pH = 7.4）的KRBB溶液中并放在冰上。
    3. 在生物安全柜中，将约50 mg组织转移至含有1 mL I型胶原酶溶液的1.7 mL离心管中，用组织剪将其剪碎（1–3 mm大小片段）。
  3. 将样品在37 °C条件下于旋转培养箱（或配备轨道摇床的培养箱）中孵育1小时进行消化。在生物安全柜中，依次通过100 µm和40 µm细胞筛网将消化后的材料过滤至50 mL离心管中。将滤液在4 °C下以300 × g离心10分钟。
    注意：从本步骤起，本方案中的所有操作均需在生物安全柜中进行，以保持细胞无菌状态。
  4. 倒去上清液，将含有SVF细胞的沉淀重悬于1 mL 1X红细胞裂解缓冲液中，并转移至1.7 mL微量离心管。室温避光孵育5分钟，随后在4 °C下以300 × g离心5分钟。
  5. 倒去上清液，将剩余的细胞沉淀重悬于SVF基础培养基中。取20 µL样品用于台盼蓝溶液计数活细胞。
    注意：可分离得到的SVF细胞数量因组织来源而异。每毫克组织平均收获的SVF细胞数为：aPVAT = 5.0 ±2.0×103，mPVAT = 1.04 ±0.62×104，GON = 2.4 ±1.2×105。

3. 磁珠激活细胞分选

注意：通过在 4 °C 下进行所有步骤，根据 CD34 和 PDGFRα 细胞表面标志物从 SVF 中分离 APC。

  1. 以 300 × g 离心细胞 5 分钟。倒去上清液，并将细胞沉淀重悬于 MCS 封闭缓冲液中，调整细胞密度至 1 × 106 个细胞/mL，孵育 20 分钟。
    注意：细胞悬液浓度在 1 × 106 – 2 × 108 个细胞/mL 范围内均可有效分离。
  2. 加入 5 µL FITC 标记的小鼠抗 CD34 抗体（每 1 × 106 个细胞使用 1 µg），4 °C 下孵育 30 分钟。随后以 300 × g、4 °C 离心 5 分钟。
    1. 避光条件下，加入 4 µL 抗 FITC 微珠和 96 µL MCS 缓冲液（总体积 100 µL），4 °C 孵育 5 分钟，以分离 CD34+ 和 CD34− 细胞。
  3. 将磁力分离器固定于支架上，将 MultiSort（MS）分选柱（柱翼朝前）插入分离器中。在上方试管架中放置一个 5 mL 收集管，置于分选柱下方用于收集流出液。
  4. 用 MCS 缓冲液冲洗 MS 分选柱以进行预处理。向分选柱顶部加入 500 µL MCS 缓冲液，让缓冲液自然流下。弃去流出液，并更换新的收集管。
  5. 将抗体标记的细胞悬液加至预处理好的 MS 分选柱中。收集流穿液，其中含有未标记的细胞。
  6. 用 500 µL 脱气的 MCS 缓冲液洗涤 MS 分选柱 3 次。每次收集未标记的穿流细胞，并合并至前一步骤收集的流穿液中。
  7. 将 MS 分选柱从磁力分离器上取下，置于一个新的收集管上。用移液器向分选柱中加入 1 mL MCS 缓冲液。立即用随柱附带的推杆用力但缓慢地冲洗分选柱，快速洗脱磁性标记的细胞，注意避免过多气体进入分选柱。
    注意：不同实验位点分离得到的细胞数量可能存在差异。每毫克组织中从 SVF 细胞群分离得到的 CD34+ APC 平均数量为：aPVAT = 2.6 ± 0.43 × 102，mPVAT = 9.6 ± 1.4 × 102，GON = 1.3 ± 0.22 × 103。
  8. 以 300 × g、4 °C 离心细胞 5 分钟。将分离得到的 CD34+ 细胞组分重悬于 10 µL 含 1:200 稀释度/1 × 106 个细胞的兔抗 PDGFRα 抗体溶液中，4 °C 孵育 30 分钟。
    1. 再次以 300 × g、4 °C 离心 5 分钟。将标记后的细胞与 4 µL 抗兔 IgG 微珠和 96 µL MCS 缓冲液混合，重复步骤 3.3 至 3.7 的操作进行分离。
      注意：不同实验位点分离得到的细胞数量可能存在差异。每毫克组织中从 CD34+ 细胞群分离得到的 PDGFRα+ APC 平均数量为：aPVAT = 2.4 ± 0.64，mPVAT = 8.4 ± 2.4，GON = 10.4 ± 1.9，约占此前分离细胞群的 0.5 – 10%。

4. 细胞培养与脂肪生成诱导

  1. 将SVF和APC在6孔组织培养板中用基础培养基进行培养，每2天更换一次培养基。经过连续3次传代后，将细胞以每孔1×102个细胞的密度接种至黑色96孔组织培养板中用于增殖实验，分别在8、24、48和96小时进行检测；或以每孔50,000个细胞接种至24孔板，或以每孔10,000个细胞接种至48孔组织培养板中用于脂肪生成实验，该实验为定性和定量分析。
  2. 在细胞达到融合后48小时及诱导分化前，向APC基础培养基中添加骨形态发生蛋白4（3.3 nmol/L），按文献指示操作10。在细胞达到100%融合后48小时（第0天），使用APC诱导培养基对细胞进行诱导培养。
  3. 48小时后，更换为不含IBMX和地塞米松的APC诱导培养基，继续培养14天，每48小时更换一次培养基。
  4. 通过FACS验证MCS的分离。
    1. 取50 µL（50,000个细胞）磁分离后的细胞样品，用FACS溶液洗涤。
    2. 离心细胞后，重悬于100 µL稀释比例为1:1,000的驴抗兔IgG Dylight 405抗体溶液中，用于标记PDGFRα+细胞。在避光条件下4 °C孵育30分钟。
    3. 洗涤细胞后，重悬于200 µL的2%甲醛溶液中，待用流式细胞仪分析，检测时使用488 nm（FITC）和405 nm（Dylight 405）滤光片。
      注：通过微孔板读数仪使用亲脂性脂肪生成荧光检测试剂对培养细胞的脂质积累进行定量评估，以成脂前体细胞作为脂质积累的校准标准。同时，通过脂质染料染色并结合倒置显微镜成像进行定性检测，可观察含有或不含脂滴的细胞占总细胞的比例。任何能够检测激发波长485 nm、发射波长572 nm荧光的酶标仪，以及任何具备数字图像采集功能的显微镜均可用于分析。

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结果

前脂肪细胞的增殖能力及脂肪细胞前体的成脂潜能是得以维持的特性 体外11. 体外 通过定量DNA检测法评估了从雄性大鼠aPVAT、mPVAT和GON中分离的SVF和APC在接种后8、24、48和96小时的增殖情况。除aPVAT来源的APC在96小时时增殖程度低于同一位点的SVF细胞外，其余各时间点均未观察到不同来源部位之间SVF扩增速率的差异。图1).

经骨形态发生蛋白4（BMP4）刺激48小时后的融合APC细胞，用于标准诱导12 表现出分化，这通过荧光脂质摄取实验评估可见更大的脂滴中脂质积累而得以证实（图2A）以及油红O染色（图2...

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讨论

本实验的核心目标是从血管周围脂肪组织（PVAT）储存库中分离、扩增并诱导脂肪前体细胞（APC）向脂肪细胞分化。本文介绍了一种基于鉴定表达表面标志物CD34和PDGFRα的细胞来分离APC的实验方案。先前研究已发现，这些表面蛋白存在于具有高增殖能力的APC中，并且这些细胞具有分化为白色或棕色脂肪细胞的潜能，广泛分布于多种脂肪组织储存库中14,15。通过选择表达上述特异性标志物的细胞，我们能够从多个脂肪组织储存库中分离出与所选PVAT中观察到的脂肪细胞表型一致的相似APC群体13。在本实验中，我们通过在培养体系中添加生长因子BMP4，优化了APC的分化效果。此前，Macotela及其同事的研究表明，内脏脂肪组织来源的特定APC群体在分化过程中，其BMP活性低于皮下脂肪组织来源的群体，除非在培养基中补充脂肪生成相关的生长因子BMP2或BMP412,16,...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

Contreras 实验室、Watts 实验室以及 William Raphael 博士。本实验得到了以下资助：NHLBI F31 HL128035-01（组织消化方案的标准化）、NHLBI 5R01HL117847-02 和 2P01HL070687-11A1（动物实验）、以及 NHLBI 5R01HL117847-02（细胞分离与培养）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
组织解剖
解剖皿硅胶手工制作
培养用培养皿Pyrex7740 玻璃
硅橡胶弹性体Dow CorningSylgard 170试剂盒
编织丝线缝合线Harvard Apparatus51-7615SP104
立体显微镜 MZ6Leica10447254
立体显微镜光纤光源Fisher Scientific12562-36
Vannas 剪刀George Tiemann & Co160-150
碎屑镊George Tiemann & Co160-55
组织剪刀George Tiemann & Co105-400
KRBB 溶液
氯化钠Sigma-Aldrich7647-14-5
氯化钾Sigma-Aldrich7447-40-7
硫酸镁Sigma-Aldrich7487-88-9
磷酸氢二钾Sigma-Aldrich7758-114
葡萄糖Sigma-Aldrich50-99-7
抗生素/抗真菌剂Corning30-004-CI
HEPESCorning25-060-CI
组织消化
Ⅰ型胶原酶Worthington BiochemicalLS004196
牛血清白蛋白 (BSA)Fisher Scientific9048-46-8
红细胞裂解缓冲液BioLegend4203011X 工作液
水浴锅Thermo-Fisher Scientific2876往复式振荡水浴
生物安全柜Thermo-Fisher Scientific1385
旋转式培养箱DaiggerEF4894C
100 µm 细胞筛Thermo-Fisher Scientific22-363-549黄色
40 µm 细胞筛Thermo-Fisher Scientific22-363-547蓝色
血细胞计数板Cole-ParmerUX-79001-00
台盼蓝Sigma-Aldrich93595
细胞分离
OctoMACS 试剂盒Miltenyi Biotech130-042-108
(DMEM):F12 培养基Corning90-090基础培养基
胎牛血清 (FBS)Corning35016CV美国来源
正常驴血清AbCamAB7475
抗 CD34 抗体Santa CruzSC-7324FITC 标记
抗 PDGFRα 抗体Thermo-Fisher ScientificPA5-17623
驴抗兔 IgG 抗体Jackson ImmunoResearch712-007-003
磷酸盐缓冲液 (PBS) 10XCorning46-013-CM1X 工作液
EDTAFisher Scientific15575020
细胞培养
CO2 细胞培养箱Thermo-Fisher Scientific51030285Heracell 160i 
6 孔板Corning3516TC 处理
48 孔板Corning3548TC 处理
96 孔板，黑色壁Corning353376TC 处理
碳酸氢钠Sigma-Aldrich144-55-8TC 处理
胎牛血清 (FCS)Corning35011CV美国来源
抗坏血酸Sigma-Aldrich50-81-7
生物素Sigma-Aldrich58-85-5
泛酸盐Sigma-Aldrich137-08-6
L-谷氨酰胺Corning61-030
骨形态发生蛋白 4 (BMP4)Prospec BioCYT-081
表皮生长因子 (EGF)PeproTech400-25
白血病抑制因子PeproTech250-02
血小板源性生长因子 BBProspec BioCYT-740
碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)PeproTech450-33
胰岛素Corning25-800-CRITS 溶液
IBMXSigma-Aldrich28822-58-4
地塞米松Sigma-Aldrich50-02-2
T3 (三碘甲腺原氨酸)Sigma-Aldrich6893-023
细胞分析
CyQUANT 增殖检测Thermo-Fisher ScientificC7026
AdipoRed 荧光检测试剂LonzaPT-7009
油红 O 脂质染色试剂Sigma-AldrichO1391溶液形式
M1000 微孔板读数仪Tecan
Eclipse 倒置显微镜Nikon
Digital Sight DS-Qi1 相机Nikon

参考文献

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脂肪细胞前体细胞基质血管组分细胞扩增方案CD34标志物分离PDGFRα阳性细胞组织培养技术增殖检测方案
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