用于从离体大鼠心脏收集间质渗出液的倒置心脏模型

摘要

本方案描述了一种从离体灌注大鼠心脏中收集心肌间质液的方法。为了将间质渗出液与冠状静脉流出的灌注液在物理上分离，将兰格多夫（Langendorff）灌注的心脏倒置，并使用柔软的乳胶帽收集心脏表面形成的渗出液（间质液）。

摘要

本方案描述了一种独特的方法，可从分离的、经生理盐水灌注的大鼠心脏中收集心源性渗出液（CT）。在采用Langendorff技术进行心脏分离并逆行灌注后，将心脏翻转至倒置位置，并通过插入左心室的球囊导管进行机械固定。随后，将一个预先塑形、与大鼠心脏平均尺寸相匹配的薄乳胶帽覆盖于心外膜表面。乳胶帽的出口连接硅胶管，其远端开口位于心脏基底水平下方10 cm处，从而产生轻微负压吸引。持续在心外膜表面生成的CT被收集于冰浴冷却的小瓶中，以供后续分析。在对照组和梗死心脏中，CT的生成速率介于17至147 µL/min之间（n = 14），约占冠状静脉回流灌注液的0.1%-1%。蛋白质组学分析和高效液相色谱法（HPLC）结果显示，所收集的CT中含有多种蛋白质和嘌呤能代谢物。

引言

心力衰竭（HF）是全球人类死亡的主要原因¹心力衰竭常由心肌炎、心肌缺血性损伤及左心室重构引起，导致心脏收缩功能进行性恶化以及患者生活质量下降。尽管心脏病学和心脏外科领域的进展已显著降低了心力衰竭的死亡率，但这些治疗手段仅能起到暂时缓解作用 "延迟剂" 一种不可避免的进行性疾病过程，具有显著的发病率。因此，目前缺乏有效治疗手段凸显了识别能够预防甚至逆转心力衰竭的新型分子靶点的必要性。这包括细胞外基质的改变、失控的心脏免疫反应以及心肌细胞与非心肌细胞之间的相互作用².

必须认识到，心肌细胞所处的微环境会直接影响受损心脏的免疫反应和再生能力。在用生理盐水灌注的离体心脏中，心包液（CT）以微小液滴的形式出现在心脏表面，这些液滴来源于间质液腔隙即， 微环境），在生理和病理生理条件下^3,4,5因此，对CT的分析（即， 组织间液可能有助于识别调控心肌代谢和收缩功能的因素⁶ 或在迁移至受损心脏后影响免疫细胞功能。这可能有助于开发治疗心力衰竭的新型治疗策略。

从小鼠心脏收集心肌组织液（CT）在技术上具有挑战性。在常规的Langendorff灌注心脏模型中，由于CT与冠状静脉流出液混合，导致从间质空间释放的代谢物或酶浓度被不可预测地稀释，因此难以单独收集纯净的CT。一种可能的解决方案是通过插管肺动脉并同时结扎肺静脉来排除静脉流出液⁷。然而，该方法在实施肺动脉和肺静脉插管与结扎时存在操作困难，可能导致静脉流出液渗漏进入心肌组织液。采用反向心脏模型的概念最早由Kammermeier团队提出，他们将离体灌注的心脏倒置，并在心外膜表面放置一个薄的乳胶帽，从而实现连续采集不受静脉流出液污染的CT^8,9。利用该方法，研究已证实CT可灵敏地反映心脏释放的代谢物⁹、脂肪酸通过毛细血管的转运过程⁸以及病毒颗粒的分布情况¹⁰。

最近，旁分泌因子可能调节局部免疫反应并促进心脏血管生成¹¹ 已被证实参与干细胞治疗心脏病的有益作用。对逆转心脏中的CT进行分析可能有助于从化学角度鉴定这些特定的旁分泌因子。此外，CT还可能有助于鉴定参与其中的其他因子 体内 心脏中免疫细胞的活化

本文提供的从心脏表面采集CT的详细描述，对于研究免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞和心肌细胞之间相互作用及其与整体心脏功能关系的研究人员具有实验上的实用价值。如上所述，组织间液携带了心脏内细胞间通讯的信息，而通过采集CT可方便地评估这些信息。包括如何从反向心脏采集CT的视频方案在内的详细技术说明，将有助于推动这一独特技术的未来应用。

方案

所有实验均经德国北莱茵-威斯特法伦州地方监管机构（LANUV）批准，并依照动物使用指南进行。动物饲喂标准维持饲料，并可自由饮用自来水。ad libitum。实验各步骤所需的全部设备与化学品详见材料表。

1. 乳胶帽和脑室内球囊的制备

1. 使用铣床制作一个与大鼠心脏平均大小相匹配的铝制模具（体重为300-350 g）。用超细（10/0）砂纸对模具进行抛光。
   注意：模具的详细尺寸见图1A。
2. 将铝制模具的颈部垂直固定在铣床上，以制备乳胶帽。
   注意：铣床使模具缓慢旋转。也可使用电动机替代。
3. 将20 mL液态乳胶（ commercially purchased，参见材料表）倒入50 mL玻璃烧杯中。
4. 将模具下放，直至模具整体浸入乳胶溶液中。
5. 在旋转的同时缓慢提起模具（5 cm/min）。
6. 继续旋转模具额外15分钟，直至模具表面的乳胶完全固化。
7. 向模具表面（已覆盖一层薄乳胶膜）加入约1 g滑石粉，以防止脱模时损坏。
8. 用手指轻轻将已干燥的乳胶帽从模具表面剥离；乳胶帽现已可使用（图1B）。
9. 将乳胶帽的出口连接至一段15 cm长的硅胶管（内径 = 0.2 mm），用于后续收集CT。
10. 用水填充心室乳胶气囊，并将其牢固固定在L形金属套管上，该套管连接一个装满水的1 mL注射器（图1C）。
    注意：此装置将用于确保心脏的直立位置（见下文）。
11. 使用连接的1 mL注射器进行多次充气/放气测试，确保气囊密封不漏气。
12. 通过三通阀将套管连接至压力传感器，用于后续测量心室内发展压（图1C）。

2. 克雷布斯-亨塞莱特缓冲液（KHB）和朗根多夫灌流系统的准备

1. 使用恒流模式（由滚压泵驱动）或恒压模式（由玻璃柱中的静水压产生）建立 Langendorff 灌流系统。
   注意：Langendorff 心脏制备的详细步骤此前已有描述¹²。
2. 配制 2 L 改良 KHB 溶液（单位：mM：116.02 NaCl、4.63 KCl、1.10 MgSO₄·7H₂O、1.21 K₂HPO₄、2.52 CaCl₂·2H₂O、24.88 NaHCO₃、8.30 D-葡萄糖和 2.0 丙酮酸钠）。
   1. 称取除 CaCl₂ 外的所有化学试剂，加入 1.8 L 双蒸水中，在 2 L 烧瓶中溶解。
   2. 在磁力搅拌下，用碳氧混合气（95% O₂/5% CO₂）通气至少 5 分钟，使溶液平衡至 pH 7.4。
   3. 加入 0.74 g CaCl₂·2H₂O，并用双蒸水定容至 2 L。
   4. 继续磁力搅拌并用碳氧混合气通气 5 分钟。
   5. 用 0.2 µm 滤膜过滤 KHB 溶液，以去除可能阻塞心脏微循环的小颗粒。
3. Langendorff 灌流系统的准备。
   1. 将过滤后的 KHB 溶液置于预热的水浴中（38 °C），持续用碳氧混合气通气，使 KHB 储液瓶内压力达到 100 cmH₂O。
   2. 将储液瓶连接至玻璃柱，建立 100 cmH₂O 的静水压，用于 KHB 的 Langendorff 灌流；同时继续在玻璃柱内用碳氧混合气对 KHB 通气。
   3. 调节加热系统温度，使主动脉插管出口处的液体温度为 37 °C。
   4. 确保管路系统中无气泡。
   5. 继续用碳氧混合气对 KHB 氧合 5 分钟，直至 KHB 中的 PO₂ 达到 500–600 mmHg（通过血气分析仪测定）。
4. 设置灌流系统，通过手动切换实现 100 cmH₂O 的恒压灌流或约 10–20 mL/min 的恒流灌流。或者，使用可互换的 STH 泵控制器，实现灌流模式的即时切换。

3. 心脏的分离与插管

注意：使用体重为 300–350 g 的雄性 Wistar 大鼠，以确保心脏大小与预制成型的乳胶帽相匹配。大鼠接受左前降支冠状动脉（LAD）结扎 50 分钟，随后进行再灌注，或仅进行假手术。心肌梗死（MI）诱导方法的详细步骤已在其他文献中报道¹³。在梗死动物中，倒置心脏实验于手术后第 5 天进行。

1. 使用连接动物固定室（20 L）的异氟烷蒸发器（2% V/V）对大鼠进行麻醉。
2. 待大鼠达到深度麻醉后，将其转移至手术台（无温度控制）。
3. 用镊子提起胸骨下方的皮肤和肌肉，用粗剪刀沿肋骨下缘剪开。
4. 使用精细剪刀在肋缘处的膈肌上做一小切口，然后向尾侧剪开肋骨，形成整个腹侧胸壁的皮瓣。
5. 用拇指、食指和中指轻轻抓住心脏，缓慢向上提起，使心脏血管轻微拉伸。
6. 切除心脏直至主动脉完全暴露。
7. 将心脏放入含有50 mL冰冻KHB溶液（4 °C）的100 mL烧杯中，并转移至灌流装置。
8. 立即通过主动脉将心脏套入滴注套管，并用缝线（4-0）牢固结扎。避免气泡进入心脏。
9. 维持恒定灌流压力（100 cmH₂O）。或者，也可采用恒定流速模式（起始流速为20 mL/min）。
   注意：对于经验丰富的操作者，从打开胸腔到将心脏连接至灌流套管的时间应约为3分钟。

4. 逆转心脏模型

1. 轻轻旋转主动脉插管，直至心脏后壁呈正面观（en face view）。
2. 用剪刀去除结缔组织，暴露左心房开口，为心室腔内插管做好准备。
3. 通过左心房将连接于刚性导管的未充气乳胶球囊插入左心室。
4. 向球囊充气，直至其完全充满心室腔（充气体积已在注射器上预先标记）。
5. 将心脏翻转，使其倒置，并通过心室内的球囊导管支撑心脏。
6. 如图1C所示，使用带有刚性金属导管的心室内球囊将倒置的心脏机械固定于直立位置。
7. 调整心脏位置，避免主动脉根部过度扭转。
8. 调节舒张压至3–5 mmHg（由心室内球囊测量；见图1C）。
9. 观察心脏心外膜表面，确保有小液滴形成。
10. 用手指轻轻按压乳胶帽，将其覆盖在整个心脏表面。
11. 确保乳胶帽覆盖大部分心室表面。
12. 如有气泡，用1 mL注射器轻轻抽吸，去除帽内及导管中的气泡。
13. 将CT引流导管的远端开口调节至低于心脏水平10 cm处。
    注意：此操作可通过负静水压实现轻微抽吸。
14. 将CT液滴收集于置于冰盐混合物（冰与NaCl按1:1混合）中的1.5 mL收集管中，共收集约0.15–1.5 mL CT。
    注意：冰盐混合物可使收集管内温度稳定在零度以下（约-4 °C）。
    注意：采样时间取决于实验目的。假手术动物（n = 3）的CT流速约为27 ± 20 µL/min，冠状动脉结扎动物（n = 11）约为100 ± 47 µL/min。
15. 称重后将CT样本在液氮中速冻，并储存于-80 °C，以备后续检测。

5. CT 分析

1. 根据科学问题，使用CT液体进行代谢物分析。
   注意：图 2 和图 3 中所示数据来自恒压灌注（100 cmH₂O），在10分钟内收集到约0.15–1.5 mL的CT液体。该时间和体积足以用于蛋白质组学分析（最低需50 µL；图 2）¹⁴ 和多种嘌呤的高效液相色谱分析（最低需20 µL；图 3）¹⁵。

结果

反转心脏模型可用于在离体、逆向灌注的大鼠心脏中收集心肌间质渗出液（图1A-C）。当以100 cmH₂O的恒定压力进行灌注时，间质液的生成速率介于17至147 µL/min之间，约占离体心脏冠状静脉流出液的0.1%-1%。

通过双辛可宁酸（BCA）法测定，CT 中的蛋白含量为 1.08 ± 0.40 mg/mL（n = 6）。一维凝胶电泳分析（SDS-PAGE）显示，心源性渗出液中存在多种蛋白质（图 2A）。对经历 50 分钟缺血/再灌注心脏所获得的 CT 进行了二维荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）分析。如 图 2B 所示，缺血心脏的 CT 中有多种蛋白质表达上调。在鉴定出的蛋白质中，70.1% 为细胞外基质蛋白，4.6...

讨论

逆转心脏模型基于成熟的朗根多夫心脏灌流技术¹²，通过将心脏倒置并使用刚性心室内球囊导管固定于倒置位置来实现。通过这种方法，心脏间质渗出液可在重力作用下从心脏基底部滴落，从而与冠状静脉流出的灌流液实现物理分离⁹。通过在心脏表面放置一个薄而柔韧的乳胶帽，可连续收集渗出液（CT）。

该方法操作简便，除兰格多夫装置外成本极低。然而，某些步骤在技术上对于获得可重复且稳定的结果至关重要。这些步骤包括确保乳胶帽与心脏形状完全贴合，并覆盖心室表面约90%，而非心房。从动物体内取出心脏至实施逆行灌注的时间应少于3分钟，因为长时间缺血可能改变心脏代谢并促进心源性渗出液的形成。通过心室内球囊测量的左心室舒张末期压力应设定为3–5 mmHg，以适当充盈心室腔。球囊过度充气可能因血管受压而影响冠状动脉血流。样品收集管（1.5 mL离心管）应置于冰上，以防止目标代谢物和蛋白质发生潜在降解。

此外，实验的成功在很大程度上依赖于心脏制备、分离和插管过程中良好的手工...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乳胶溶液	ProChemie	Z-Latex LA-TZ	http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz
铝制模具	自制	-	反向心脏模型
通用烘箱	Memmert	UNB 400	反向心脏模型
乳胶气球	Hugo Sachs	4号尺寸	反向心脏模型
铣床	Proxxon	MF70	反向心脏模型
氯化钠	Sigma	SZBD0810V	化学品
碳酸氢钠	Roth	68852	化学品
氯化钾	Merck	49361	化学品
七水合硫酸镁	Merck	58861	化学品
磷酸二氢钾	Merck	48731	化学品
无水D(+)-葡萄糖	Merck	83371	化学品
二水合氯化钙	Fluka	21097	化学品
天平	VWR	SE 1202	称量化学品
双蒸水	Millpore	-	溶解化学品
医用压力传感器	Gold	-	朗根多夫装置
医用流量探头	Transonic	3PXN	朗根多夫装置
加热循环水浴	Haake	B3 ; DC1	朗根多夫装置
实验室及真空管路	Tygon	R-3603	朗根多夫装置
动物研究用流量计	Transonic	T206	朗根多夫装置
PowerLab 数据采集设备	AD Instruments	Chart 7.1	朗根多夫装置
LabChart 数据采集软件	AD Instruments	Chart 7.1	朗根多夫装置
蠕动泵	Glison	MINIPULS 3	朗根多夫装置
玻璃水柱	自制	-	朗根多夫装置
水浴防护剂	VWR	462-7000	朗根多夫装置
无菌一次性滤器（0.2 µm）	Thermo Scientific	595-4520	朗根多夫装置
血气分析仪	Radiometer	ABL90 FLEX PLUS	气体分析仪
70% 乙醇	VWR	UN1170	清洗 管路
100% 乙醇	Merck	64-17-5	清洗管路
Wistar 大鼠	Janvier	-	实验动物
不锈钢剪刀	AESCULAP	BC702R	手术器械
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大型镊子	AESCULAP	-	手术器械
8 mm 不锈钢镊子	F.S.T	11052-10	手术器械
超细（10/0）砂纸	3M	051111-11694	反向心脏模型