在培养的海马神经元中测量突触囊泡内吞作用

摘要

通过将突触小泡蛋白与pHluorin融合后的光学显微镜检测以及突触小泡摄取的电子显微镜观察，可检测突触小泡的内吞作用。

摘要

在内吞作用过程中，融合后的突触小泡在神经末梢被回收，从而实现小泡的再利用，维持神经元重复放电期间的突触传递。在病理条件下，内吞功能受损会导致突触强度和脑功能下降。本文描述了在培养神经元的哺乳动物海马突触中测量突触小泡内吞作用的方法。我们通过将突触小泡腔内侧的膜蛋白（包括突触素和VAMP2/突触小泡素）与pHluorin（一种对pH敏感的绿色荧光蛋白，其荧光强度随pH升高而增强）融合，来监测突触小泡蛋白的内吞过程。在胞吐过程中，小泡腔内的pH升高，而在内吞过程中，小泡腔内pH重新酸化。因此，pHluorin荧光强度的增加表示融合事件，而荧光强度的降低则表示标记的突触小泡蛋白发生了内吞。除了使用pHluorin成像法记录内吞过程外，我们还通过电镜（EM）检测辣根过氧化物酶（HRP）被小泡摄取的情况，来监测小泡膜的内吞。最后，我们观察了高钾诱导去极化后不同时间点神经末梢膜凹陷结构的形成。HRP摄取和膜凹陷结构形成的时间进程反映了内吞作用的动力学过程。

引言

神经递质储存在突触小泡中，并通过胞吐作用释放。随后，突触小泡的膜和蛋白质通过内吞作用被回收，用于下一轮的胞吐过程。突触小泡的内吞对于维持突触小泡库的稳定以及清除质膜上突出的小泡具有重要意义。一种对pH敏感的绿色荧光蛋白pHluorin，其在酸性环境中荧光被淬灭，而在中性pH条件下荧光恢复，已被用于在活细胞中测量内吞过程的时间进程^1,2,3。pHluorin通常连接在突触小泡蛋白（如突触素或VAMP2/突触小泡蛋白）的腔内侧。在静息状态下，pHluorin因处于pH为5.5的突触小泡腔内而处于淬灭状态。当小泡与质膜融合时，其腔面暴露于pH约为7.3的细胞外液中，导致pHluorin荧光增强。胞吐发生后，随着突触小泡蛋白的内吞以及回收小泡内部的再酸化，荧光强度逐渐下降。尽管荧光衰减同时反映了内吞和小泡再酸化两个过程，但在大多数情况下主要反映的是内吞过程，因为再酸化的速度通常快于内吞^1,4。再酸化的时间常数为3–4秒或更短^5,6，通常快于突触小泡内吞所需的10秒或更长时间⁴....

方案

注意：以下方案描述了在培养的海马神经元中使用的pHluorin成像方法和电镜（EM）方法。pHluorin用于监测活细胞中突触囊泡蛋白的摄取，而电镜可检测突触囊泡的摄取及超微结构的变化。

动物护理和操作遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南，并经NIH动物护理和使用委员会批准。

1. pHluorin 成像

1. 海马神经元培养
   1. 通过混合 4 mM NaHCO₃ 和 5 mM HEPES，并用 5 M NaOH 调节至 pH 7.3，制备海马缓冲液（HB）。通过混合神经基础培养基、2% B27、0.5 mM L-谷氨酰胺和 1% 青霉素-链霉素，制备培养基。另外，制备 HB 缓冲液与 20% 胎牛血清的混合液（HB/20% FBS）。
      注意：本培养方案基于 Sankaranarayanan, et al.²⁹ 和 Wu, et al.²⁴
   2. 将出生后第 0 至第 2 天的小鼠幼崽断头后放入培养基中，并将脑组织转移至 4 °C 的 HB/20% FBS 中。去除脑干和丘脑以暴露海马体。在去除脑干和丘脑暴露海马体后，解剖取出海马体，并转移至新鲜的 4 °C HB/20%....

结果

采用脂质载体法，在海马神经元中表达SpH，从而能够识别出突触小体（图1a）。对细胞进行电刺激可诱导胞吐作用，并伴随荧光强度的相应增加。当停止刺激时，荧光增强（ΔF）也随之终止（图1b）。随后荧光信号缓慢下降，这是由于内吞作用所致。对于VAMP2-pHluorin而言，刺激后VAMP2会沿着轴突从小体部位扩散⁴。原始数据使用任意单位，并通过归一化至基线水平来计算衰减速率和τ值（图2a-c）。由于测量数据来自归一化后的轨迹曲线，因此衰减速率反映的是每秒峰值ΔF的百分比下降速率（ΔF/s）。在本实验条件下，内吞作用（通常持续时间超过10 s）远慢于再酸化过程（约3–4 s）^4,5

讨论

本文展示了两种监测突触小泡内吞作用的方法。第一种方法中，我们监测了转染神经元中与突触小泡蛋白融合的pHluorin，并随后施加电刺激。第二种方法中，我们采用透射电镜成像技术观察由KCl诱导的辣根过氧化物酶（HRP）摄取情况。我们采用不同刺激方式基于两个原因：首先，高钾溶液处理可引起培养物中所有神经元的去极化，这有利于电镜检查，因为我们的电镜方法无法区分未受刺激与已受刺激的神经元；其次，相较于短暂的动作电位串甚至单个动作电位即可引发的pHluorin荧光变化，超微结构形态学的改变在高强度刺激（如高钾刺激）后更易于可靠地观察到。

利用pHluorin进行光学显微成像可在活细胞中以高时间分辨率观察突触小泡蛋白的融合与摄取过程。该技术可用于研究调控内吞过程时间动态以及突触小泡池大小的分子机制。pHluorin成像不仅被用于监测突触蛋白的内吞作用，还被用于检测诱发性或自发性单个小泡释放、短期突触可塑性，以及释放概率的测量³⁵。研究表明，发生释放的突触小泡蛋白池与被回收的蛋白池并不相同^36.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Lipofectamine LTX with Plus	Thermo Fisher	15338-100	质粒DNA转染，包括突触素或VAMP2-pHluorin
neurobasal培养基	Thermo Fisher	21103-049	神经元生长培养基，使用前预热至37°C
B27	Thermo Fisher	17504-044	神经元分化的添加剂
Glutamax	Thermo Fisher	35050-061	神经元培养的添加剂
多聚-D-赖氨酸包被的盖玻片	Neuvitro	GG-25-pdl	用于神经元生长及pHluorin成像的基质
牛胰蛋白酶XI	Sigma	T1005	神经元培养——消化海马组织
牛胰脱氧核糖核酸酶I	Sigma	D5025	神经元培养——抑制细胞悬液黏稠
脉冲刺激器	A-M systems	model 2100	施加电刺激
带电场刺激的槽式浴槽	Warner Instruments	RC-21BRFS	施加电刺激
刺激隔离单元	Warner Instruments	SIU102	施加电刺激
润滑剂	Dow corning	111	pHluorin成像——用于盖玻片与成像室之间的密封，防止液体泄漏
AP5	Tocris	3693	正常生理盐水添加剂，选择性NMDA受体拮抗剂，抑制具有潜在重复活动能力的突触后活性
CNQX	Tocris	190	正常生理盐水添加剂，竞争性AMPA/红藻氨酸受体拮抗剂，抑制具有潜在重复活动能力的突触后活性
照明器	Nikon	C-HGFI	pHluorin成像用金属卤化物光源
EMCCD相机	Andor	iXon3	pHluorin成像，检测pHluorin荧光强度
倒置显微镜	Nikon	Ti-E	用于成像转染了突触素或VAMP2-pHluorin的细胞
NIS-Elements AR	Nikon	NIS-Elements Advanced Research	成像采集与分析软件
Igor Pro	WaveMetrics	Igor pro	成像分析与数据展示软件
成像室	Warner Instruments	RC21B	pHluorin成像，对活细胞施加电场刺激
多聚-L-赖氨酸	Sigma	P4832	电子显微镜，神经元生长基质，室温下在多孔板中孵育1小时，然后用无菌水洗涤3次
辣根过氧化物酶（HRP）	Sigma	P6782	电子显微镜，通过在过氧化氢存在下催化DAB反应标记内吞的突触小泡，终浓度为5 mg/mL生理盐水中，使用前新鲜配制
二甲胂酸钠（Na cacodylate）	Electron Microscopy Sciences	12300	电子显微镜，固定剂和洗涤缓冲液，终浓度为0.1 N
3,3′-二氨基联苯胺（DAB）	Sigma	D8001	电子显微镜，用于标记内吞的突触小泡，HRP的底物，终浓度为0.5 mg/mL双蒸水中，过滤后使用，使用前新鲜配制
过氧化氢溶液	Sigma	H1009	电子显微镜，通过诱导HRP-DAB反应标记内吞的突触小泡，终浓度为0.3%双蒸水中，使用前新鲜配制
戊二醛	Electron Microscopy Sciences	16365	电子显微镜，固定剂，终浓度为4% Na-二甲胂酸盐缓冲液中，使用前新鲜配制，使用前充分震荡混匀
透射电子显微镜（TEM）	JEOL	200CX	电子显微镜，用于内吞小泡及超微结构变化的成像
CCD数码相机	AMT	XR-100	电子显微镜，用于图像采集
柠檬酸铅	Leica microsystems	16707235	电子显微镜，载网染色