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方法文章

基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法 关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

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DOI：

10.3791/55903

⸱

2017年6月16日

 ,  , 
1Cell Biology and Neuroscience, University of California, Riverside

本文内容

摘要

近年来，在体细胞系中进行基因操作的能力取得了显著进展，为基础研究和应用研究带来了巨大潜力。本文介绍了两种在哺乳动物细胞系中利用CRISPR/Cas9技术生成基因敲除并进行筛选的方法，一种使用可选择标记，另一种则不使用可选择标记。

摘要

CRISPR/Cas9 基因组编辑技术通过实现简便而精确的基因组修饰，彻底改变了生物学研究。Cas9 蛋白在单链向导 RNA（sgRNA）的引导下，可特异性地在目标基因位点切割双链 DNA。DNA 断裂可触发非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）两种修复机制。NHEJ 通常引入小片段的插入或缺失，导致移码突变；而 HDR 则可实现更大片段且更精确的基因修饰。本文介绍了两种结合经典 CRISPR/Cas9 方法并辅以下游筛选/选择策略的基因敲除细胞系构建方案。NHEJ 方法采用单个 sgRNA 切割位点，结合无需筛选标记的高通量点印迹免疫杂交法检测蛋白表达水平进行筛选。HDR 方法则利用两个 sgRNA 切割位点，覆盖目标基因区域，并结合提供的 HDR 修复模板，可实现长达数十 kb 的基因片段删除，同时插入可筛选的抗性标记以提高效率。文中还讨论了两种方法各自的适用场景与优势。

引言

稳定的遗传修饰相较于瞬时细胞扰动方法具有优势，因为后者在效率和持续时间上可能存在较大变异性。近年来，由于序列特异性核酸酶的开发，基因组编辑技术日益普及，例如锌指核酸酶1,2,3,4,5、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）6,7,8,9，以及源自成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统的RNA引导核酸酶10。

CRISPR/Cas9 基因编辑系统源自细菌和古菌用于抵御病毒感染的免疫系统11,12,13。在此过程中，入侵病毒序列的短片段（20–30 nt）被整合到基因组位点中，作为被重复单元侧翼包围的"间隔序列"14,15。随后的转录和RNA加工产生小的CRISPR相关RNA16（crRNA），其与反式激活crRNA17（tracrRNA）共同与效应蛋白Cas9内切酶结合形成复合物。crRNA由此赋予Cas9靶向特异性，引导该复合物切割互补的病毒DNA序列，从而防止进一步感染18,19。只要目标DNA中的任意"前间隔序列"直接位于短的前间隔序列邻近基序（PAM）的5'端，即可作为crRNA的来源；对于S. pyogenes Cas9而言，该PAM序列为NGG20。宿主CRISPR位点中间隔序列附近缺乏PAM序列，可区分自身与非自身DNA，从而避免对宿主基因组的错误靶向。由于其普适性和灵活性，该生物系统已被成功改造用于基因组编辑，几乎可以靶向任何邻近PAM的DNA位点。在此改造版本中，crRNA与tracrRNA进一步被融合为单个引导RNA（sgRNA）组分，并装载至Cas9蛋白中21。

在真核细胞中表达Cas9和一条sgRNA后，Cas9蛋白会在靶向位点切割DNA双链。在缺乏合适同源序列区域的情况下，细胞会通过非同源末端连接（NHEJ）22,23,24修复这一断裂，该过程通常引入小片段缺失，偶尔也会发生插入。当靶向开放阅读框时，这种修复很可能导致翻译移码，从而产生无功能的蛋白质产物。相反，若提供具有大片段同源区域的外源模板，细胞可能通过同源定向修复机制25,26来修复双链断裂。该途径可实现基因组中较大片段的精确删除、替换或插入，同时可引入可切除的选择标记27。

本文介绍了通过上述两种CRISPR/Cas9方法之一生成基因敲除细胞系的实验方案（图1A）。非同源末端连接（NHEJ）方法采用单个sgRNA切割位点，并进行无需筛选标记的独立筛选，因此前期准备工作较少。使用该方法时，需设计针对转录本5'端附近外显子区域的向导RNA，因为这些区域最有可能产生基因敲除效果。由于该方法对基因组的修饰较小，因此对敲除克隆的筛选依赖于点杂交（dot blot）方法，以高通量方式检测蛋白产物。本文以ELAV样1蛋白（ELAVL1）基因敲除细胞系的构建为例进行说明。第二种方法依赖同源定向修复（HDR），使用两个sgRNA切割位点，覆盖目标基因或区域，从而实现长达数十kb的片段删除。通过提供一个包含两个同源区域的质粒作为替换模板（图1B），这两个同源区位于切割位点两侧，可引入可筛选的抗性标记，从而提高基因敲除的效率。该方法也可通过合理设计同源臂，用于引入特定的基因修饰。在这种情况下，新DNA片段的整合使得基于PCR的筛选成为可能（图1C）。本文以Pumilio RNA结合家族成员2（PUM2）基因敲除细胞系的构建为例进行说明。

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方案

1. 确定目标缺失区域周围的同源区段

注意：仅在使用基于选择的编辑时需要。

  1. 选择目标缺失位点两侧的两个区域，初始长度为1.5–2 kb，作为HDR模板中的同源臂（图1A）。应选择在任一链上均不含BsaI识别位点（GGTCTC）的区域，以方便克隆。若无法避免BsaI位点，可使用其他IIs型限制性内切酶（如BsmBI、SapI、BbsI），并相应修改受体质粒（pUC19-BsaI）、抗性标记供体质粒（pGolden-Neo或pGolden-Hygro）以及同源臂PCR产物突出端中的对应位点。

2. Cas9-sgRNA 表达质粒的构建

  1. 确定用于诱变的靶向位点。对于单切口、无筛选标记的方法，应靶向靠近5'端的编码外显子，以提高产生非功能性突变的概率。对于双切口方法，应选择两个位点，使其跨越尽可能多的基因区域。
    注意：根据我们的经验，可高效构建长达53 kb的缺失。
  2. 将靶向区域约200至300 bp的序列输入crispr.mit.edu设计工具。对于基于筛选的克隆，使用位于缺失位点附近、已鉴定出的同源区域的200–300 bp序列（图1A）。针对每个靶向区域，选择2–3个评分最高的sgRNA，以兼顾不同sgRNA活性的差异，并获得不具有相同潜在脱靶效应的独立克隆。
  3. 为设计适用于插入表达质粒且具有适当突出端的双链寡核苷酸，需从sgRNA序列中去除PAM序列（NGG），并在正义链寡核苷酸的5'端添加CACC突出端，并在其后加上一个G。对于反义链寡核苷酸，则将5'-AAAC突出端添加至靶序列的反向互补序列的5'端，随后在3'端加上一个C，如下图所示：
    基因编辑序列比对；sgRNA、TS、BS链；CRISPR过程示意图
  4. 按照Zhang实验室方案29所述，通过Golden Gate克隆方法28将对应sgRNA的合成寡核苷酸插入pSpCas9(BB)质粒中。

3. 同源定向修复模板质粒的构建

注意：仅在使用基于筛选的编辑时需要。同源定向修复模板质粒包含一个药物抗性表达盒，其两侧为两个与基因组上sgRNA靶位点外侧区域互补的序列（图1B）。

  1. 从步骤1.1中确定的更广泛的同源区域中，选取800-1,000 bp26 距离设计的 Cas9 切割位点不超过 5-10 bp，用作同源臂（图1A）。务必确保同源臂中不包含sgRNA靶位点及其PAM序列，否则将导致CRISPR/Cas9对模板质粒自身的切割。如果同源臂内含有内源性BsaI位点，请选用其他sgRNA靶位点。
  2. 使用高保真DNA聚合酶，按照制造商说明书，从基因组DNA中PCR扩增同源臂。上下游引物需在5'端额外添加序列，以引入BsaI酶切位点（GGTCTC）及位于同源区域两端的特异性突出末端。这些突出末端必须包含适当的序列，以确保后续正确组装顺序和方向，如下所述（图1B):
    左侧同源臂FP突出端：5' GGGTCTCAGGCC
    左侧同源臂RP突出端：5' GGGTCTCTCACG
    右侧同源臂FP突出端：5' GGGTCTCAGTCC
    右侧同源臂RP突出端：5' GGGTCTCT加拿大实验动物管理委员会
  3. 通过凝胶电泳检测同源臂是否扩增正确，然后再继续后续操作。
  4. 通过Golden Gate克隆将左右同源臂区域与抗性表达盒组装到HDR模板质粒中28使用 pGolden-Neo 或 pGolden-Hygro 质粒30 作为带有loxP位点侧翼的抗性盒（loxP-PGK-Neo-pA-loxP 或 loxP-PGK-Hyg-pA-loxP）的来源。使用pUC19-BsaI作为受体载体，该载体为经修饰的pUC19，其多克隆区域含有BsaI位点，其他位置的BsaI位点已被消除（可应要求提供）。三种插入片段与载体的使用比例为1:1:1:1。
    1. 配制以下反应混合物30:
      右侧同源臂PCR产物0.06 pmol（30-40 ng）
      左同源臂PCR产物0.06 pmol（30-40 ng）
      pGolden-Neo 质粒（100 ng/µL)1 µL
      pUC19-BsaI 质粒（100 ng/μL）µL)1 µL
      2x T7 DNA连接酶缓冲液5 µL
      BsaI（10 U/μL）µL)0.75 µL
      T7 DNA连接酶（3000 U/μL）µL)0.25 µL
      水高达 10 µL
    2. 使用以下热循环仪参数： 37 °C 5 分钟， 20 °C 5分钟。重复30个循环。
    3. 按照制造商说明书，用外切核酸酶处理克隆产物，以降解任何残留的线性化DNA。
    4. 将反应混合物转化至感受态细胞中 E. coli 按照细胞附带的说明书进行菌株培养，并接种于含氨苄青霉素的培养皿中。
  5. 为鉴定含有正确模板组装的克隆，进行细菌菌落PCR以扩增组装插入片段的同源臂亚区（因为整个插入片段可能过大而难以可靠扩增）。使用一条与质粒侧翼序列退火的引物和另一条与抗性盒边缘互补的引物图1B，该序列在Neo和Hygro插入片段中均存在），产生一个依赖于组装的产物，其长度比包含的同源臂长约200 bp：
    pUC19-Bsal-Left：5' GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG
    抗性-左侧：5' AAAAGCGCCTCCCCTACCC
    pUC19-BsaI-Right：5' GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA
    抗性-右：5' AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG
    1. 用无菌牙签挑取细菌菌落，并将细菌悬浮于 20 µL 水。加热至 95 °C 15分钟，然后在台式离心机中以最大速度离心5分钟。立即置于冰上。
    2. 配制以下 PCR 混合液31:
      稀释菌落模板1.25 µL
      10x Taq反应缓冲液1.25 µL
      20 mM dNTPs0.25 µL
      10 µM 上游引物 0.25 µL
      10 µM 反向引物 0.25 µL
      Taq 聚合酶0.25 µL
      水 9 µL
    3. 使用以下热循环仪参数： 95 °C 30 秒，（95 °C 30 s 61 °C 30 秒 72 °C 1 分钟/千碱基），重复 25 个循环， 72 °C 2 分钟。
    4. 通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的扩增片段大小是否正确。
    5. 可选地，从具有正确插入片段大小的单个菌落中提取质粒DNA小量制备物，并使用上述提及的扩增引物通过Sanger测序对同源臂区域进行测序。

4. 将CRISPR组分转染至培养细胞

  1. 转染前：将 T-REx293 细胞培养于添加了 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基中，置于 37 °C、5% CO2 条件下。
  2. 将细胞接种至 6 孔板中，培养至约 70% 汇合度。设置一个未转染对照孔。
  3. 使用商业转染试剂盒，按照其操作流程，用总共 2.5 µg 质粒转染细胞。同时平行培养未转染对照组。
    注意：转染方法和效率因细胞类型而异。实验前应确定适用于该系统的最佳转染方法。
    1. 对于需要筛选的细胞转染，使用 0.75 µg Cas9-sgRNA 1（左侧切割）、0.75 µg Cas9-sgRNA 2（右侧切割）和 1.0 µg 同源重组模板。
    2. 对于无需筛选的细胞转染，使用 2.5 µg Cas9-sgRNA 质粒。

5. 药物筛选

  1. 转染后48小时，用适当的药物（新霉素/潮霉素）处理细胞。持续筛选，直至未转染的对照组细胞全部死亡（新霉素通常为3-5天，潮霉素为7-14天）。
    注意：对于T-REx293细胞，建议新霉素和潮霉素的使用浓度分别为500 µg/mL和10 µg/mL。对于其他类型的细胞，建议先在未转染细胞上进行药物浓度梯度实验，以确定有效浓度。

6. 克隆群体的分离

  1. 筛选后，在原始孔中将细胞培养至100%汇合度。以每孔0.33个细胞的密度将细胞接种至96孔板中。
    注意：接种三块96孔板是确保获得多个正确克隆的良好起始点，但具体所需板数可能因sgRNA和HDR效率的不同而有所增减。
  2. 在2至4周内观察细胞集落，直至肉眼可见集落形成。使用无菌移液器吸头挑取可见集落，并重新接种至新孔中以促进单层生长。当使用悬浮细胞时，可采用更低的接种密度，以确保更高比例的单克隆孔。

7. 候选样本筛选

  1. 不使用筛选的压力筛选候选克隆：点印迹
    1. 将单个克隆培养至50-100%汇合度。通过在孔内吹打使细胞单层脱落。
    2. 等分试样 90 µL 的 100 µL 总体积转移至洁净的微量离心管中。以6000 rpm离心5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀在 10 µL 1×裂解缓冲液或1×SDS上样缓冲液（5×：250 mM Tris-Cl pH 6.8，8% SDS，0.1%溴酚蓝，40%甘油，100 mM DTT）。加入 90 µL 向孔中剩余细胞添加新鲜培养基以继续培养。
    3. 移液器 1 µL 将细胞裂解液点样至干燥的硝酸纤维素膜上，形成斑点。每个样本在两张不同的膜上各点样两次，形成两组相同的样本排列。
    4. 用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液（Tris缓冲盐水 + 0.01% Tween 20：8 g NaCl，0.2 g KCl，3 g Tris碱，加蒸馏水至1 L，pH 7.4）封闭膜31 室温下孵育1小时（此处及后续步骤均需摇动）。
    5. 使用针对目标蛋白的一抗对一张膜进行印迹，同时使用对照蛋白（如微管蛋白、GAPDH 或其他表达量预期不变的蛋白）的一抗对另一张膜进行印迹。采用推荐的一抗稀释比例（0.2 µg/mL ELAVL1 和 0.1 µg/mL 在含5%脱脂奶粉的TBST中封闭Pum2（以Pum2为例），室温孵育1小时。
    6. 用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
    7. 在室温下，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液稀释的相应HRP标记二抗孵育每张膜1小时。
    8. 用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
    9. 按照制造商说明加入化学发光底物溶液（见材料表），并在数字化学发光成像仪上对印迹膜进行成像。
    10. 使用适当的软件对目标蛋白和对照蛋白的点状信号强度进行定量分析。
    11. 剔除对照蛋白信号较低的候选样本，对剩余候选样本计算目标蛋白与对照蛋白信号强度的背景校正后比值。选择比值最低的候选样本进行传代，并通过蛋白质印迹进一步验证。
  2. 利用筛选：菌落PCR筛选候选克隆
    1. 使用DNA提取试剂盒收集细胞裂解液（参见 材料表).
      1. 在新的96孔板中重复接种单个菌落，并培养至100%汇合。
      2. 从一组克隆中移除培养基，并将细胞重悬于 30 µL 从试剂盒中提取缓冲液，转移至洁净的1.5 mL微量离心管中。
      3. 将溶液加热至 96 °C 15 分钟，然后冷却至室温。
      4. 添加 30 µL 来自试剂盒的稳定缓冲液。充分混匀。
    2. 通过菌落PCR鉴定野生型及单等位/双等位突变株系。
      1. 设计两套独立的PCR引物（分别对应目标位点的左侧和右侧），用于扩增抗性盒成功或未成功整合情况下同源臂周围的区域图2C）。在两侧使用一种通用引物（红色），该引物与同源臂外侧区域退火。将此通用引物与一对相应的特异性引物之一联合使用，其中该特异性引物互补于内源序列并跨越同源区域（蓝色），用于检测野生型等位基因。使用另一对互补于插入的抗性盒（见第2.3节中的引物）的配对引物，用于检测目标突变。
      2. （推荐）使用最初选定的bulk细胞群体的细胞裂解液来验证引物组，因为该裂解液将包含野生型和突变等位基因的混合物图2D).
      3. 配制以下反应混合液：
        细胞裂解液0.5 µL
        10x KOD缓冲液1.25 µL
        25 mM MgSO₄0.75 µL
        2 mM dNTPs 1.25 µL
        10 µM 上游引物 0.375 µL
        10 µM 反向引物0.375 µL
        KOD 聚合酶0.25 µL
        水7.75 µL
      4. 使用以下热循环仪程序条件： 95 °C 2 分钟，（95 °C 20 秒，引物 Tm 值 10 秒 70 °C 20 秒/千碱基）重复 25 个循环。
      5. 通过琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物。
    3. 对预测整合位点的两侧分别重复进行菌落PCR检测。筛选并扩增显示存在整合且在缺失区域无内源序列扩增产物的候选克隆。
    4. 通过蛋白质印迹和/或逆转录定量聚合酶链式反应验证阳性候选样本。

8. 通过测序验证基因组突变

  1. 通过苯酚-氯仿抽提法从突变细胞系中分离基因组DNA31。
  2. 使用带有5'突出端的引物扩增sgRNA靶向区域，这些引物可在两端添加BsaI限制性酶切位点。
    注意：对于通过HDR编辑的克隆，若两个等位基因可能相同，则可直接对PCR产物进行测序。
  3. 通过Golden Gate克隆技术将扩增的片段插入pUC19-BsaI载体中。
  4. 将反应混合物转化至感受态的E. coli菌株中。
  5. 从6-10个单菌落中提取质粒DNA，并通过Sanger测序对克隆区域进行测序。

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结果

为建立ELAVL1基因敲除细胞系，由于存在可靠的抗体，因此采用单个sgRNA进行编辑（图1A，左侧）完成后，进行点印迹免疫检测。三个sgRNA分别独立转染，以比较其编辑效率并排除所获克隆中的脱靶效应。收集单克隆细胞群体的裂解液，并将其点样至两张硝酸纤维素膜上，随后分别用ELAVL1和PUM2（作为归一化对照）抗体进行杂交检测图2A). ELAVL1与PUM2信号的定量比值显示出非常宽泛的 >104-倍范围，存在于分离的品系中（图2B）。以该比值作为筛选标准，我们使用ELAVL1的Western印迹法验证了多条细胞系图3A）。在大多数情况下，ELAVL1 相对信号最低的克隆群体被正确鉴定为敲除株（图2B），证实了该定量方法的预测能力（尽管对照信号存在较...

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讨论

CRISPR/Cas9 系统能够高效地实现稳定的基因组修饰，相较于其他瞬时操作方法，提供了更为一致的结果。本文介绍了两种在哺乳动物细胞系中快速鉴定 CRISPR/Cas9 基因敲除的方法。这两种方法所需细胞材料极少，因此可在克隆培养的早期阶段进行检测，节省时间和试剂。为提高两种方法的效率，我们建议同时测试多个 sgRNA，因为不同序列和基因组位置的编辑效率存在差异。此外，使用多个 sgRNA 有助于通过检测非靶向基因突变导致的异常表型，识别脱靶效应。高效的转染和 Cas9 切割将显著提高获得基因敲除的成功率。 alternatively，可直接将 commercially sourced sgRNA/Cas9 核糖核蛋白复合物转染入细胞32,33，该方法可能加快实验流程并降低脱靶效应。

点印迹法非常适合用于评估由NHEJ导致的小规模基因组改变所引起的蛋白敲除。由于仅需使用单一的sgRNA/Cas9构建体，该方法可能是获得无效细胞系的最快途径，且印迹步骤避免了额外操作...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者谨此感谢 Gissell Sanchez、Megan Lee 和 Jason Estep 提供实验协助，并感谢 Weifeng Gu 和 Xuemei Chen 分享试剂。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
感受态 E. coli 细胞
质粒提取试剂盒
pSpCas9(BB) 质粒Addgene42230Ran et al. 2013，sgRNA 克隆
BbsI 酶ThermoFisherFD1014Ran et al. 2013，sgRNA 克隆
T7 DNA 连接酶NEBM0318LRan et al. 2013，sgRNA 克隆
Tango 缓冲液ThermoFisherBY5Ran et al. 2013，sgRNA 克隆
PlasmidSafe 外切酶EpicentreE3105KRan et al. 2013，sgRNA 克隆
Q5 热启动高保真聚合酶NEBM0494AHA 扩增
pUC19-BsaI经修饰的 pUC19 质粒，突变原有的 BsaI 位点，并在 BamHI/EcoRI 消化后插入两个方向相反的 BsaI 位点
pGolden-NeoAddgene51422抗性筛选盒
pGolden-HygroAddgene51423抗性筛选盒
BsaI 酶NEBR3535S同源臂构建
T7 DNA 连接酶NEBM0318L
PlasmidSafe 外切酶EpicentreE3105K
牙签细菌 PCR
Taq 聚合酶细菌菌落 PCR
HEK293 人源细胞
DMEMCorning10-013-CV
FBSCorningMT35010CV
青霉素-链霉素（可选）Gibco15140-122
6 孔板BioLite12556004
TransIT-LTI 转染试剂MirusMIR2300仅用于脂质体转染
Opti-MEMThermoFisher31985062仅用于脂质体转染
G418（新霉素）Sigma AldrichA1720-5G
潮霉素Sigma AldrichH3274-250MG
96 孔板ThermoFisher12556008
被动裂解缓冲液，5 倍浓度Promega
1× SDS 上样缓冲液实验方案中描述的配方
硝酸纤维素膜Bio-Rad162-0115
TBST实验方案中描述的配方
脱脂奶粉
SuperSignal West Dura 延长显色底物ThermoFisher34075用于 HRP 标记的二抗
PCR 用 Extracta DNA 提取试剂Quantabio95091-025
KOD 聚合酶Novagen71316

参考文献

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基因敲除非同源末端连接同源定向修复点印迹免疫检测菌落PCR克隆分离连续稀释药物筛选蛋白质印迹
基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法 关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑
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