利用血管性血友病因子-血小板串形成流动腔模型研究血管性血友病因子病理生理学

摘要

本文介绍了一种用于评估内皮细胞在炎症刺激下响应流体剪切应力释放血管性血友病因子（von Willebrand factor）及其后续捕获血小板的方法，该方法基于一种 体外 流动腔系统

摘要

血管性血友病因子（VWF）是一种多聚体糖蛋白凝血因子，可在血管内皮损伤部位介导血小板的黏附与聚集，并在循环中携带凝血因子VIII。VWF由内皮细胞合成，可通过组成型分泌直接释放到血浆中，也可储存于一种称为魏贝尔-帕拉德小体（Weibel-Palade bodies, WPBs）的特异性细胞器中，以应对止血挑战而进行按需释放。促凝血和促炎性刺激可迅速诱导WPB的胞吐作用并释放VWF。内皮细胞释放的大部分VWF在血浆中循环，但也有一部分VWF锚定于内皮细胞表面。在生理剪切力条件下，锚定于内皮细胞表面的VWF可与血小板结合，形成VWF-血小板串状结构，这可能代表血栓形成的起始核心。利用流动腔系统可直观地观察内皮细胞释放VWF及随后捕获血小板的过程，该方法具有可重复性，并与VWF介导的血栓形成病理生理过程密切相关。采用该方法时，先在流动腔中培养内皮细胞，随后使用促分泌剂刺激以诱导WPB的胞吐。然后将洗涤后的血小板灌注于活化的内皮层表面。血小板被激活后，会顺着液体流动方向结合到伸展的VWF串状结构上。当使用细胞外组蛋白作为促凝血和促炎性刺激时，我们观察到经组蛋白处理的内皮细胞表面形成的VWF-血小板串状结构较未经处理的内皮细胞显著增加。本方案描述了一种在血栓形成和止血模型中对VWF-血小板相互作用的活化进行定量、可视化和实时评估的方法。

引言

血栓形成是全球主要的死亡原因之一¹，可由静脉和动脉中血小板活化及凝血酶生成的失调所引发。血管性血友病因子（VWF）的血浆水平是血液凝固的关键调节因子，其水平降低（<50%）会导致一种出血性疾病，称为血管性血友病（von Willebrand disease, VWD）²，而水平升高（>150%）则与静脉³和动脉⁴血栓形成风险增加相关。

VWF 是一种由巨核细胞和内皮细胞合成的多聚糖蛋白，分别储存于血小板的α颗粒和内皮细胞的魏贝尔-帕拉德小体（WPBs）中。在止血挑战发生时，VWF 可从内皮细胞的 WPBs 中释放出来，将循环中的血小板锚定至活化的内皮细胞⁵，或血管壁上暴露的胶原蛋白⁶。VWF 与内皮细胞的锚定作用已被证实由 P-选择素⁷ 和整合素 α_vβ₃⁸ 介导。随后血小板α颗粒内容物的释放可进一步提高局部 VWF 浓度，以稳定血小板之间的相互作用，形成血小板栓子，为凝血级联反应的扩增和纤维蛋白沉积提供必要的支架结构。VWF 的血小板结合....

方案

这些研究已获得加拿大女王大学研究伦理委员会的批准。

1. 内皮细胞刺激

1. 用胶原蛋白包被6孔组织培养板。
   1. 提前24 h，将1 mL胶原缓冲液（50 µg/mL大鼠尾胶原I型溶于0.02 M冰醋酸）加入6孔组织培养板中，于37 °C孵育包被。
   2. 用 2 mL 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）洗涤各孔两次。
      注意：平板可用锡箔纸包裹，并置于密闭塑料袋中，在 4 °C 下保存。
2. 以 1 x 10 的密度接种内皮细胞⁶ 每孔加入含10%胎牛血清（FBS）的2 mL生长培养基，接种细胞。于37 °C（5% CO₂）培养24小时。₂).
   注意：此处使用传代5至15代之间的血液来源内皮祖细胞（BOECs）。BOECs来自VWF序列为野生型的健康志愿者，分离方法参见Starke文献。 等²² 以一种与 JoVE 之前描述的方法类似的方式²³.
3. 24小时后移除培养基，并用HBSS洗涤细胞。
4. 加入含有佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA；100 nM）、非分级组蛋白（UH）以及HK或HR（均为25 µg/mL）....

结果

为了直接评估组蛋白对内皮细胞释放血管性血友病因子（VWF）的影响，我们将融合生长的BOECs暴露于含有PMA（阳性对照）、UH、HR和HK的无血清培养基中，持续2小时。结果显示，HK处理使培养基中内皮细胞释放的VWF蛋白（VWF:Ag）增加了2倍（图1）。有趣的是，当BOECs经UH和HR刺激后，培养基中检测到的VWF:Ag水平低于未处理组。我们推测，由于组蛋白可直接与VWF结合³⁰，它们可能不同程度地干扰了培养基中VWF:Ag的检测。为了评估组蛋白与VWF的结合能力，我们采用固相结合实验。结果显示，UH和HR与VWF的结合能力强于HK（图2），该结果支持了图1中所示的检测干扰现象。

已有研究表明，细胞外组蛋白可在体外激活血小板.......

讨论

尽管VWF-血小板串状结构的生理相关性仍存在争议，因其在VWF裂解蛋白酶ADAMTS13存在下会迅速解体，但它们可作为可量化的指标 体外 血管性血友病因子介导血小板募集至血栓形成部位的模型，该部位组蛋白水平局部升高⁵此外，在缺乏 ADAMTS13 活性的病理状态下（如血栓性血小板减少性紫癜，TTP），或在 ADAMTS13 活性受到抑制的炎症微环境中，均可观察到 VWF-血小板串状结构 体内³² 并可能促进血小板微聚集和白细胞外渗，从而将血管性血友病因子（VWF）的止血功能与促炎功能联系起来³³最后，有研究假设VWF-血小板串的形成可能是静脉和/或动脉血栓形成的起始事件，作为病理性血栓形成的起始核心。

在流动腔系统中，VWF-血小板串的形成可用于研究WPB的胞吐作用、ADAMTS13对VWF的裂解以及VWF与血小板的结合能力。成功实施这些实验包含多个关键步骤。然而，根据该模型的具体应用，可对实验方案进行相.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小牛胸腺未分级组蛋白（UH）	Worthington Biochemical	HLY	用低血清培养基重悬（5 mg/mL）
小牛胸腺赖氨酸富集组蛋白（HK）	Sigma-Aldrich	H5505	用低血清培养基重悬（5 mg/mL）
小牛胸腺精氨酸富集组蛋白（HR）	Sigma-Aldrich	H4830	用低血清培养基重悬（5 mg/mL）
佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA）	Sigma-Aldrich	P8139	用DMSO重悬（20 mM）
组胺	Sigma-Aldrich	H7125-1G	用水重悬（50 mg/mL）
3,3' 二己氧基羰花青碘化物（DiOC6）	Invitrogen	D273	用甲醇重悬（20 mM）
兔抗血管性血友病因子包被抗体	DAKO	A0082	用于血管性血友病因子ELISA
兔抗血管性血友病因子检测抗体，HRP标记	DAKO	P0026	用于血管性血友病因子ELISA和组蛋白-血管性血友病因子结合实验
Nunc MaxiSorp 平底96孔微孔板	eBioscience	44-2404-21	用于组蛋白-血管性血友病因子结合实验
Immulon 4 HBX 平底96孔酶标板	Thermo Scientific	3855	用于血管性血友病因子ELISA
Humate-P	CSL Behring	N/A	血浆来源的人血管性血友病因子/第八因子复合物
正常参考血浆	Precision BioLogic	CCNRP-05	用于血管性血友病因子ELISA标准曲线
邻苯二胺二盐酸盐（OPD）试剂	Sigma-Aldrich	P8287	ThermoFisher Scientific提供等效产品（目录号：34006）
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	用于BOEC细胞的培养和初始接种
Hank's平衡盐溶液（HBSS）	ThermoFisher Scientific	14025092
大鼠尾胶原蛋白I型	Corning	354236
Gibco Opti-MEM I 低血清培养基	ThermoFisher Scientific	31985070	用于内皮细胞刺激
METAMORPH 显微镜自动化与图像分析软件	Molecular Devices	N/A
BD Vacutainer 无添加剂采血管	BD Biosciences	366703
µ-Slide III 0.1（流动腔室）	Ibidi		该产品已停产。建议使用 µ-Slide VI 0.1（#80661）或 0.4（#80601），并重新计算所需流速和血小板体积，以维持4.45 dyn/cm²的剪切应力
硅胶管，内径1.6 mm，5 m，已灭菌	Ibidi	10842
鲁尔锁母接头：天然聚丙烯，已灭菌	Ibidi	10825
鲁尔弯头公接头：白色聚丙烯，已灭菌	Ibidi	10802
钝化18G针头	BD Biosciences	305180
20 mL注射器	BD Biosciences	302830
注射泵	New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM	N/A
Quorum WaveFX-4X1转盘共聚焦显微镜	Quorum Technologies	N/A
图像处理软件	ImageJ	N/A