利用血管性血友病因子-血小板串形成流动腔模型研究血管性血友病因子病理生理学

摘要

本文介绍了一种用于评估内皮细胞在炎症刺激下响应流体剪切应力释放血管性血友病因子（von Willebrand factor）及其后续捕获血小板的方法，该方法基于一种 体外 流动腔系统

摘要

血管性血友病因子（VWF）是一种多聚体糖蛋白凝血因子，可在血管内皮损伤部位介导血小板的黏附与聚集，并在循环中携带凝血因子VIII。VWF由内皮细胞合成，可通过组成型分泌直接释放到血浆中，也可储存于一种称为魏贝尔-帕拉德小体（Weibel-Palade bodies, WPBs）的特异性细胞器中，以应对止血挑战而进行按需释放。促凝血和促炎性刺激可迅速诱导WPB的胞吐作用并释放VWF。内皮细胞释放的大部分VWF在血浆中循环，但也有一部分VWF锚定于内皮细胞表面。在生理剪切力条件下，锚定于内皮细胞表面的VWF可与血小板结合，形成VWF-血小板串状结构，这可能代表血栓形成的起始核心。利用流动腔系统可直观地观察内皮细胞释放VWF及随后捕获血小板的过程，该方法具有可重复性，并与VWF介导的血栓形成病理生理过程密切相关。采用该方法时，先在流动腔中培养内皮细胞，随后使用促分泌剂刺激以诱导WPB的胞吐。然后将洗涤后的血小板灌注于活化的内皮层表面。血小板被激活后，会顺着液体流动方向结合到伸展的VWF串状结构上。当使用细胞外组蛋白作为促凝血和促炎性刺激时，我们观察到经组蛋白处理的内皮细胞表面形成的VWF-血小板串状结构较未经处理的内皮细胞显著增加。本方案描述了一种在血栓形成和止血模型中对VWF-血小板相互作用的活化进行定量、可视化和实时评估的方法。

引言

血栓形成是全球主要的死亡原因之一¹，可由静脉和动脉中血小板活化及凝血酶生成的失调所引发。血管性血友病因子（VWF）的血浆水平是血液凝固的关键调节因子，其水平降低（<50%）会导致一种出血性疾病，称为血管性血友病（von Willebrand disease, VWD）²，而水平升高（>150%）则与静脉³和动脉⁴血栓形成风险增加相关。

VWF 是一种由巨核细胞和内皮细胞合成的多聚糖蛋白，分别储存于血小板的α颗粒和内皮细胞的魏贝尔-帕拉德小体（WPBs）中。在止血挑战发生时，VWF 可从内皮细胞的 WPBs 中释放出来，将循环中的血小板锚定至活化的内皮细胞⁵，或血管壁上暴露的胶原蛋白⁶。VWF 与内皮细胞的锚定作用已被证实由 P-选择素⁷ 和整合素 α_vβ₃⁸ 介导。随后血小板α颗粒内容物的释放可进一步提高局部 VWF 浓度，以稳定血小板之间的相互作用，形成血小板栓子，为凝血级联反应的扩增和纤维蛋白沉积提供必要的支架结构。VWF 的血小板结合活性受其多聚体结构调控，其中高分子量多聚体具有更强的止血活性^9,10。在血液循环中，VWF 还可作为凝血因子 VIII 的载体。

流体剪切应力是血管性血友病因子（VWF）生理功能的关键调节因子。在无剪切应力的情况下，VWF 呈球状结构，其血小板糖蛋白 Ib 结合域被隐藏¹¹。当存在剪切应力时，金属蛋白酶——含血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶（ADAMTS13）的切割位点暴露。ADAMTS13 可切割裸露的以及结合有血小板的 VWF 串状结构，从而调控其多聚体大小，降低其止血活性¹²。

VWF 是一种急性期蛋白，许多刺激因素，包括缺氧¹³、感染¹⁴以及促炎性细胞因子，均已被证明可介导内皮细胞释放 VWF。与其他炎症因子类似，细胞外组蛋白也被证实可在小鼠体内诱导系统性 VWF 释放^15,16，并在体外（in vitro）激活血小板^17,18,19。这种作用依赖于组蛋白亚型，因为赖氨酸和精氨酸含量的差异可能影响其功能¹⁵。本研究旨在建立一种流动腔模型，用于研究富含赖氨酸（HK）和富含精氨酸（HR）的组蛋白亚型及分泌促进剂对内皮细胞 VWF 释放以及实时血小板捕获的影响，这些可能是炎症诱导血栓形成的早期事件。

该流动腔方法学可重现 体内 内皮下胶原、内皮细胞、血管性血友病因子（VWF）和血小板之间的相互作用 体外 一种可视化、可重复且可量化的系统，可用于实时评估调控 VWF-血小板相互作用通路的各个方面，包括 WPB 分泌、血小板活化以及 VWF 蛋白水解。在受控剪切应力条件下对 VWF 的研究已被用于评估影响 VWF 释放及血小板结合功能的血管性血友病（VWD）突变。²⁰，WPB 生理学²¹以及ADAMTS13对VWF的切割作用⁵我们采用该方法定量测定细胞外组蛋白这一炎性刺激物所导致的血管性血友病因子（VWF）-血小板串珠结构的形成。

方案

这些研究已获得加拿大女王大学研究伦理委员会的批准。

1. 内皮细胞刺激

1. 用胶原蛋白包被6孔组织培养板。
   1. 提前24 h，将1 mL胶原缓冲液（50 µg/mL大鼠尾胶原I型溶于0.02 M冰醋酸）加入6孔组织培养板中，于37 °C孵育包被。
   2. 用 2 mL 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）洗涤各孔两次。
      注意：平板可用锡箔纸包裹，并置于密闭塑料袋中，在 4 °C 下保存。
2. 以 1 x 10 的密度接种内皮细胞⁶ 每孔加入含10%胎牛血清（FBS）的2 mL生长培养基，接种细胞。于37 °C（5% CO₂）培养24小时。₂).
   注意：此处使用传代5至15代之间的血液来源内皮祖细胞（BOECs）。BOECs来自VWF序列为野生型的健康志愿者，分离方法参见Starke文献。 等²² 以一种与 JoVE 之前描述的方法类似的方式²³.
3. 24小时后移除培养基，并用HBSS洗涤细胞。
4. 加入含有佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA；100 nM）、非分级组蛋白（UH）以及HK或HR（均为25 µg/mL）的无血清培养基（不含FBS的最低必需培养基），每孔1 mL，37 °C孵育2小时（5% CO₂）₂).
   注意：该组蛋白浓度是基于先前的 体外 徐氏细胞毒性报告 等²⁴ 和 Abrams 等.²⁵ 使用了50 µg/mL。
5. 2小时后收集培养基，并于-20 °C保存至分析。

2. 通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）对血管性血友病因子（VWF）进行定量

1. 用包被缓冲液（10 mM 磷酸氢二钠和 145 mM 氯化钠，pH 7.2）稀释多克隆抗 VWF 抗体至 10 µg/mL，每孔加入 100 µL，4 °C 过夜包被微孔板。
2. 用洗涤缓冲液（10 mM 磷酸氢二钠、500 mM 氯化钠和 0.1% Tween 20，pH 7.2）每孔 250 µL 洗涤 3 次。
3. 用洗涤缓冲液将培养基样品按 1:2 和 1:4 稀释，并以正常参考血浆制备标准曲线，起始稀释度为 1:10。
4. 每孔加入 100 µL 稀释后的样品和标准品，4 °C 过夜孵育。
5. 用洗涤缓冲液每孔 250 µL 洗涤 3 次。
6. 每孔加入 100 µL 稀释后的抗 VWF-HRP 标记检测抗体（在洗涤缓冲液中为 1.1 µg/µL），室温孵育 1 小时。
7. 洗涤微孔板后，按照生产商说明书加入 O-苯二胺二盐酸盐（OPD）试剂，室温孵育 10 分钟。
8. 加入 100 µL 1 M H₂SO₄ 终止反应，在 492 nm 处读取吸光度。

3. 固相组蛋白-VWF结合实验

1. 用含0.5%脱氧胆酸钠的50 mM碳酸盐缓冲液（pH 9.6）将组蛋白稀释至10 µg/mL，于4 °C过夜包被微孔板。
2. 用含0.1% Tween 20的250 µL PBS洗涤平板3次，每次洗涤间隔孵育10分钟。
3. 用含0.1% Tween 20和1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液200 µL在室温下封闭平板1小时。
4. 重复步骤 3.2。
5. 将血浆来源的人VWF/因子VIII复合物用生理盐水缓冲液（10 mM 磷酸氢二钠）从200 mU/mL 至 25 mU/mL 进行系列稀释_, 500 mM 氯化钠和 0.1% Tween 20，pH 7.2）。每孔加入 100 µL，室温孵育 2 小时。
6. 重复步骤 3.2。
7. 使用含 PBS-0.1% Tween 20 和 1:1,000 兔多克隆抗 VWF 抗体-HRP 偶联物的溶液 100 µL，在室温下孵育 1 小时，检测 VWF 与固定化组蛋白的结合。
8. 重复步骤 3.2。
9. 将 100 µL OPD 底物试剂加入孔板，孵育 30 分钟，然后加入 100 µL 1 M HCl 终止反应₂SO₄在492 nm处测定光密度。

4. 在流动小室中接种内皮细胞

1. 将0.5 mL胶原包被缓冲液（见步骤2.1）吸入一支1 mL鲁尔锁扣注射器中。
2. 将该注射器的鲁尔锁扣端拧接到流室载玻片的储液端口上。
3. 缓慢推动活塞，直至整个通道完全覆盖，且每个储液端口均充满液体。对每个通道重复此操作，并将流室置于37 °C孵育24 h。
4. 使用200 μL移液器吸除胶原包被缓冲液。另取一支注射器吸入1 mL HBSS，缓慢推动活塞以冲洗流室的每个通道。从流室的对侧端口用200 μL移液器吸除洗涤液。重复此洗涤步骤两次。
5. 将约100 µL含10% FBS的生长培养基中浓度为3 × 10⁶ cells/mL的内皮细胞（BOEC）悬液加入流室的通道中。
   注：内皮细胞的接种密度超过流室的承载能力，目的是确保通道表面最大程度覆盖；未贴壁的细胞将在后续洗涤步骤中被去除。
6. 将流室置于37 °C孵育24 h。每8–12 h使用鲁尔锁扣注射器更换培养基（如步骤4.4所述）。确保通道内无可见气泡。

5. 从人全血中分离血小板

1. 在生物安全柜中，使用30 G针头将300 µL酸性柠檬酸葡萄糖缓冲液（含85 mM 枸橼酸三钠、111 mM D-葡萄糖和71 mM柠檬酸，pH 4.5）加入无添加剂的3 mL真空采血管中。
2. 按照Bernardo et al²⁶发表的类似方案，通过静脉穿刺从健康志愿者（近七日内未使用抗血小板药物及非甾体类抗炎药）采集全血（共采集三管，每管3 mL）。
3. 弃去第一管血液，因静脉穿刺初期可能造成组织损伤，从而引发血小板自发性活化。
4. 轻柔翻转真空采血管三次，使血液与抗凝剂充分混匀。
5. 将真空采血管在24 °C（室温）下以150 × g离心15分钟。
6. 在生物安全柜中用移液器缓慢吸取富血小板血浆（上清液），并小心转移至15 mL锥形管中。将每个真空采血管中的富血小板血浆转移至同一个锥形管，以避免潜在的交叉活化。
   注意：血小板分离操作应在生物安全柜中进行，以防止细菌污染以及可能的人工血小板和/或内皮细胞活化。
7. 将锥形管在24 °C（室温）下以900 × g离心10分钟，使血小板沉淀成团。
8. 用移液器吸出并弃去乏血小板上清液。
9. 用1 mL柠檬酸-葡萄糖-钠（CGS）缓冲液（含13 mM枸橼游戏副本钠、30 mM D-葡萄糖和120 mM氯化钠，pH 7.0）小心洗涤沉淀物。
   注意：加入CGS缓冲液并轻柔重悬沉淀时，血小板会呈现丝状结构。若样本受到血小板活化污染，则血小板不易重悬，并呈现团块状。
10. 待血小板完全重悬后，在24 °C（室温）下以900 × g离心10分钟。
11. 移除CGS洗涤缓冲液，并将沉淀重悬于3 mL Tyrode缓冲液（含138 mM氯化钠、5.5 mM D-葡萄糖、12 mM碳酸氢钠、2.9 mM氯化钾和0.36 mM磷酸氢二钠，pH 7.4）中。确保血小板完全重悬；若观察到聚集现象，则弃去该样本。
12. 向每3 mL洗涤后血小板的锥形管中加入1.5 µL 20 mM DiOC6储备液（将57.25 mg溶于5 mL甲醇中），终浓度为1 µM。
    注意：DiOC6是一种绿色荧光线粒体染料，本实验中用于标记血小板。
13. 将1 mL洗涤后的血小板溶液分装至三个1.5 mL微量离心管中。
    注意：本实验所需血小板体积根据流室尺寸、所需剪切应力及实验时长（步骤6.5）计算得出。可根据条件变化调整本方案，以确保有足够的液体体积维持流动。
14. 分离后应在2小时内使用洗涤后的血小板。

6. 流动装置组装

1. 将一段70厘米长的无菌硅胶管（内径1.6毫米）一端连接至一个直角公头鲁尔接头，另一端连接至一个母头鲁尔锁紧接头。
2. 将连接在管路上的母头鲁尔锁紧接头与一个20 mL注射器相连。
3. 重复步骤6.1和6.2两次，制备三个相同的注射器-管路连接装置。
4. 使用注射泵产生液体流动。在注射泵中输入以下参数：注射器内径和流速。
   注：20 mL注射器的内径为19.55 mm。流速需根据期望的剪切速率/剪切应力以及流动腔室的尺寸进行计算。在本研究使用的流动腔室中，若要达到1 dyn/cm²（低静脉剪切条件下观察到的值），所需流速为9.37 µL/min。由于已有证据表明组蛋白与静脉血栓形成相关，因此选择中等静脉剪切应力4.45 dyn/cm²。该计算基于缓冲液黏度与水相近的假设，此时对应的流速为41.7 µL/min。不同尺寸流动腔室流速的计算公式可参考以下内容：
   1. 使用注射泵上的按钮选项，将泵设置为抽吸液体模式。
5. 将三个连接管路的注射器安装到注射泵上，并用夹具牢固固定注射器及推杆。
6. 将直角公头鲁尔接头分别连接至另一段20厘米长的无菌硅胶管的两端。
7. 将其中一个直角鲁尔接头连接至一个钝头18号针头。
8. 重复两次，为流动腔室的三个通道分别制备三个相同的进液系统。
   注：硅胶管和鲁尔接头可在重复使用前用10%次氯酸钠溶液清洗，再用蒸馏水冲洗。不建议重复使用流动腔室。

7. 显微镜设置

1. 使用配备全自动化载物台的转盘式显微镜。采用提供405、458、491、543和633 nm激光谱线的激光光源进行照明。所有图像均使用20倍物镜采集。使用分析软件调整所有参数（http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf）。
2. 选择通道设置（发射滤光片：520/35），激发波长为 491 nm，用于图像采集。将电子倍增电荷耦合器件的电子倍增增益设为 150，曝光时间为 200 ms，以获得完整的动态数据范围。
   注意：血小板使用绿色荧光染料DiOC6进行标记，其最大波长（激发，482 nm；发射，504 nm）。
3. 将491 nm激光功率调整为20%。
4. 标记三条泳道的中心，选择1 μm为z轴范围，0.5 μm为步长。选择时间点的数量（即， 持续时间）以及图像之间的时间间隔（即， 间隔）每10秒拍摄一张图像；选择 "60 个时间点" 每张载玻片。将显微镜设置为采集三个通道的图像，并将其保存至指定的实验文件夹中。
   注意：由于流室具有三个通道，显微镜需要在三个位置之间切换以采集图像。

8. VWF-血小板串状结构形成

1. 使用与步骤 4.4 相同的技术，从流室（来自步骤 4）中移除培养基。
2. 加入100 µL用无血清培养基稀释的组胺（25 µM）、PMA（100 nM）、UH、HK 或 HR（均为25 µg/mL）（如步骤1.4所述），在室温及常氧条件下刺激BOEC单层细胞15分钟₂/CO₂.
   注意：尽管在37 °C下进行刺激对于VWF释放并非必需，但可增强VWF的胞吐作用²⁷.
3. 确保流室的三个独立通道中有一个保持未处理状态，作为实验对照。
4. 使用1 mL注射器移除培养基，并加入100–200 µL PBS以洗去内皮单层细胞上的分泌刺激剂。
5. 使用血管夹将流动室固定在载物片支架上，以确保流动室位置稳固。
6. 将70 cm管路（连接注射器的一端）末端的可用雄性鲁尔接头连接至流室的储液槽。对另外两个流室通道重复此操作。
7. 启动注射泵以去除 PBS 洗涤液。向对侧流室储液池中用移液器加入额外的 PBS，以确保各通道不会干涸。
8. 观察流路系统，确保三个通道的流速一致，然后暂停注射泵。
9. 选择每个泳道的大致中间区域进行成像，并确保在不同实验之间选择的成像区域基本一致。
   注意：操作显微镜的人员可对实验条件设盲。此步骤可确保在血小板流动前显微镜已正确聚焦（参见步骤7）。
10. 连接一个雌性鲁尔接头 将5 mL注射器连接至游离的雄性鲁尔接头（步骤6.8），并将钝头针浸入含有洗涤后血小板溶液的1.5 mL微量离心管（步骤5.13）中。缓慢抽吸血小板溶液，使其通过管路，确保系统内无气泡。
11. 移除5 mL注射器，将雄性鲁尔接头连接至流室的开放储液端。对三个通道重复此操作。
12. 重新启动注射泵，在避光条件下使用显微镜及第7步的实验方案设置，持续采集血小板流动过程中的图像10分钟。
13. 10分钟后，断开流室储液器进液管上的鲁尔接头，并用PBS填充储液器，以维持对内皮单层细胞的灌流。

9. VWF-血小板串状结构定量分析

注意：需要持续流动的 PBS 以维持 VWF-血小板串的伸展状态，便于进行图像分析。停止流动会导致 VWF 变为球形，从而影响 VWF-血小板串的定量分析。在图像采集过程中，必须及时向每个储液槽补充 PBS。如果在此步骤中观察到细胞皱缩或脱落现象，可用 HBSS 替代 PBS。

1. 从第一泳道开始，使用20倍物镜在玻片中部区域对每个泳道每张玻片采集10幅无重叠的图像。对每个泳道重复此操作。
   注意：应避免采集储液池周围的区域，因为这些区域存在湍流剪切应力。
2. 使用图像处理软件，通过点击"图像"、"调整"和"亮度/对比度"来调节亮度。拖动滑动条，直至黏附的血小板能够清晰显示并可用于定量分析。
3. 当图像中观察到三个或以上排列成串的血小板时，记录为一条VWF-血小板串。统计每幅图像中所有VWF-血小板串的数量。对全部10幅图像重复此操作，并计算实验的平均值。
   注意：执行定量分析的人员可对实验条件设盲。无需对VWF进行共染色，此方法已由独立研究证实^8,28,29。
4. 每种分泌激动剂至少重复实验三次，以进行评估。

结果

为了直接评估组蛋白对内皮细胞释放血管性血友病因子（VWF）的影响，我们将融合生长的BOECs暴露于含有PMA（阳性对照）、UH、HR和HK的无血清培养基中，持续2小时。结果显示，HK处理使培养基中内皮细胞释放的VWF蛋白（VWF:Ag）增加了2倍（图1）。有趣的是，当BOECs经UH和HR刺激后，培养基中检测到的VWF:Ag水平低于未处理组。我们推测，由于组蛋白可直接与VWF结合³⁰，它们可能不同程度地干扰了培养基中VWF:Ag的检测。为了评估组蛋白与VWF的结合能力，我们采用固相结合实验。结果显示，UH和HR与VWF的结合能力强于HK（图2），该结果支持了图1中所示的检测干扰现象。

已有研究表明，细胞外组蛋白可在体外激活血小板...

讨论

尽管VWF-血小板串状结构的生理相关性仍存在争议，因其在VWF裂解蛋白酶ADAMTS13存在下会迅速解体，但它们可作为可量化的指标 体外 血管性血友病因子介导血小板募集至血栓形成部位的模型，该部位组蛋白水平局部升高⁵此外，在缺乏 ADAMTS13 活性的病理状态下（如血栓性血小板减少性紫癜，TTP），或在 ADAMTS13 活性受到抑制的炎症微环境中，均可观察到 VWF-血小板串状结构 体内³² 并可能促进血小板微聚集和白细胞外渗，从而将血管性血友病因子（VWF）的止血功能与促炎功能联系起来³³最后，有研究假设VWF-血小板串的形成可能是静脉和/或动脉血栓形成的起始事件，作为病理性血栓形成的起始核心。

在流动腔系统中，VWF-血小板串的形成可用于研究WPB的胞吐作用、ADAMTS13对VWF的裂解以及VWF与血小板的结合能力。成功实施这些实验包含多个关键步骤。然而，根据该模型的具体应用，可对实验方案进行相...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小牛胸腺未分级组蛋白（UH）	Worthington Biochemical	HLY	用低血清培养基重悬（5 mg/mL）
小牛胸腺赖氨酸富集组蛋白（HK）	Sigma-Aldrich	H5505	用低血清培养基重悬（5 mg/mL）
小牛胸腺精氨酸富集组蛋白（HR）	Sigma-Aldrich	H4830	用低血清培养基重悬（5 mg/mL）
佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA）	Sigma-Aldrich	P8139	用DMSO重悬（20 mM）
组胺	Sigma-Aldrich	H7125-1G	用水重悬（50 mg/mL）
3,3' 二己氧基羰花青碘化物（DiOC6）	Invitrogen	D273	用甲醇重悬（20 mM）
兔抗血管性血友病因子包被抗体	DAKO	A0082	用于血管性血友病因子ELISA
兔抗血管性血友病因子检测抗体，HRP标记	DAKO	P0026	用于血管性血友病因子ELISA和组蛋白-血管性血友病因子结合实验
Nunc MaxiSorp 平底96孔微孔板	eBioscience	44-2404-21	用于组蛋白-血管性血友病因子结合实验
Immulon 4 HBX 平底96孔酶标板	Thermo Scientific	3855	用于血管性血友病因子ELISA
Humate-P	CSL Behring	N/A	血浆来源的人血管性血友病因子/第八因子复合物
正常参考血浆	Precision BioLogic	CCNRP-05	用于血管性血友病因子ELISA标准曲线
邻苯二胺二盐酸盐（OPD）试剂	Sigma-Aldrich	P8287	ThermoFisher Scientific提供等效产品（目录号：34006）
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	用于BOEC细胞的培养和初始接种
Hank's平衡盐溶液（HBSS）	ThermoFisher Scientific	14025092
大鼠尾胶原蛋白I型	Corning	354236
Gibco Opti-MEM I 低血清培养基	ThermoFisher Scientific	31985070	用于内皮细胞刺激
METAMORPH 显微镜自动化与图像分析软件	Molecular Devices	N/A
BD Vacutainer 无添加剂采血管	BD Biosciences	366703
µ-Slide III 0.1（流动腔室）	Ibidi		该产品已停产。建议使用 µ-Slide VI 0.1（#80661）或 0.4（#80601），并重新计算所需流速和血小板体积，以维持4.45 dyn/cm²的剪切应力
硅胶管，内径1.6 mm，5 m，已灭菌	Ibidi	10842
鲁尔锁母接头：天然聚丙烯，已灭菌	Ibidi	10825
鲁尔弯头公接头：白色聚丙烯，已灭菌	Ibidi	10802
钝化18G针头	BD Biosciences	305180
20 mL注射器	BD Biosciences	302830
注射泵	New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM	N/A
Quorum WaveFX-4X1转盘共聚焦显微镜	Quorum Technologies	N/A
图像处理软件	ImageJ	N/A