本文介绍了一种利用自动化免疫基质辅助激光解吸电离（iMALDI）技术对复杂生物液体中蛋白质进行定量的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
质谱法（MS）是用于定量复杂样品中蛋白质的最常用技术之一，因其可直接检测每个目标分子的质荷比，具有优异的分析特异性。然而，基于质谱的蛋白质组学与其他大多数分析技术类似，倾向于检测高丰度的分析物，因此在复杂样品中实现低 ng/mL 或 pg/mL 检测限仍具挑战性，而许多与疾病相关的蛋白质在人血浆等生物流体中的浓度正位于这一范围。为了辅助低丰度分析物的检测，已将免疫富集技术整合到检测流程中，在质谱测量前对分析物进行浓缩和纯化，从而显著提高检测灵敏度。本文介绍了一种用于定量生物流体中蛋白质和肽段的免疫基质辅助激光解吸/电离（iMALDI）技术，该技术基于磁珠上的免疫富集，随后在无需预先洗脱的情况下进行 MALDI-MS 检测。抗肽抗体被偶联至磁珠表面，并与样品孵育。洗涤后，将磁珠直接转移至 MALDI 目标靶板，在磁珠表面加入基质溶液后，使用 MALDI-飞行时间（MALDI-TOF）仪器进行信号检测。与其它免疫-MS 检测方法相比，该方法简化了样品前处理流程，且 MALDI 检测速度快。整个样品前处理过程通过液体处理系统实现自动化，提高了检测的重复性和通量。本文中，iMALDI 检测用于测定血浆中血管紧张素 I（Ang I）肽段的浓度，该指标在临床上作为血浆肾素活性的读数，用于原发性醛固酮增多症（PA）的筛查。
引言
质谱技术已成为定量蛋白质组学中不可或缺的工具。质谱能够测定目标蛋白质或肽段的质量，因此与免疫测定相比，所获得的分析物信号具有高度特异性。电喷雾电离和基质辅助激光解吸电离（MALDI）是检测蛋白质和肽段最常用的两种电离方法1,2,3,4。基于质谱的蛋白质定量面临的主要挑战之一，是在高丰度蛋白质存在的情况下，于复杂样品中检测浓度在 ng/mL 或 pg/mL 水平的低丰度蛋白质，而许多在人血浆中发现的候选蛋白质生物标志物正位于这一浓度范围5。这一问题在很大程度上源于人类蛋白质组固有的宽动态范围和高度复杂性6。
为了克服这些检测挑战，已开发出免疫质谱（immuno-MS）方法，通过将目标蛋白质或肽段从样品溶液中富集到固相载体表面，随后洗脱分析物并进行质谱检测7,8,9,10。通过免....
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方案
以下试剂的用量基于20份患者血浆样本的检测需求。下述实验方案遵循维多利亚大学人类研究伦理委员会的指导原则。
1. 人血浆中血管紧张素 I 的生成
- 将血浆样本（≥200 µL）在室温水浴中解冻5分钟，然后置于冰上直至完全解冻。
- 手动将每份血浆样本200 µL转移至1.1 mL深孔板（样本板）的不同孔中，并在离心机中以2 °C、1278 × g离心10分钟。
- 使用自动化液体处理系统，将500 fmol/µL的Ang I NAT标准溶液用鸡卵白蛋白（CEWA）进行系列稀释，制备六种校准品溶液（浓度分别为0.1、0.2、0.6、1.9、5.7、17.2 fmol/µL）。
- 用移液器将每种校准品200 µL加入相应孔中，并向样本板中加入125 µL生成缓冲液。
注意：磷酸盐缓冲液（PBS）中的CEWA需在实验当天新鲜配制。 - 使用自动化液体处理系统，在新板中将125 µL血浆上清液或125 µL PBS中的CEWA与25 µL Ang I生成缓冲液混合，该生成缓冲液包含1 M Tris、0.2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）。
注意：通过将1 M Tris/0.2 mM EDTA水溶液（用乙酸调节pH至5.5）与PMSF溶液（100 mM甲醇溶液）混合配制Ang I生成缓冲液。两种溶液均可在4 °C保存最多1个月。实验当天将两....
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结果
一种用于测量血管紧张素 I 的自动化 iMALDI 流程如图所示 图1靶向肽段（内源性肽段或蛋白质消化后产生的肽段）在抗肽段磁珠上富集，随后将磁珠转移至目标板进行基质辅助激光解吸电离（MALDI）检测。与需要额外肽段洗脱步骤的其他免疫质谱技术相比，该流程更为简化。iMALDI检测的自动化可实现对大量样本的高通量分析，且日间变异系数（CV）低于10%。 20. 通过检测人血浆样本中的血管紧张素 I 获得的代表性质谱图如图所示 图2SIS 肽段作为肽段定量的内标。采用自动化 iMALDI 检测法获得的 188 份患者样本的 PRA 值与采用临床 LC-MS/MS 方法获得的 PRA 值之间的相关性17 如图所示 图3两种方法的相关系数为0.98；斜率之间的差异可能是由于两种方法使用了不同的内标物，或iMA.......
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讨论
与传统的基于质谱的蛋白质定量方法相比，iMALDI利用抗体富集分析物并从复杂样品中纯化它们，从而实现对低浓度蛋白质或肽段的定量。iMALDI实验方案中的一个关键步骤是目标肽段的免疫富集。为此，应选择具有高特异性和高亲和力的抗体。在SISCAPA方法中，已有报道指出，为在低至ng/mL水平实现高灵敏度，所需抗体的亲和力需达到10-9 M或更高21。此外，为实现最佳富集效果，应优先选用具有高抗体结合容量的磁珠。
此外，获得目标分子的相对"干净"谱图并尽量降低背景信号水平也非常重要。在免疫富集步骤后，通过充分洗涤磁珠可实现较高的信噪比。此外，我们发现，在靶板上加入基质溶液并干燥后，对磁珠点位进行洗涤，可显著降低噪声信号，从而提高信噪比。
本研究中展示的iMALDI PRA检测方法无需蛋白水解步骤，因为目标分子Ang I本身就是一种肽。通常在样品中定量蛋白质分子时，需先将蛋白质消化为肽段再进行免疫富集；但对于含有表位的肽段，也可在捕获蛋白质后再进行消.......
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披露
C.H.B 持有 iMALDI 技术的专利。
致谢
我们感谢加拿大基因组计划（Genome Canada）和不列颠哥伦比亚省基因组计划（Genome British Columbia）通过基因组创新网络（Genome Innovations Network, GIN）为本研究的运行（项目编号：204PRO）和技术开发（项目编号：214PRO）提供的资金支持。我们感谢麦吉尔大学健康中心研究所药物发现平台提供MALDI-TOF仪器用于拍摄实验过程。H.L. 感谢加拿大自然科学与工程研究理事会（National Science and Engineering Research Council of Canada, NSERC）提供的博士后奖学金支持。C.H.B. 感谢前沿捐赠基金（Leading Edge Endowment Fund, LEEF）的支持。C.H.B. 感谢麦吉尔大学分子肿瘤学塞格尔讲席（Segal McGill Chair in Molecular Oncology）的支持（加拿大魁北克省蒙特利尔市）。M.X.C. 和 C.H.B. 感谢沃伦·Y·索珀慈善信托基金（Warren Y. Soper Charitable Trust）和阿尔文·塞格尔家族基金会（Alvin Segal Family Foundation）向犹太总医院（加拿大魁北克省蒙特利尔市）提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 健康对照人血浆 | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| 碳酸氢铵 | Sigma Aldrich | 09830 | |
| 二碱式柠檬酸铵 | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS（>=98%） | Sigma Aldrich | C9426 | |
| 鸡蛋清白蛋白（>98%） | Sigma Aldrich | A5503 | |
| 乙二胺四乙酸 | Sigma Aldrich | EDS | |
| α-氰基-4-羟基肉桂酸 | Sigma Aldrich | 70990 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma Aldrich | P4417 | |
| 苯甲基磺酰氟 | Sigma Aldrich | 78830 | |
| 三氟乙酸 | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS 级 |
| 乙腈 | Fluka | 34967 | LC-MS 级 |
| 水 | Fluka | 39253 | LC-MS 级 |
| 乙酸 | Fluka | 320099 | LC-MS 级 |
| 三（羟甲基）氨基甲烷 | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G 磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| 抗血管紧张素 I 山羊多克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat 和 SIS 血管紧张素 I | 在维多利亚大学-加拿大基因组学中心蛋白质组学中心合成 | ||
| 自动化液体处理系统 | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo 机器人工作站 |
| 磁铁 | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 磁铁 |
| 试管旋转仪 | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake 试管旋转仪 |
| 磁铁 | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 侧裙式磁铁 |
| 磁铁 | VP Scientific | 771RM-1 | 用于将磁珠拉至孔底 |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF 仪器 |
参考文献
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
- Nicol, G. R., et al. Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers fr....
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重印与许可
