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方法文章

使用原子力显微镜对单个蛋白质分子进行力谱分析

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DOI：

10.3791/55989

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2019年2月28日

 ,  ,  ,  , 
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University

本文内容

摘要

我们描述了使用原子力显微镜测量单个蛋白质分子力学性质及其机械解折叠路径的详细步骤与策略。同时，我们展示了代表性结果，以作为筛选和判断高质量单个蛋白质分子记录的参考依据。

摘要

从氨基酸序列确定蛋白质折叠形成其天然三维结构的过程是生物学中的一个重要问题。原子力显微镜（AFM）可通过拉伸和松弛单个蛋白质分子，揭示其特异性的去折叠与再折叠特征，从而解决这一问题。基于AFM的单分子力谱技术（AFM-SMFS）能够稳定地测量在传统整体（生化）实验中无法观测到的蛋白质高能构象。尽管已有大量论文阐述了AFM-SMFS的基本原理，但由于缺乏详尽完整的实验方案，开展SMFS实验仍具有挑战性。本研究简要介绍AFM的基本原理，并全面详述相关实验方案、操作步骤及数据分析方法，以期为获得高质量的SMFS实验结果提供指导。我们展示了单个蛋白质机械去折叠测量的代表性SMFS结果，并针对一些常见问题提供了相应的故障排除策略。

引言

原子力显微镜（AFM）在单分子力谱（SMFS）方面的进展，使得对单个蛋白质分子进行力学操控和精确表征成为可能。这些表征研究为蛋白质力学性质1，2、蛋白质折叠3、蛋白质-配体相互作用4、蛋白质-蛋白质相互作用5以及基于蛋白质的工程材料6，7，8提供了新的认识。SMFS在研究蛋白质去折叠过程中尤为有用，因为通过AFM拉伸可使蛋白质分子内部的化学键和物理键根据其刚性逐步延展，从而导致轮廓长度持续增加。对蛋白质分子的这种过度拉伸可在力-伸长曲线上产生一个突然的转变，形成断裂事件（或力峰）。该力峰直接反映了蛋白质在机械去折叠过程中解折叠力的大小及其结构变化。最早利用AFM开展的研究之一是对肌联蛋白（titin）的测量1，该研究在无需使用高浓度化学变性剂或极端温度等非天然变性条件的情况下，揭示了生理条件下蛋白质去折叠与再折叠的新特征。

SMFS 实验可在多种仪器上进行，但本文仅讨论原子力显微镜（AFM）。AFM 由四个主要部分组成：探针、检测器、样品台和压电扫描器。探针位于悬臂自由端的一个尖锐尖端。校准后，在拉伸连接分子的过程中，通过测量从悬臂背面反射的激光束来检测悬臂的弯曲程度，从而利用胡克定律精确测定作用力。反射的激光束投射到四象限光电二极管检测器上，该检测器产生的电压与激光束偏离二极管中心的位移成正比。含有蛋白质样品的基底被固定在三维压电平台上，该平台可实现亚纳米级精度的控制。计算机读取光电二极管检测器的电压信号，并通过计算机控制的电压源调节三维平台。这些压电驱动平台通常配备电容式或应变片式位置传感器，用于精确测量压电位移，并通过反馈控制系统校正滞后效应。压电控制器输出的传感器信号利用出厂校准的压电电压常数转换为距离。图 2 展示了一条典型的拉伸实验力-伸长曲线示例。

原子力显微镜单分子力谱（AFM-SMFS）实验有两种类型：恒定速度和恒定力拉伸测量。恒定力SMFS测量方法见Oberhauser et al.9的描述，而本文重点介绍恒定速度测量。典型的AFM恒定速度拉伸实验通过向压电元件施加电压，使其缓慢移动基底相对于悬臂针尖的位置来完成。在典型实验中，针尖最初轻压在表面。通过将基底从针尖方向移开使其脱离接触，从而开始拉伸测量。如果蛋白质最初与针尖接触，则会被拉伸，并测量得到力随位移变化的去折叠曲线。随后将基底重新移回与针尖接触，测量松弛过程中的力-位移曲线，由此可确定蛋白质的折叠行为。

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方案

1. 蛋白质制备

  1. DNA克隆
    1. 合成目的DNA序列，例如NI的DNA序列10C10或分离 通过 使用标准分子生物学技术从宿主生物体进行PCR11在合成过程中或通过在PCR引物的5’端添加限制性酶切位点，使目的基因两侧带有与质粒pEMI91（Addgene #74888）中某一模块相对应的酶切位点12.
    2. 分别消化质粒pEMI9112 以及带有特定限制性酶切位点的感兴趣DNA序列，使得目标序列两侧被串联的I91重复序列所包围（参见 图1）。遵循限制性酶切位点的标准操作流程。
    3. 使用凝胶电泳纯化消化产物，然后按照标准方案使用T4 DNA连接酶连接产物。连接完成后，将质粒转化入 E. coli 用于质粒纯化的细胞，采用标准方案纯化质粒。使用 T7 引物或内部 pEMI91 引物进行测序，以确认序列已成功转化。
  2. 转化
    1. 从-80°C冰箱中取出蛋白表达菌株，如C41 (DE3) pLysS菌株，移除80 °C 在冰上完全解冻。
    2. 添加 1 µL 将质粒DNA加入细胞中并轻轻搅拌；不建议上下吹打，因为这会引入气泡并使细胞受热。
    3. 将含有细胞和质粒的培养管置于冰上孵育30分钟。
    4. 将细胞在水浴中进行热激处理 42 °C 45 秒。
    5. 将离心管放回冰上静置 2 分钟。
    6. 放置 950 µL 在细胞中加入LB肉汤，于250 rpm振荡培养1小时 37 °C.
    7. 放置约 200 µL 转化至含有LB平板 100 µg/mL 氨苄青霉素。如果使用的质粒不是pEMI91，则应使用适用于该质粒的相应抗生素。将平板置于培养箱中过夜培养，温度为 37 °C第二天，从培养箱中取出培养板，用封口膜封好，4℃保存，可存放长达1个月。
  3. 蛋白质表达
    1. 接种15 mL LB肉汤培养基 100 µg/mL 50 mL 离心管中的氨苄青霉素 37 °C 通过将无菌移液器吸头接触平板上的单个细菌菌落，并在LB培养基中反复吹吸，进行过夜培养。
    2. 将15 mL培养物转移至1 L LB肉汤培养基中 100 µg/mL 氨苄青霉素，于4–12小时内振荡培养 37 °C （直至OD600 > 0.8).
    3. 收集10 mL培养物用于质粒制备。
    4. 加入0.2–1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG），并将温度降至室温过夜表达。
    5. 第二天收获细胞，将细胞悬液分至四个离心管中，在4,000 × g 40分钟，然后将沉淀在-80 °C 数小时。
    6. 将从细胞中提取的质粒送交测序，所用引物对应于蛋白插入片段的序列12 并验证插入DNA的保真度。
  4. 蛋白质纯化
    1. 室温下解冻一管冷冻细胞30分钟。
    2. 将解冻的细胞悬浮于裂解缓冲液中（38 mL 水，2 mL 甘油，50 mM Tris-HCl pH 7.6，150 mM NaCl，1 mM CaCl₂，1 mM MgCl₂，1 mg/mL 溶菌酶，1× cOmplete 蛋白酶抑制剂）2, 10 µg/mL DNase，1 mM PMSF，1 mM TCEP 500 µg/mL 溶菌酶）并在冰上振荡1小时。
    3. 将裂解的细胞在 -80 °C 数小时后在室温下重新解冻。
    4. 以 13,100 × g 离心裂解液 g 30 分钟 4 °C.
    5. 将上清液通过重力流柱层析，用于特异性标签（例如， Strep标签或His标签
    6. 使用适用于Strep-tag或His-tag的适当缓冲液，通过离心滤器进行缓冲液置换，并于 4 °C 使用前

2. 样品制备用载玻片的准备

  1. 使用 Piranha 溶液制备玻璃载片。
    1. 将 10–30 片圆形玻璃盖玻片（半径为 7.5 mm）放入一个 40 mL 玻璃烧杯中。
      注意： 此步骤及后续步骤应在通风橱中进行。处理危险化学品时，请遵循标准操作规程。
    2. 加入 30 mL 浓硫酸（18.4 M）。
    3. 加入 10 mL 30% 过氧化氢。
    4. 将混合物加热至 95 °C，持续 10–30 分钟。
    5. 小心地将 Piranha 溶液倾倒至单独的废液容器中（可重复使用或废弃处理）。
    6. 用去离子水冲洗载片，以去除残留的 Piranha 溶液。
    7. 将载片悬浮于 40 mL 丙酮中。
    8. 将丙酮倾倒至废液容器中，并将载片重新悬浮于 40 mL 乙醇中。
    9. 使用洁净镊子逐个小心取出载片，并用氩气或高纯空气吹干。
    10. 将洁净且干燥的载片置于真空环境中，直至进行金蒸发镀膜；如需长期保存，则置于氩气环境中。
  2. 制备镀金载片（可选步骤）。
    注意： 此步骤需使用真空（电子束）蒸发镀膜仪，大型高校的洁净室设施中通常配备此类设备。
    1. 使用玻璃切割器将五片显微镜载片（25 mm × 75 mm 矩形）切成两半。
    2. 在每片半截载片的中部贴上双面胶带。
    3. 剪下便利贴的粘性面，并将其粘附在双面胶带上，使便利贴的粘性面朝上。便利贴通常粘性较弱，但仍能牢固附着于载片上，防止后续断裂。此后，这些半截载片即可作为玻璃载片的固定夹具。
    4. 小心地将四片洁净的玻璃载片（来自步骤 2.1.10）压紧在夹具粘性面的四个角上。
    5. 将玻璃载片转移至电子束蒸发镀膜仪中。根据仪器说明，在表面蒸镀 70 nm 铬层和 300 nm 金层。
    6. 将镀金载片在氩气环境中保存。

3. 样品制备

  1. 准备载玻片。
    1. 选取一个洁净的铁质圆盘（直径15 mm），并在其上贴附一个粘性标签。
    2. 取下粘性标签上的覆盖片。
    3. 选取一块洁净的玻璃片（来自第2.1.10节）或金片（来自第2.2.7节），将其牢固地放置在铁圆盘的粘性面上，此即为样品载玻片。
  2. 将蛋白质沉积到载玻片上。
    1. 使用缓冲液交换柱（如0.5 mL离心过滤器）将多聚蛋白透析至实验缓冲液中（25 mM Tris-HCl，pH 7.6，含150 mM NaCl）。将蛋白质溶液在柱中以13,000 rpm离心10分钟，然后反转柱子，以1,000 rpm离心2分钟，将蛋白质洗脱至新的缓冲液中。
    2. 使用分光光度计在280 nm处测定吸光度，以确定蛋白质的大致浓度。
    3. 将蛋白质稀释至最终体积为100 µL，浓度为10–100 µg/mL。
    4. 将60 µL蛋白质溶液滴加到载玻片中央。此步骤需小心操作，避免液体渗入玻璃与铁质载片之间的缝隙，否则可能在实验过程中导致粘合剂膨胀，引起样品不可控移动。
      注意：金载片具有疏水性，会形成球形液滴；而玻璃载片更亲水，蛋白质溶液可能铺展开。
    5. 让样品在室温下静置10–60分钟。在此期间，可进行下一步操作，开始设置原子力显微镜。

4. 原子力显微镜（AFM）设置

注意：以下是原子力显微镜（AFM）设置的通用说明，具体细节可能因所使用的仪器不同而有所差异。所使用的仪器部分为自制，详见 Scholl13 的详细描述。

  1. 将悬臂安装到原子力显微镜（AFM）探针单元中。
    1. 根据应用选择具有适当特性的悬臂。对于低解折叠力（约10–50 pN），使用弹簧常数为4–10 pN/nm的悬臂；对于高解折叠力，使用弹簧常数为15–100 pN/nm的悬臂。
    2. 小心从末端夹取悬臂，并将其放入探针固定单元中。
    3. 在继续操作前，确保固定单元牢固地固定住悬臂。
    4. 将固定单元放入AFM探头中，以便对准激光。
  2. 对AFM探头中的激光进行对准。
    1. 将探头放置在倒置显微镜上，并将电池组连接至AFM探头，以提供探头内激光的电源。
    2. 将相机连接至显微镜检测器，以便在电视或显示器上观察激光光斑。
    3. 调整激光位置，使其准确照射在悬臂尖端。
  3. 将探头与样品一起安装。
    1. 向探针固定单元的每个端口注入10 µL缓冲液。
    2. 取出已孵育的样品载玻片，倾去40 µL孵育液，并在载玻片上加入40 µL缓冲液。将样品载玻片放置在压电陶瓷元件上方的磁铁上。
    3. 确保AFM载物台处于抬升位置，然后将AFM探头放置在载物台上，使AFM悬臂位于样品液滴上方。
  4. 将反射的激光光束对准光电二极管中心。
    1. 剪下一小片纸，放置在AFM光电二极管前方。
    2. 使用旋钮重新调整AFM激光位置，使纸上的激光光斑变得聚焦且明亮。
    3. 调节AFM探头中的反射镜，使激光照射到光电二极管上，以最大化所有四个象限（A+B+C+D）的总信号，并使上下两个象限之间的差值信号为零（A+B−C−D）。

5. 原子力显微镜校准

  1. 测量功率谱。
    1. 将连接至原子力显微镜（AFM）的滤波器设置为AFM探头信号的全带宽模式。
    2. 在原子力显微镜上，确保压电元件已关闭，否则会向信号中引入噪声。
    3. 使用原子力显微镜软件14 通过每次计算1,024个数据点，对512次功率谱计算结果取平均值。
    4. 使用原子力显微镜软件15 对第一个峰值对应的功率谱密度进行积分，该峰值对应于悬臂梁的主要振动模式。
  2. 计算光电二极管灵敏度。
    1. 在原子力显微镜上，打开压电控制器，并将滤波器设置更改为500 Hz（低通滤波器）。
    2. 监测AFM软件中应围绕零值波动的差分信号。使用微调装置迅速将AFM探头向下移动数百微米。重复向下移动探头并监测差分信号是否出现一致的跃变。当信号跃变的高度开始增加时，表明表面已非常接近。
    3. 一旦偏转信号在接触表面时达到饱和，立即将探头略微移离表面。
    4. 在原子力显微镜软件中，使用输入控件调节压电电压，通过上下移动100–5,000 nm来寻找样品表面。如果仍未接触到表面，需继续手动减小探头与样品之间的距离。
    5. 在原子力显微镜（AFM）软件中，进行拉伸实验，扫描尺寸约为500 nm，使探针与样品接触约100 nm的压电陶瓷行程。
    6. 测量光电二极管信号线性区域的斜率 与 压电位移曲线，其中原子力显微镜针尖保持与基底表面接触。
    7. 使用斜率和积分功率谱计算弹簧常数和灵敏度用于kC计算科学研究图示中的静力平衡方程。).

6. 数据采集

  1. 准备工作。
    1. 在连接到原子力显微镜（AFM）的滤波器上，设置滤波器参数，使采样频率至少为带宽的两倍（满足奈奎斯特准则），从而确定低通滤波截止频率的上限。
  2. 测量。
    1. 在AFM软件中，将扫描尺寸设置为多蛋白展开的总理论长度（氨基酸数目 × 0.365）再加上约40%，以留出对基底施压的空间。例如，拉伸一个9x I91构建体的理论展开长度约为300 nm，因此扫描尺寸应设为约420 nm。
    2. 在AFM软件中，将悬臂位置设定为距离表面80%的扫描尺寸处（在本例中，即距离表面约340 nm）。
    3. 在AFM软件中，初始扫描速度设为300 nm/s。
      注意：该速度可根据具体应用调整为更慢或更快。
    4. 进行拉伸实验，并记录压电陶瓷位移和光电二极管信号。使用AFM软件启动扫描。
    5. 在AFM软件中持续进行测量，直至获得约10,000次记录。
      注意：通常，阳性对照分子的捕获率约为0.5%16，因此需要进行约10,000次测量才能收集到足够用于分析的数据。

7. 数据分析

  1. 数据归一化。
    1. 对于每次记录，使用公式 extension = displacement - F/kc 计算延伸长度（其中 kc 来自步骤 5.2.7）。
    2. 通过取力-延伸曲线起始或结束段的平均值来确定基线力水平，该区域应无明显的力峰，且悬臂梁未与表面接触。随后可将整个力-延伸曲线沿力轴平移该平均值。
    3. 对数据进行平移，使延伸长度在零 y 轴上对齐。这是因为分子在轨迹开始时应处于零延伸状态。
  2. 识别目标蛋白。
    1. 筛选出至少包含四个 I91 事件的记录，这些事件可提供单分子特征图谱，代表真实的“单分子测量”。
    2. 保存被标记为单分子事件的数据，用于后续分析。
  3. 确定轮廓长度增量。
    1. 对于每次记录，使用蠕虫状链模型拟合解折叠事件，统计力学公式，力-延伸关系，聚合物物理方程，数学表达式 其中 热能方程 \(k_bT=4.1\ pN\ nm\)；分子生物物理学研究中的公式 在室温下，p 为持久长度（通常为 0.4 至 1 nm），x 为以纳米为单位的延伸长度，L 为以纳米为单位的轮廓长度。
      注意： 蠕虫状链模型的形式为精确解的插值近似，更精确的数值解可参见 Bouchiat 等17。其他可选的拟合模型见 Su 等18。
    2. 计算两个连续解折叠事件对应的 L 值之间的差值，该差值称为“轮廓长度增量”。
  4. 确定断裂力。
    1. 通过取解折叠曲线中最大下降前的最高点，计算特定解折叠事件的断裂力。

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结果

本方案的代表性结果如图2所示。两个图均展示了来自蛋白质的典型力-延伸曲线。上方图显示的是I91多蛋白的结果，下方图显示的是在目标蛋白（NI10C分子）两侧带有I91蛋白的结果。这些记录显示了I91的特征性解折叠力（200 pN）和轮廓长度增量（28 nm），表明原子力显微镜（AFM）的校准与对齐操作成功。这些力-延伸曲线可通过蠕虫状链模型（虚线）进行拟合分析，从而确定分子的力无关长度以及解折叠残基数。分析后，可通过轮廓长度增量（连续轮廓长度之间的差值）和解折叠力进一步确定蛋白质的稳定性、解折叠速率及解折叠途径19。

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讨论

该实验方案中的一个关键步骤是使用多蛋白（在步骤1.1.2中描述），作为阳性对照，用于“指纹识别”单分子事件。"指纹"通常必须包含多蛋白中各蛋白的解折叠事件（对于I91而言，解折叠力约为200 pN，轮廓长度增量约为28 nm），才能明确判断目标蛋白已被解折叠。例如，当目标蛋白两侧各连接三个I91结构域时，则必须观察到至少四个I91的解折叠事件，才能确认为明确的单分子事件。若未通过多蛋白或其他方式设置阳性对照，则所有数据均可能被误读。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国家科学基金会资助，资助编号为 MCB-1244297 和 MCB-1517245，授予 PEM。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AFM 样品圆盘，15 mm 直径Ted Pella, Inc.16218用作玻璃基底的支撑基座
圆形玻璃盖玻片，15 mm 直径，1 号厚度Ted Pella, Inc.26024用作玻璃基底以及镀金层的基础
粘性标签Ted Pella, Inc.16079粘贴在 AFM 样品圆盘上，提供粘性表面以固定玻璃盖玻片
STD Multimode 探头组件Bruker Nano Inc.1B75CAFM 探头
玻璃探针夹持器Bruker Nano Inc.MTFML-V2用于 MultiMode AFM 在液体中扫描的玻璃探针夹持器  
Microlever AFM 探针Bruker Nano Inc.MLCT带氮化硅针尖的氮化硅悬臂，适用于接触成像模式
带镀金针尖的 AFM 探针Bruker Nano Inc.OBL-10适用于对低解折叠力蛋白质进行拉伸的悬臂
多功能数据采集（DAQ）卡，16 位，1 MS/s（多通道），1.25 MS/s（单通道），32 路模拟输入National InstrumentsPCI-6259用于采集 AFM 探头和压电驱动器的信号
LISA 线性压电位移台驱动器Physik Instrumente LPP-753.11C压电驱动器，用于控制基底位置并执行拉伸测量
XY 压电位移台Physik Instrumente LPP-541.2CD压电驱动器，用于控制基底位置并在基底表面进行扫描

参考文献

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