原子力显微镜对单蛋白质分子的力谱

Summary

我们描述了使用原子力显微镜测量单个蛋白质分子的机械性能和机械展开途径的详细程序和策略。我们还展示了代表性的结果, 作为选择和理由的良好单蛋白分子记录的参考。

Abstract

蛋白质从氨基酸序列到原生三维结构的折叠过程的测定是生物学中的一个重要问题。原子力显微镜 (afm) 可以通过使单个蛋白质分子的拉伸和松弛来解决这个问题, 这直接证明了特定的展开和折叠特性。基于 afm 的单分子力谱 (afm-smfs) 提供了一种方法, 可以持续测量蛋白质中的高能构象, 而这些构象在传统的体积 (生化) 测量中是不可能的。尽管发表了许多论文来展示 afm-smfs 的原理, 但由于缺乏详尽完整的协议, 进行 smfs 实验并不容易。在本研究中, 我们简要阐述了 afm 的原理, 并详细介绍了协议、程序和数据分析, 作为从 smfs 实验中取得良好效果的指导。我们演示了具有代表性的单蛋白机械展开测量的 smfs 结果, 并为一些常见的问题提供了故障排除策略。

Introduction

afm 在单分子力光谱 (smfs) 方面的研究进展使单蛋白分子的机械操作和精确表征得以实现。这种表征对蛋白质力学^1,2、蛋白质折叠³、蛋白质配体相互作用⁴、蛋白质-蛋白质相互作用⁵和基于蛋白质的工程产生了新的见解材料^6,7,8。smfs 对于研究展开的蛋白质特别有用, 因为 afm 的拉伸允许蛋白质分子中的化学和物理键根据其刚度逐渐扩展, 从而导致轮廓长度不断增加。这种蛋白质分子的过度拉伸会在力-延伸曲线中产生突然的转变, 从而导致破裂事件 (或力峰)。力峰直接提供了在机械展开过程中蛋白质的展开力和结构变化的信息。最早使用 afm 的一项研究测量了 titin¹ , 发现了蛋白质在生理条件下展开和折叠的新方面, 而不使用非自然变性物, 如浓缩化学品或极端温度。

smfs 实验是在各种仪器上进行的, 尽管在这里我们只考虑 afm。afm 由四个主要元素组成: 探头、检测器、样品支架和压电....

Protocol

1. 蛋白质制备

1. dna 克隆。
   1. 合成感兴趣的 dna 序列, 例如, ni 10c10^的dna 序列, 或使用标准分子生物学技术^通过pcr 从宿主生物体分离11。在合成过程中或通过在 pcr 引物的 5 '-末端放置位点, 以对应于质粒 pemi91 (adgene #74888)¹²中的一个模块, 从而将感兴趣的基因与限制位点结合起来。
   2. 用一对限制位点分别消化质粒 pemi91 12 和感兴趣的 dna 序列, 使感兴趣的序列被串联 i91 重复序列所左右 (见图 1).遵循限制站点的标准协议。
   3. 使用凝胶电泳纯化消化后的产品, 然后按照标准协议, 使用 t4 dna 连接酶将产品结扎。结扎后, 将质粒转化为大肠杆菌细胞, 用于质粒纯化, 并使用标准方案纯化质粒。序列使用 t7 引物或内部 pemi91 引物来验证序列是否已成功转换。
2. 转型。
   1. 从-80°c 的冷冻机中取出蛋白质表达细胞, 如 c41 (de3) pyss 细胞, 并在冰上完全解冻。
   2. 将1μl 质粒....

Results

图 2显示了此协议的代表性结果。这两个面板都显示了蛋白质的具有代表性的力延伸曲线。顶部显示的结果来自 i91 多蛋白, 而底部显示 i91 蛋白两侧的蛋白质感兴趣, ni_10c分子。这些记录显示了 i91 (200 pn) 的特征力和轮廓长度增量 (28 nm), 表明 afm 的对齐和校准是成功的。然后, 这些力延伸曲线可以通过蠕虫样链 (虚线) 进行分析, 这有助于确定分子的力无关长度, 并确定展开的残留物的数量。一旦分析, 轮廓长度增量 (随后的轮廓长度之间的差异) 和展开力可以用来确定蛋白质的稳定性、展开速度和展开路径¹⁹。

.......

Discussion

该协议中的一个关键步骤是使用多蛋白, 在步骤1.1.2 中描述, 它作为对 "指纹" 单分子事件的积极控制。一般来说, 必须有多蛋白蛋白的展开事件 (对于 i91, 这意味着展开的力量约 200 pn 和轮廓长度增量约28纳米), 以明确的结论, 感兴趣的蛋白质已经展开。例如, 当感兴趣的蛋白质由两边的三个 i91 域侧翼时, 则必须至少有四个 i91 事件来得出结论, 它是一个正的单分子事件。如果没有通过多蛋白或其他手段进行积极控制, 那么任何数据都有可能被误解。

质粒的克隆策略取决于所关注的基因和质粒。我们已经提供了一个多蛋白质粒, 可以与这个协议¹²一起使用。此步骤中有可用的质粒, 其中包含用于简单克隆^{20、21 的}唯一限制位点。这些质粒只需要一组独特的限制位点, 即可轻松克隆到质粒中感兴趣的蛋白质中。也有可用的方法来创建这种质粒从零开始使用吉布森组装22的优势, .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM 样品盘，直径 15 毫米	Ted Pella， Inc.	16218	用作玻璃基板的底座
圆形玻璃盖玻片，15mm 直径 No.1 厚 Ted	Pella， Inc.	26024	用作玻璃基材和金涂层的基材
Adhesive Tabs	Ted Pella， Inc.	16079	粘贴在 AFM 样品盘上，为连接玻璃盖玻片提供粘性面
STD 多模式头组件	Bruker Nano， Inc.	1B75C	AFM 头
玻璃探针支架	Bruker Nano Inc.	MTFML-V2	玻璃探针支架，用于使用多模式 AFM 扫描流体。
Microlever AFM 探针	Bruker Nano Inc.	MLCT	氮化硅悬臂，带氮化硅针尖，非常适合接触成像模式
AFM 探针，带 Au 涂层针尖	Bruker Nano Inc.	OBL-10	悬臂，用于以低去折叠力拉动蛋白质
多功能数据采集 （DAQ） 卡，16 位，1 MS/s（多通道），1.25 MS/s（1 通道），32 个模拟输入	National Instruments	PCI-6259	数据采集，用于来自 AFM 头和压电陶瓷促动器的信号
LISA 线性压电陶瓷平台促动器	Physik Instrumente LP	P-753.11C	压电陶瓷促动器，用于控制基板的位置并进行拉力测量
XY 压电陶瓷平台	Physik Instrumente LP	P-541.2CD	压电陶瓷促动器，用于控制基板的位置并扫描基板表面