使用原子力显微镜对单个蛋白质分子进行力谱分析

摘要

我们描述了使用原子力显微镜测量单个蛋白质分子力学性质及其机械解折叠路径的详细步骤与策略。同时，我们展示了代表性结果，以作为筛选和判断高质量单个蛋白质分子记录的参考依据。

摘要

从氨基酸序列确定蛋白质折叠形成其天然三维结构的过程是生物学中的一个重要问题。原子力显微镜（AFM）可通过拉伸和松弛单个蛋白质分子，揭示其特异性的去折叠与再折叠特征，从而解决这一问题。基于AFM的单分子力谱技术（AFM-SMFS）能够稳定地测量在传统整体（生化）实验中无法观测到的蛋白质高能构象。尽管已有大量论文阐述了AFM-SMFS的基本原理，但由于缺乏详尽完整的实验方案，开展SMFS实验仍具有挑战性。本研究简要介绍AFM的基本原理，并全面详述相关实验方案、操作步骤及数据分析方法，以期为获得高质量的SMFS实验结果提供指导。我们展示了单个蛋白质机械去折叠测量的代表性SMFS结果，并针对一些常见问题提供了相应的故障排除策略。

引言

原子力显微镜（AFM）在单分子力谱（SMFS）方面的进展，使得对单个蛋白质分子进行力学操控和精确表征成为可能。这些表征研究为蛋白质力学性质^1，2、蛋白质折叠³、蛋白质-配体相互作用⁴、蛋白质-蛋白质相互作用⁵以及基于蛋白质的工程材料^6，7，8提供了新的认识。SMFS在研究蛋白质去折叠过程中尤为有用，因为通过AFM拉伸可使蛋白质分子内部的化学键和物理键根据其刚性逐步延展，从而导致轮廓长度持续增加。对蛋白质分子的这种过度拉伸可在力-伸长曲线上产生一个突然的转变，形成断裂事件（或力峰）。该力峰直接反映了蛋白质在机械去折叠过程中解折叠力的大小及其结构变化。最早利用AFM开展的研究之一是对肌联蛋白（titin）的测量¹，该研究在无需使用高浓度化学变性剂或极端温度等非天然变性条件的情况下，揭示了生理条件下蛋白质去折叠与再折叠的新特征。

SMFS 实验可在多种仪器上进行，但本文仅讨论原子力显微镜（AF....

方案

1. 蛋白质制备

1. DNA克隆
   1. 合成目的DNA序列，例如NI的DNA序列₁₀C¹⁰或分离 通过 使用标准分子生物学技术从宿主生物体进行PCR¹¹在合成过程中或通过在PCR引物的5’端添加限制性酶切位点，使目的基因两侧带有与质粒pEMI91（Addgene #74888）中某一模块相对应的酶切位点¹².
   2. 分别消化质粒pEMI91¹² 以及带有特定限制性酶切位点的感兴趣DNA序列，使得目标序列两侧被串联的I91重复序列所包围（参见 图1）。遵循限制性酶切位点的标准操作流程。
   3. 使用凝胶电泳纯化消化产物，然后按照标准方案使用T4 DNA连接酶连接产物。连接完成后，将质粒转化入 E. coli 用于质粒纯化的细胞，采用标准方案纯化质粒。使用 T7 引物或内部 pEMI91 引物进行测序，以确认序列已成功转化。
2. 转化
   1. 从-80°C冰箱中取出蛋白表达菌株，如C41 (DE3) pLysS菌株，移除80 °C 在冰上完全解冻。
   2. 添加 1 µL 将质粒DNA加入细....

结果

本方案的代表性结果如图2所示。两个图均展示了来自蛋白质的典型力-延伸曲线。上方图显示的是I91多蛋白的结果，下方图显示的是在目标蛋白（NI₁₀C分子）两侧带有I91蛋白的结果。这些记录显示了I91的特征性解折叠力（200 pN）和轮廓长度增量（28 nm），表明原子力显微镜（AFM）的校准与对齐操作成功。这些力-延伸曲线可通过蠕虫状链模型（虚线）进行拟合分析，从而确定分子的力无关长度以及解折叠残基数。分析后，可通过轮廓长度增量（连续轮廓长度之间的差值）和解折叠力进一步确定蛋白质的稳定性、解折叠速率及解折叠途径¹⁹。

讨论

该实验方案中的一个关键步骤是使用多蛋白（在步骤1.1.2中描述），作为阳性对照，用于“指纹识别”单分子事件。"指纹"通常必须包含多蛋白中各蛋白的解折叠事件（对于I91而言，解折叠力约为200 pN，轮廓长度增量约为28 nm），才能明确判断目标蛋白已被解折叠。例如，当目标蛋白两侧各连接三个I91结构域时，则必须观察到至少四个I91的解折叠事件，才能确认为明确的单分子事件。若未通过多蛋白或其他方式设置阳性对照，则所有数据均可能被误读。

质粒的克隆策略取决于目标基因和质粒的特性。我们已提供一种多聚蛋白质粒，可与此实验方案联合使用¹²。目前已有适用于该步骤的质粒，其含有独特的限制性酶切位点，便于进行简单克隆^20,21。这类质粒仅需一对独特的限制性酶切位点，即可将目标蛋白轻松克隆至质粒中。此外，也可采用吉布森组装（Gibson assembly）从头构建该质粒²².......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AFM 样品圆盘，15 mm 直径	Ted Pella, Inc.	16218	用作玻璃基底的支撑基座
圆形玻璃盖玻片，15 mm 直径，1 号厚度	Ted Pella, Inc.	26024	用作玻璃基底以及镀金层的基础
粘性标签	Ted Pella, Inc.	16079	粘贴在 AFM 样品圆盘上，提供粘性表面以固定玻璃盖玻片
STD Multimode 探头组件	Bruker Nano Inc.	1B75C	AFM 探头
玻璃探针夹持器	Bruker Nano Inc.	MTFML-V2	用于 MultiMode AFM 在液体中扫描的玻璃探针夹持器
Microlever AFM 探针	Bruker Nano Inc.	MLCT	带氮化硅针尖的氮化硅悬臂，适用于接触成像模式
带镀金针尖的 AFM 探针	Bruker Nano Inc.	OBL-10	适用于对低解折叠力蛋白质进行拉伸的悬臂
多功能数据采集（DAQ）卡，16 位，1 MS/s（多通道），1.25 MS/s（单通道），32 路模拟输入	National Instruments	PCI-6259	用于采集 AFM 探头和压电驱动器的信号
LISA 线性压电位移台驱动器	Physik Instrumente LP	P-753.11C	压电驱动器，用于控制基底位置并执行拉伸测量
XY 压电位移台	Physik Instrumente LP	P-541.2CD	压电驱动器，用于控制基底位置并在基底表面进行扫描