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方法文章

一种阻力动脉的细胞培养模型

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DOI：

10.3791/55992

⸱

2017年9月8日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Hematology, St. Jude Children's Research Hospital, 4Research Histology Core, University of Virginia School of Medicine

本文内容

摘要

本文描述了一种阻力动脉的细胞培养模型，可用于解析内皮细胞、平滑肌细胞内或内皮细胞与平滑肌细胞之间（即肌内皮连接）的信号通路。利用该细胞培养模型，可选择性地应用激动剂或进行蛋白质分离、电子显微镜检测以及免疫荧光分析。

摘要

肌内皮连接（myoendothelial junction, MEJ）是小直径阻力动脉中一种独特的信号微区，具有特定蛋白质和信号通路的定位，可调控血管张力和血压。由于其为内皮细胞或平滑肌细胞的突起结构，且体积微小（平均面积约1 µm²），2），MEJ 难以独立研究。然而，我们已开发出一种称为血管细胞共培养（VCCC）的细胞培养模型，可用于 体外 MEJ形成、内皮细胞极化以及阻力动脉血管壁中信号蛋白和过程的解析。VCCC具有多种应用，可针对不同细胞类型进行调整。该模型由两种细胞组成，分别生长在具有0.4 µm孔径的滤膜的两侧 体外 MEJs 可以形成。本文描述了通过细胞铺板以及分离内皮细胞、MEJ 和平滑肌组分来构建 VCCC 的方法，这些组分随后可用于蛋白质提取或活性检测。带有完整细胞层的滤膜可进行固定、包埋和切片，用于免疫荧光分析。重要的是，该模型中的许多发现已在完整的阻力动脉中得到验证，凸显了其生理相关性。

引言

在小直径阻力动脉中，一层较薄的内弹性膜（IEL）将内皮细胞（EC）与平滑肌细胞（SMC）分隔开。这些细胞可通过该弹性基质上的小孔延伸突起，并通过缝隙连接通道形成直接的胞质连接1,2。这种独特的结构被称为肌内皮连接（MEJ）。MEJ是一种微小的细胞突起（大小约为0.5 µm × 0.5 µm，具体尺寸因血管床而异），主要由内皮细胞构成，但也可能起源于平滑肌细胞3,4。许多研究者已证实，在MEJ处选择性发生的信号转导网络极为复杂，使其成为内皮与平滑肌之间双向信号传递的重要部位5,6,7,8,9,10。

然而，在完整的动脉中对MEJ处的信号通路进行机制性解析十分困难。由于MEJ是一种细胞突起结构，目前尚无法从血管壁中分离出完整的活体（in vivo）MEJ。因此，研究人员开发了VCCC模型1。重要的是，VCCC能够模拟生理状态下的内皮细胞形态11，并再现细胞顶端与MEJ区域之间信号分子的极性分布12。正是利用这一独特的模型，研究人员首次发现α珠蛋白存在于内皮细胞中，并特异性地极化分布于MEJ区域。这与传统培养的内皮细胞形成鲜明对比，后者并不表达α珠蛋白13。对于致力于微血管内皮研究的研究人员而言，若目标是解析小直径阻力动脉中发生的信号通路，采用在VCCC系统中培养的内皮细胞可能更为合适。

使用带有小直径孔隙（0.4 µm）的坚固塑料插入物（含滤膜）进行两种不同细胞类型的共培养，可防止细胞在各层之间迁移。该方法使细胞间保持10 µm的距离，这一距离显著长于 体内，但仍复制了许多 体内 MEJs 的特征，包括蛋白质定位和第二信使信号传导1,14此外，通过向特定细胞区室添加激动剂或拮抗剂，VCCC 可实现对细胞类型特异性信号通路的靶向调控。例如，向胞外室（EC）加载 BAPTA-AM 以螯合钙离子，同时用去氧肾上腺素（phenylephrine）刺激平滑肌细胞（SMC）14与其他共培养模型的描述相比15,16,17,18,19,20,21，本方法提供了分离 mRNA 和蛋白质不同组分的说明，包括滤膜孔内独特的 MEJ 组分。将该技术加入 VCCC 后，可实现对 mRNA 定位或转录变化的特异性研究22蛋白质磷酸化12,23以及蛋白质活性12本文将描述在滤膜上方接种内皮细胞（EC）、下方接种平滑肌细胞（SMC）的方法，尽管也可将这两种细胞类型以其他构型进行共培养。11,18,24.

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方案

1. VCCC 细胞铺板

  1. 在无菌条件下于 37 °C 培养大量 225 cm2 的内皮细胞（EC）和血管平滑肌细胞（SMC）培养瓶，直至细胞融合度达到 70–90%。确保使用的 EC 数量多于 SMC；若使用原代人源 EC 和 SMC，通常使用 3 瓶 EC 对应 1 瓶 SMC。
    1. 使用较低传代次数的原代细胞，且传代次数不得超过第 10 代。根据共培养的细胞类型选择培养基。对于原代人冠状动脉内皮细胞（EC），使用 EBM-2 内皮基础培养基并添加 EGM2 MV 生长因子；对于原代人冠状动脉平滑肌细胞（SMC），使用 SmBM 平滑肌基础培养基并添加 SmGM-2 生长因子。在用于培养细胞前，需将生长因子加入培养基中。
  2. 构建 VCCC 的第 1 天：用消毒剂（例如，Cavicide）喷洒大号（150 mm）培养皿及其盖子，并用纸巾或无绒布擦拭干净。随后用 70% 乙醇（EtOH）喷洒培养皿，并将其放入生物安全柜中晾干。
  3. 在无菌条件下打开滤膜插件板（见材料表），将纤连蛋白溶液涂布于插件的 SMC 侧（滤膜的底面）。将插件保留在配套的 6 孔板中，通过侧边缝隙加入纤连蛋白溶液至板底部，确保滤膜下半部分被完全覆盖（不超过 1 mL）。
  4. 在细胞培养柜中室温孵育 30 分钟后，取出插件，吸除多余液体，倒置后放入洁净培养皿的底部。暂置一旁。在吸取多余液体时，务必避免扰动滤膜插件的膜面；可通过轻轻倾斜插件板，并从插件边缘吸液来避免损伤。
  5. 用 3 mL 预热的 2× 胰蛋白酶-EDTA 溶液对一个 225 cm2 的 SMC 培养瓶进行胰酶消化，待细胞脱离培养瓶表面后，加入 9 mL SMC 培养基以中和胰酶（培养基与胰酶体积比为 3:1）。将细胞悬液转移至锥形管中，充分混匀，取 10 µL 滴加至血细胞计数板以测定细胞数量。
    1. 计数 5 × 5 个方格（即 18 个大方格）内的细胞数，乘以 10,000 得到每毫升细胞悬液中的细胞数（180,000）。再乘以 12 mL（细胞悬液总体积），得到 SMC 总数为 216 万。确保有足够的 SMC 用于接种目标孔数。
      注：例如，每孔需接种 75,000 个 SMC，则 18 孔共需 135 万个 SMC。将所需细胞总数 135 万除以每毫升含 18 万个细胞，得出需 7.5 mL 细胞悬液。再计算最终所需体积（18 孔 × 750 µL = 13.5 mL）。因此，取 7.5 mL 细胞悬液，用预热的 SMC 培养基补足至 13.5 mL，充分混匀。
  6. 将含有约 75,000 个 SMC 的 750 µL 细胞悬液小心接种至每个滤膜插件的底面，注意避免液体溢出。盖上盖子后，小心将含插件的培养皿转移至 37 °C 培养箱中过夜培养。
    注：其他类型细胞的最佳接种密度需通过实验确定。
  7. 第 2 天，向洁净的 6 孔板中每孔加入 2 mL 新鲜预热的 SMC 培养基。从培养箱中取出培养板，逐个取出插件，用吸液法去除原有培养基，然后将插件放入含 SMC 培养基的 6 孔板中。
  8. 在滤膜的另一侧（EC 侧）加入 1 mL 0.5% 牛血清明胶溶液，于 37 °C 孵育至少 30 分钟。
  9. 用 3 mL 预热的 2× 胰蛋白酶-EDTA 溶液（用无菌杜尔贝科磷酸盐缓冲液稀释 10 倍）对 225 cm2 的 EC 培养瓶进行胰酶消化，轻轻敲击培养瓶以帮助细胞脱离。
    注：必要时可将培养瓶放回 37 °C 培养箱中孵育 1–3 分钟。
    1. 待细胞完全脱离后，加入 9 mL EC 培养基中和胰酶（培养基与胰酶体积比为 3:1）。将细胞悬液转移至锥形管中，合并收集，充分混匀，取 10 µL 滴加至血细胞计数板以测定细胞数量。
      1. 计数 5 × 5 个方格（即 60 个大方格）内的细胞数，乘以 10,000 得到每毫升细胞悬液中的细胞数（600,000）。再乘以 12 mL（细胞悬液总体积），得到 EC 总数为 720 万。确保有足够的 EC 用于接种目标孔数。
        注：每孔约需 360,000 个 EC。例如，18 孔共需 648 万个 EC。将所需细胞总数 648 万除以每毫升含 60 万个 EC，得出需 10.8 mL 细胞悬液。再计算最终所需体积（18 孔 × 1 mL = 18 mL）。因此，取 10.8 mL 细胞悬液，用预热的 EC 培养基补足至 18 mL，并轻轻重悬。
  10. 将含 360,000 个 EC 的 1 mL 细胞悬液接种至每个插件滤膜的上表面。将细胞在 37 °C 静置培养 24 小时。第 4 天更换培养基，第 5 天收获细胞。

2. 从VCCC收集组分

  1. 在 4 °C 环境中进行分离操作，并将所有仪器保持在冰上。
  2. 注意正在分离的独立插入物数量，向已标记为 MEJ 的 50 mL 离心管中加入裂解缓冲液（用于分离的滤膜）。然后标记两个 10 mm 培养皿，一个用于内皮细胞（EC），另一个用于平滑肌细胞（SMC）。
  3. 根据所需裂解液的浓度调整裂解缓冲液体积；对于 15 个插入物，建议 MEJ 管中加入 500 µL 裂解缓冲液，每个培养皿中加入 250 µL。
  4. 每次处理一个 6 孔板的插入物。在细胞培养罩中吸除培养基，然后将板置于冰上转移至低温室。
    注意：以下说明适用于单个插入物的分离。
  5. 用移液器将 10 µL 的 1× PBS 加到插入物的 SMC 侧。
  6. 使用细胞刮刀将细胞刮至插入物的一端，并将刮下的细胞从刮刀转移至含有裂解缓冲液的 SMC 培养皿中。
  7. 一旦细胞刮刀接触了培养皿中的裂解缓冲液，除非已在纸巾上彻底擦拭并干燥，否则不得再次接触插入物滤膜。重复刮取 SMC 滤膜至少一到两次，以完全去除残留的 SMC 细胞碎片。
  8. 将插入物翻转，用移液器向插入物滤膜的上层/EC 侧加入 10 µL 的 1× PBS。使用细胞刮刀和 EC 培养皿重复步骤 2.6 和 2.7。
  9. 用移液器收集滤膜 EC 侧残留的细胞和 PBS 悬液，并转移至含有裂解缓冲液的 EC 培养皿中。在刮取滤膜两侧细胞时务必彻底，以尽量减少 EC/SMC 污染进入 MEJ 组分。
  10. 小心使用手术刀将滤膜从塑料插入物上切割下来。先切割掉约 70–80% 的塑料部分，再用镊子将滤膜完全从塑料结构上剥离。将滤膜放入标记为 MEJ 并含有裂解缓冲液的 50 mL 离心管中，确保其浸没在裂解缓冲液中并保持湿润。
  11. 以每组 6 个为单位重复分离步骤，直至处理完所有插入物。
  12. 确保不同处理组分别存放于不同的离心管和培养皿中。
  13. 将 50 mL MEJ 离心管在最大强度下涡旋震荡 15 秒，或直至充分混匀。用镊子从 MEJ 离心管中取出滤膜，沿管壁拖动以尽可能多地保留蛋白质和液体在管内。此后丢弃滤膜。
  14. 当所有滤膜均从 MEJ 离心管中移除后，在离心机中快速离心（最高速约 16,000 × g，10–15 秒），使所有液体和蛋白质沉至管底。将 MEJ 管、EC 和 SMC 培养皿中的内容物分别转移至独立的小型离心管中。
  15. 可选步骤：将 MEJ/SMC/EC 管中的内容物置于冰上，设置为 4 档，进行三次、每次 10 秒的超声处理，或手动轻轻匀浆。
  16. 在 4 °C 条件下以最高速（约 16,000 × g）离心 15 分钟。吸取上清液，使用二辛可宁酸法（bicinchoninic assay method）测定裂解液的蛋白含量。

3. 收集 VCCC 用于 En Face 免疫荧光染色

  1. 在VCCC培养的第5天，将插入物从培养箱中取出。在细胞培养罩内操作，吸出插入物滤膜下室的SMC培养基，并用1×PBS冲洗两次。对EC侧重复相同操作。
  2. 保持插入物完整并置于孔板中，在4 °C房间内轻轻摇动条件下加入4%多聚甲醛（PFA）固定10–20分钟。用1×PBS洗涤滤膜两侧，每次5分钟，重复两次。
    注意：PFA具有毒性，操作时须格外小心。
  3. 在孔板中进行封闭、一抗和二抗孵育，确保滤膜两侧均浸没于抗体与封闭液中（9 mL PBS、25 µL Triton X100、50 mg牛血清白蛋白、500 µL正常血清）。
  4. 将滤膜安装至载玻片时，使用装有刀柄的解剖刀将滤膜从塑料插入物中切下，并将其置于含封片剂的显微镜载玻片上。

4. 横向免疫荧光染色用VCCC的收获

  1. 在VCCC培养的第5天，从培养箱中取出小室。在细胞培养罩内用移液器吸去小室滤膜两侧的培养基，并用1×PBS将滤膜两侧各冲洗两次。
  2. 保持小室完整并置于6孔板中，加入4% PFA，在4 °C房间内的温和摇床上4 °C过夜孵育。
    注意：PFA具有毒性，必须小心操作。

5. 横向免疫荧光染色用VCCC包埋

  1. 将滤膜插入物用4%多聚甲醛固定约24小时后，转移至70%乙醇中保存至少24小时，可保存数周。
  2. 在自动组织脱水机上对滤膜进行长时间（过夜）处理。程序如下：70%乙醇30分钟，85%乙醇30分钟，95%乙醇30分钟，100%乙醇30分钟，100%乙醇45分钟，100%乙醇45分钟，二甲苯30分钟，二甲苯30分钟，二甲苯45分钟，60 °C石蜡30分钟，60 °C石蜡30分钟，60 °C石蜡45分钟。
  3. 处理完成后，将收获的滤膜转移至包埋站的液态石蜡中，保持滤膜处于包埋盒内。
  4. 用镊子小心夹住滤膜边缘，将其从包埋盒中取出。使用剪刀将滤膜切成两半，形成两个半圆形部分。将每半个滤膜放置在包埋站的冷台部分，仅停留足够短的时间以填充包埋模具中的液态石蜡。
  5. 填充液态石蜡后，将包埋模具在冷台上短暂接触一下，然后将滤膜的每一半（切面朝下）嵌入包埋模具中；这可确保在切片时从滤膜中心向边缘进行切割。
  6. 包埋过程中，使用镊子固定滤膜位置，防止两半滤膜在石蜡冷却至足够支撑其自身之前相互倾倒。将包埋模具移至冷台直至完全凝固。
    注意：使用冰盒上的冷却块有助于防止切片出现皱褶。

6. 横向免疫荧光染色用VCCC切片与染色

  1. 进行石蜡包埋组织切片和载玻片贴附：切取5 µm厚的切片，将切片放入42 °C水浴中展平，用带正电荷的载玻片捞取切片。然后将载玻片置于42 °C烘箱中过夜干燥。
  2. 开始复水步骤前，先将载玻片在60 °C下烘烤以熔化石蜡，并帮助VCCC切片牢固附着于载玻片上。短暂冷却后，依次通过两次二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、一次70%乙醇以及两次蒸馏水进行复水处理。
  3. 避免使用微波或加热方式进行抗原修复，以免切片从载玻片上脱落。
  4. 室温下进行标准封闭1小时，随后在4 °C下与一抗孵育过夜，接着进行洗涤步骤，并在室温下与二抗孵育1小时。最后用封片剂和盖玻片封片。

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结果

VCCC 所用的滤膜插件具有较小的 0.4 µm 孔 图1A，一个 正面 VCCC滤膜插件的视图，显示了MEJ可形成的孔隙 体外示意图显示，在内皮细胞接种于滤膜对侧的前一天，平滑肌细胞已接种于滤膜的下侧。图1B）。细胞铺板后，可在三天后分离EC、MEJ和SMC组分。示例如下所示 图2A，其中纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）在MEJ组分中的表达显著高于内皮细胞其他部分，这一现象也在 体内 MEJs25这些数据表明，血管腔内皮细胞培养装置（VCCC）在模拟完整的小动脉血管壁方面具有实用价值。

接下来展示了免疫荧光和电子显微镜下的血管周心室脉络丛复合体（VCCC）。VCCC保持...

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讨论

VCCC 在重现 MEJ 方面具有多项优势 体外，但在确定VCCC是否可用于特定应用时，仍有一些需要讨论的方面。例如，若该模型需使用不同类型的细胞，则需要进行优化。我们曾使用原代人源细胞，但也有可能从牛主动脉中分离细胞24，或野生型或基因敲除小鼠，并将其用于VCCC1,5,14.

若使用VCCC进行MEJ分离，最关键的技术是彻底刮取滤膜，以确保MEJ组分的纯度不受过量内皮细胞或平滑肌细胞的影响。我们通过Western blotting证实，α-血红蛋白是MEJ组分最理想的标志物 "纯的" MEJ 分离13，因为它在MEJ组分中的表达应明显强于内皮细胞组分。另一个是PAI-1，它可调控MEJ的形成（图2)

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了美国国家心肺血液研究所基金R01088554、T32HL007284以及美国心脏协会博士前奖学金14PRE20420024的支持。我们特别感谢圣犹大细胞成像共享研究中心，包括Randall Wakefield和Linda Horner提供的电子显微镜图像，Adam Straub在代表性免疫荧光图像方面的协助， 以及Pooneh Bagher对本手稿方案提出的宝贵意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24 mm 直径，0.4 µm Transwell 聚酯膜滤器插件Corning3450此为一整块6孔板用插件
225 cm 培养瓶Corning431082
6 孔板（不含滤器插件）Corning3506
原代人冠状动脉内皮细胞LonzaCC-2585
原代人冠状动脉平滑肌细胞LonzaCC-2583
EBM-2 EC 基础培养基LonzaCC-3156
EC 生长因子（EGM2 MV SingleQuots）LonzaCC-4147使用前加入基础培养基中
SmBM SMC 基础培养基LonzaCC-3181
SMC 生长因子（SmGM-2 SingleQuot）LonzaCC-4149使用前加入基础培养基中
0.5% 胰蛋白酶-EDTA 10X 溶液Gibco15400-054用无菌 dPBS 稀释至 2X
血细胞计数板VWR15170-208
用于 SMC 接种的大培养皿（150 mm）Corning353025
牛明胶SigmaG-9382
人纤维连接蛋白Corning356008配制成 5µg/mL 的纤维连接蛋白溶液，-20°C 保存
10x Hanks 平衡盐溶液（HBSS）Gibco14065-056用无菌水稀释至 1x
10x Dulbecco 磷酸盐缓冲液（dPBS）Gibco14200-075用无菌水稀释至 1x
一次性弯头手术刀（30 mm 刃口）带手柄AmazonMDS15210
镊子Fisher17-467-201
细胞刮刀Corning3008
细胞刮铲BD Falcon353085
50 mL 圆底离心管Corning352070
10 mm 培养皿Falcon35-1008
RNeasy 小量试剂盒Qiagen74104
RNA 裂解试剂Qiagen79306
多聚甲醛Sigma158127用 dPBS 配制成 4% 溶液
70% 乙醇Fisher04-355-305
Cavicide 消毒剂Fisher131000
RIPA 蛋白裂解缓冲液SigmaR0278
超声破碎仪FisherModel 50
用于收集 EC/SMC 及免疫细胞化学的 1x PBSGibco10010023无需无菌
名称公司货号备注
包埋/切片/染色
石蜡FisherP31-500
自动组织处理仪ExcelsiorES
包埋台 + 冷却板LeicaHistoCore Arcadia
Tissue Tek Accu-Edge 切片机刀片VWR25608-961 或 25608-964
显微镜载玻片Thermo Fisher22-230-900
盖玻片Thermo Fisher12-548-5E
Prolong Gold 封片剂Thermo FisherP36931
名称公司货号备注
其他溶液**若溶液用于活细胞，请在无菌条件下操作所有步骤
无菌 dPBS将水高压灭菌以获得无菌水。使用无菌水配制 DPBS（450 mL 无菌水 : 50 mL 10X DPBS），混匀后经 0.2µm 滤膜过滤除菌。
最终浓度：1X
无菌 HBSS将水高压灭菌以获得无菌水。使用无菌水配制 HBSS（450 mL 无菌水 : 50 mL 10X HBSS），混匀后经 0.2µm 滤膜过滤除菌。
最终浓度：1X
纤维连接蛋白储备液用 50 mL 无菌水溶解纤维连接蛋白，分装成 1 mL 每份的储备液，冻存备用。
最终浓度：100µg/mL
用于包被 VCCC 平滑肌侧的纤维连接蛋白解冻一份储备液，将 1 mL 纤维连接蛋白（100µg/mL）加入 19 mL 1X HBSS 中，使终浓度为 5µg/mL。
最终浓度：5µg/mL
2x 胰蛋白酶-EDTA 溶液将 10X 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 用 1X dPBS 稀释至 2X（40 mL DPBS : 10 mL 10X 胰蛋白酶）。
最终浓度：2X
封闭/抗体溶液（9 mL 1X PBS，25 mL Triton X-100，50 mg 牛血清白蛋白，500 mL 正常血清）
用于包被 VCCC 内皮细胞侧的牛明胶将 0.5 g 牛明胶溶于 100 mL 蒸馏水中。首次使用前高压灭菌，室温保存。保持无菌条件。
最终浓度：0.50%
用于细胞收集的 1x PBS无需无菌

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