本文描述了一种阻力动脉的细胞培养模型，可用于解析内皮细胞、平滑肌细胞内或内皮细胞与平滑肌细胞之间（即肌内皮连接）的信号通路。利用该细胞培养模型，可选择性地应用激动剂或进行蛋白质分离、电子显微镜检测以及免疫荧光分析。
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本文内容
摘要
摘要
肌内皮连接（myoendothelial junction, MEJ）是小直径阻力动脉中一种独特的信号微区，具有特定蛋白质和信号通路的定位，可调控血管张力和血压。由于其为内皮细胞或平滑肌细胞的突起结构，且体积微小（平均面积约1 µm²），2），MEJ 难以独立研究。然而，我们已开发出一种称为血管细胞共培养（VCCC）的细胞培养模型，可用于 体外 MEJ形成、内皮细胞极化以及阻力动脉血管壁中信号蛋白和过程的解析。VCCC具有多种应用，可针对不同细胞类型进行调整。该模型由两种细胞组成，分别生长在具有0.4 µm孔径的滤膜的两侧 体外 MEJs 可以形成。本文描述了通过细胞铺板以及分离内皮细胞、MEJ 和平滑肌组分来构建 VCCC 的方法，这些组分随后可用于蛋白质提取或活性检测。带有完整细胞层的滤膜可进行固定、包埋和切片，用于免疫荧光分析。重要的是，该模型中的许多发现已在完整的阻力动脉中得到验证，凸显了其生理相关性。
引言
在小直径阻力动脉中，一层较薄的内弹性膜（IEL）将内皮细胞（EC）与平滑肌细胞（SMC）分隔开。这些细胞可通过该弹性基质上的小孔延伸突起，并通过缝隙连接通道形成直接的胞质连接1,2。这种独特的结构被称为肌内皮连接（MEJ）。MEJ是一种微小的细胞突起（大小约为0.5 µm × 0.5 µm，具体尺寸因血管床而异），主要由内皮细胞构成，但也可能起源于平滑肌细胞3,4。许多研究者已证实，在MEJ处选择性发生的信号转导网络极为复杂，使其成为内皮与平滑肌之间双向信号传递的重要部位5,6,7,8,9,10。
然而，在完整的动脉中对MEJ处的信号通路进行机制性解析十分困难。由于MEJ是一种细胞突起结构，目前尚无法从血管壁中分离出完整的活体（in vivo
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方案
1. VCCC 细胞铺板
- 在无菌条件下于 37 °C 培养大量 225 cm2 的内皮细胞（EC）和血管平滑肌细胞（SMC）培养瓶，直至细胞融合度达到 70–90%。确保使用的 EC 数量多于 SMC；若使用原代人源 EC 和 SMC，通常使用 3 瓶 EC 对应 1 瓶 SMC。
- 使用较低传代次数的原代细胞，且传代次数不得超过第 10 代。根据共培养的细胞类型选择培养基。对于原代人冠状动脉内皮细胞（EC），使用 EBM-2 内皮基础培养基并添加 EGM2 MV 生长因子；对于原代人冠状动脉平滑肌细胞（SMC），使用 SmBM 平滑肌基础培养基并添加 SmGM-2 生长因子。在用于培养细胞前，需将生长因子加入培养基中。
- 构建 VCCC 的第 1 天：用消毒剂（例如，Cavicide）喷洒大号（150 mm）培养皿及其盖子，并用纸巾或无绒布擦拭干净。随后用 70% 乙醇（EtOH）喷洒培养皿，并将其放入生物安全柜中晾干。
- 在无菌条件下打开滤膜插件板（见材料表），将纤连蛋白溶液涂布于插件的 SMC 侧（滤膜的底面）。将插件保留在配套的 6 孔板中，通过侧边缝隙加入纤连蛋白溶液至板底部，确保滤膜下半部分被完全覆盖（不超过 1 mL）。
- 在细胞培养柜中室温孵育 30 分钟后，取出插件，吸除多余液体，....
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结果
VCCC 所用的滤膜插件具有较小的 0.4 µm 孔 图1A，一个 正面 VCCC滤膜插件的视图，显示了MEJ可形成的孔隙 体外示意图显示，在内皮细胞接种于滤膜对侧的前一天，平滑肌细胞已接种于滤膜的下侧。图1B）。细胞铺板后，可在三天后分离EC、MEJ和SMC组分。示例如下所示 图2A，其中纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）在MEJ组分中的表达显著高于内皮细胞其他部分，这一现象也在 体内 MEJs25这些数据表明，血管腔内皮细胞培养装置（VCCC）在模拟完整的小动脉血管壁方面具有实用价值。
接下来展示了免疫荧光和电子显微镜下的血管周心室脉络丛复合体（VCCC）。VCCC保持.......
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讨论
VCCC 在重现 MEJ 方面具有多项优势 体外，但在确定VCCC是否可用于特定应用时，仍有一些需要讨论的方面。例如，若该模型需使用不同类型的细胞，则需要进行优化。我们曾使用原代人源细胞，但也有可能从牛主动脉中分离细胞24，或野生型或基因敲除小鼠，并将其用于VCCC1,5,14.
若使用VCCC进行MEJ分离，最关键的技术是彻底刮取滤膜，以确保MEJ组分的纯度不受过量内皮细胞或平滑肌细胞的影响。我们通过Western blotting证实，α-血红蛋白是MEJ组分最理想的标志物 "纯的" MEJ 分离13，因为它在MEJ组分中的表达应明显强于内皮细胞组分。另一个是PAI-1，它可调控MEJ的形成（图2)
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了美国国家心肺血液研究所基金R01088554、T32HL007284以及美国心脏协会博士前奖学金14PRE20420024的支持。我们特别感谢圣犹大细胞成像共享研究中心，包括Randall Wakefield和Linda Horner提供的电子显微镜图像，Adam Straub在代表性免疫荧光图像方面的协助， 以及Pooneh Bagher对本手稿方案提出的宝贵意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24 mm 直径，0.4 µm Transwell 聚酯膜滤器插件 | Corning | 3450 | 此为一整块6孔板用插件 |
| 225 cm 培养瓶 | Corning | 431082 | |
| 6 孔板（不含滤器插件） | Corning | 3506 | |
| 原代人冠状动脉内皮细胞 | Lonza | CC-2585 | |
| 原代人冠状动脉平滑肌细胞 | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC 基础培养基 | Lonza | CC-3156 | |
| EC 生长因子（EGM2 MV SingleQuots） | Lonza | CC-4147 | 使用前加入基础培养基中 |
| SmBM SMC 基础培养基 | Lonza | CC-3181 | |
| SMC 生长因子（SmGM-2 SingleQuot） | Lonza | CC-4149 | 使用前加入基础培养基中 |
| 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 10X 溶液 | Gibco | 15400-054 | 用无菌 dPBS 稀释至 2X |
| 血细胞计数板 | VWR | 15170-208 | |
| 用于 SMC 接种的大培养皿（150 mm） | Corning | 353025 | |
| 牛明胶 | Sigma | G-9382 | |
| 人纤维连接蛋白 | Corning | 356008 | 配制成 5µg/mL 的纤维连接蛋白溶液，-20°C 保存 |
| 10x Hanks 平衡盐溶液（HBSS） | Gibco | 14065-056 | 用无菌水稀释至 1x |
| 10x Dulbecco 磷酸盐缓冲液（dPBS） | Gibco | 14200-075 | 用无菌水稀释至 1x |
| 一次性弯头手术刀（30 mm 刃口）带手柄 | Amazon | MDS15210 | |
| 镊子 | Fisher | 17-467-201 | |
| 细胞刮刀 | Corning | 3008 | |
| 细胞刮铲 | BD Falcon | 353085 | |
| 50 mL 圆底离心管 | Corning | 352070 | |
| 10 mm 培养皿 | Falcon | 35-1008 | |
| RNeasy 小量试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| RNA 裂解试剂 | Qiagen | 79306 | |
| 多聚甲醛 | Sigma | 158127 | 用 dPBS 配制成 4% 溶液 |
| 70% 乙醇 | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide 消毒剂 | Fisher | 131000 | |
| RIPA 蛋白裂解缓冲液 | Sigma | R0278 | |
| 超声破碎仪 | Fisher | Model 50 | |
| 用于收集 EC/SMC 及免疫细胞化学的 1x PBS | Gibco | 10010023 | 无需无菌 |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 包埋/切片/染色 | |||
| 石蜡 | Fisher | P31-500 | |
| 自动组织处理仪 | Excelsior | ES | |
| 包埋台 + 冷却板 | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge 切片机刀片 | VWR | 25608-961 或 25608-964 | |
| 显微镜载玻片 | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| 盖玻片 | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold 封片剂 | Thermo Fisher | P36931 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 其他溶液 | **若溶液用于活细胞，请在无菌条件下操作所有步骤 | ||
| 无菌 dPBS | 将水高压灭菌以获得无菌水。使用无菌水配制 DPBS（450 mL 无菌水 : 50 mL 10X DPBS），混匀后经 0.2µm 滤膜过滤除菌。 最终浓度：1X | ||
| 无菌 HBSS | 将水高压灭菌以获得无菌水。使用无菌水配制 HBSS（450 mL 无菌水 : 50 mL 10X HBSS），混匀后经 0.2µm 滤膜过滤除菌。 最终浓度：1X | ||
| 纤维连接蛋白储备液 | 用 50 mL 无菌水溶解纤维连接蛋白，分装成 1 mL 每份的储备液，冻存备用。 最终浓度：100µg/mL | ||
| 用于包被 VCCC 平滑肌侧的纤维连接蛋白 | 解冻一份储备液，将 1 mL 纤维连接蛋白（100µg/mL）加入 19 mL 1X HBSS 中，使终浓度为 5µg/mL。 最终浓度：5µg/mL | ||
| 2x 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | 将 10X 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 用 1X dPBS 稀释至 2X（40 mL DPBS : 10 mL 10X 胰蛋白酶）。 最终浓度：2X | ||
| 封闭/抗体溶液 | （9 mL 1X PBS，25 mL Triton X-100，50 mg 牛血清白蛋白，500 mL 正常血清） | ||
| 用于包被 VCCC 内皮细胞侧的牛明胶 | 将 0.5 g 牛明胶溶于 100 mL 蒸馏水中。首次使用前高压灭菌，室温保存。保持无菌条件。 最终浓度：0.50% | ||
| 用于细胞收集的 1x PBS | 无需无菌 |
参考文献
- Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
- Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endot....
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