基于微球的多重检测法用于分析泪液细胞因子谱

摘要

泪膜细胞因子分析有助于研究多种眼部疾病。基于微球的多重检测方法操作简便、灵敏度高，能够在少量样本中同时检测多个靶标。本文介绍了一种利用基于微球的多重检测技术进行泪膜细胞因子谱分析的实验方案。

摘要

泪膜是由覆盖在眼球外表面的脂质、蛋白质和矿物质组成的复杂混合物，可为下方细胞提供润滑、营养和保护。泪液分析是识别多种眼表疾病生物标志物以进行预测、诊断和预后的新兴研究领域。泪液易于获取，且采集过程无创。因此，随着技术的进步，越来越多的研究致力于在泪液中鉴定多种分析物，以研究蛋白质或代谢物组成的变化及其与病理状态的关联。泪液中的细胞因子是研究眼表健康状况的理想生物标志物，也有助于理解干眼症和春季性结膜炎等不同类型眼表疾病的发生机制。基于微球的多重检测技术能够在少量样本中高灵敏度地同时检测多种分析物。本文介绍了一种标准化的泪液样本采集、提取及利用基于微球的多重检测方法进行细胞因子谱分析的实验方案。

引言

泪液由泪腺和副泪腺产生，覆盖在眼球的外表面。泪膜由外层的脂质层和内层的水样层组成，其中水样层包含可溶性蛋白质、黏蛋白以及膜结合型黏蛋白。泪液可防止微生物侵袭、提供营养，并为眼表提供润滑作用。泪液还在空气与组织之间形成界面，促进氧气向角膜的传输。¹ 泪膜的成分包括蛋白质、碳水化合物、脂质和电解质。多项研究已发现，泪液蛋白质与青光眼、干眼症、春季结膜炎、糖尿病、甲状腺相关性眼病及癌症等眼部和全身性疾病之间存在关联。^2,3,4 泪液样本可通过微毛细管或泪液采集条（Schirmer条）收集。此外，Schirmer试验是角膜与屈光手术门诊中的常规检查方法，其结果可用于细胞因子分析实验。由于泪液样本采集无创、生物样本易于获取，且泪液成分与多种生理和病理状态密切相关，因此泪膜被认为是多种眼部和全身性疾病的潜在生物标志物来源。^4,5,6

泪液细胞因子在研究眼表健康及各种眼病的炎症状态中起着重要作用。⁷ 已有报道指出，泪液样本中多....

方案

本研究中使用的方案已获得新加坡陈笃生医院机构审查委员会的批准。

1. 泪液细胞因子分析

1. 泪液采集：
   1. 让受试者舒适地坐在检查椅上，并将头部靠在头托上。
   2. 让受试者向上看，小心打开Schirmer试纸条（由Whatman 41号滤纸制成），将试纸条的圆端置于眼睑下方穹窿处，并指示受试者闭眼5分钟。在采集泪液时，应尽量减少对眼表的接触。³⁰
   3. 让受试者睁开眼睛，取出试纸条并将其放入无菌的1.5 mL微量离心管中。立即将该管转移至实验室，或在检测细胞因子谱型前于-80^o C保存。
2. 从泪液试纸条中洗脱泪液样本：
   1. 将泪液试纸条剪成0.5 cm长度（以标准化待测泪液量），并放入无菌的1.5 mL微量离心管中。
   2. 加入30 µL分析缓冲液，在室温下孵育5分钟，随后以14,000 × g离心1分钟。
   3. 将上清液转移至另一支1.5 mL微量离心管中，并丢弃试纸条。将含样本的管置于冰上，立即用于细胞因子谱型分析。
3. 试剂准备：
   注：每个样本通过基于微球的多重检测法测定的41....

结果

使用泪液流量试纸从4名健康男性受试者的8只眼睛中采集泪液样本，并采用上述方案分析细胞因子水平。4名受试者的年龄分别为36岁、42岁、44岁和52岁。根据2007年国际干眼研讨会（International Dry Eye Workshop）指南，通过临床检查（包括泪膜破裂时间、Schirmer试验、角膜染色、结膜染色、眼睑/睑板腺检查、角膜泪液征象以及视觉症状和体征）评估眼表健康状况及干眼病情况，所有受试者均未表现出任何干眼病的体征或症状。³¹

在分析的41种细胞因子中，有31种细胞因子在所有泪液样本中均被检测到；IL-17A、MIP-1β和TNF-α在4名受试者的7只眼中被检测到；IL-4在4名受试者的6只眼中被检测到；IFN-γ在3名受试者的6只眼中被检测到；IL-1A在3名受试者的5只眼中被检测到；eotaxin和IL-9在2名受试者的3只眼中被检测到；IL-3在1只眼中被检测到，而MIP-1α在任.......

讨论

细胞因子是一类由细胞分泌的小分子蛋白质，具有强大的免疫调节功能，可调控免疫反应。³² 泪液样本中多种细胞因子的表达谱与眼部多种病理状态相关，对细胞因子谱的研究有助于理解疾病发病机制、判断眼表健康状况、疾病严重程度、诊断及进展过程。^2,5 传统方法面临的主要挑战是蛋白浓度较低和样本体积较小，这限制了ELISA等检测方法在泪液细胞因子谱分析中的应用。³³ 基于微球的多重检测技术是一种免疫分析方法，相较于ELISA具有显著优势。该技术仅需少量样本即可同时分析多种分析物，且灵敏度高，能够检测生物液体中皮克水平的蛋白质浓度。³⁴

本文报道了一种利用基于微球的多重检测技术对健康人泪液中41种细胞因子进行定量分析的标准化方案。在该检测面板包含的41种细胞因子中，基于微球的多重检测技术可在泪液样本中检测到40种，而未能检测到MIP-1α。该.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Milliplex MAP 人细胞因子/趋化因子磁珠面板-1 试剂盒	美国默克公司	HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D Luminex 仪器	Luminex Corp，美国德克萨斯州奥斯汀
xPonent 软件	Luminex Corp，美国德克萨斯州奥斯汀
RBXGenerator 软件	BIO-RAD，法国
Bio-Plex Manager 6.1	BIO-RAD，法国
平板振荡器	美国康宁公司
帝肯酶标洗板机	Tecan，瑞士	HydroSpeed
Vortex Genie 2	美国 Scientific Industries 公司	G560E
移液器	Mettler Toledo，加利福尼亚州，美国
1.5 ml 微量离心管	Axygen，美国	MCT-150-C
Schirmer 泪液分泌试验试纸条	眼科护理与治疗，美国	101657
Flexmap 3D 校准试剂盒	Luminex Corp，美国德克萨斯州奥斯汀	40-028
Flexmap 3D 验证试剂盒	Luminex Corp，美国德克萨斯州奥斯汀	40-029
眼科检查椅