我们描述了一种利用紫外光介导的光交联和质谱技术在活细胞中鉴定RNA结合蛋白并绘制其RNA结合区域的实验方案。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
非编码RNA在多种细胞核过程中发挥重要作用，包括调控基因表达、染色质结构以及DNA修复。在大多数情况下，非编码RNA的作用由蛋白质介导，而这些蛋白质的功能又受到其与非编码RNA相互作用的调控。与此一致的是，已有越来越多参与细胞核功能的蛋白质被发现能够结合RNA，其中少数蛋白质的RNA结合区域已被定位，通常通过耗时且基于候选基因的方法实现。
本文报道了一种高通量、全蛋白组范围内无偏见鉴定RNA结合蛋白及其RNA结合区域的详细实验方案。该方法依赖于将光反应性尿苷类似物掺入细胞RNA中，随后通过紫外光介导的蛋白质-RNA交联，再结合质谱分析，以鉴定蛋白组中与RNA交联的肽段。尽管本方案以小鼠胚胎干细胞为例进行描述，但该流程可轻松适用于多种培养细胞。
引言
RBR-ID 方法的目的是鉴定新的 RNA 结合蛋白（RBPs），并在肽段水平上绘制其 RNA 结合区域（RBRs），以促进 RNA 结合突变体的设计以及对蛋白质-RNA 相互作用的生物学和生物化学功能的研究。
在生物分子中，RNA具有独特性，因为它既能作为传递遗传信息的信使，又能折叠成复杂的三维结构，发挥类似于蛋白质的生化功能1,2。越来越多的证据表明，非编码RNA（ncRNA）在多种基因调控和表观遗传通路中发挥重要作用3,4,5，而这些调控功能通常由与特定RNA相互作用的蛋白质协同介导。尤其值得关注的是，近期已鉴定出一组与被广泛研究的长链非编码RNA（lncRNA）Xist相互作用的蛋白质，这为理解该lncRNA如何在雌性细胞中介导X染色体失活提供了重要线索6,7,8。值得注意的是，其中多个与Xist相互作用的蛋白质并不含有任何经典的RNA结合结构域9....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 小鼠胚胎干细胞的培养与扩增
注意：小鼠胚胎干细胞易于培养，且由于其快速的细胞周期，可迅速扩增至生化实验所需的大数量。健康的小鼠胚胎干细胞每12小时数量翻倍。
- 在37 °C、5% CO₂的组织培养孵箱中，使用mESC培养基（见下文）于明胶包被的培养板上将mESCs扩增至所需数量2，以及 >95% 湿度
注意：应为 +4SU 样本和 -4SU 对照组准备足够数量的培养板，以满足 3 - 5 次生物学重复的需要。每组使用一块 10 cm 培养板（即 5 × 10⁶ 至 1 × 10⁷ 个细胞）已足以满足每个生物学重复的需求。 - mESCs 培养基由添加了15%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、0.5×青霉素/链霉素、1×非必需氨基酸、100 µM β-巯基乙醇、1,000 U/mL 白血病抑制因子（LIF）、3 µM CHIR99021 和 1 µM PD0325901 的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）组成。
- 在传代mESCs之前，准备好所需数量的10 cm培养皿。
- 加入4 mL 0.1%明胶水溶液，确保完全覆盖培养板表面；室温（RT）孵育10分钟；弃去明胶溶液。
- 当细胞数量达到每块培养板约1000万个时进行传代，通常....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
图1展示了RBR-ID的工作流程。由于该技术的交联效率相对较低，因此在生物学重复样本中，必须同时考虑观察到的效应的耗竭程度及其一致性（P-值）。图2显示了RBR-ID结果的火山图。位于RNA识别基序（RRM）结构域重叠区域的肽段表现出高度一致的耗竭水平。RRM结构域可作为RBR-ID分析的阳性对照。
RBR-ID 可用于在活细胞中定位 RBRs。可通过计算每个肽段的 RBR-ID 评分来估计其 RNA 结合潜力：RBR-ID 评分 = -log2(标准化的 +4SU 强度 / 标准化的 -4SU 强度) × (log10(P-值))2。图3展示了将 .......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
我们描述了一种在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中进行RBR-ID的详细实验方案，并可通过适当修改应用于任何能够将4SU掺入RNA的细胞。其他细胞类型可能需要对该方法进行优化，以确保足够的信噪比。此外，尽管本方案重点研究核内RNA结合蛋白（RBPs），但通过采用不同的细胞组分分离策略，RBR-ID技术可轻松适用于其他细胞区室，例如细胞质或特定细胞器。可能需要优化的参数包括4SU浓度和掺入时间，以及紫外交联的能量。这些参数对于高效形成RNA-蛋白质交联并获得满意的信噪比至关重要。我们已证明，与PAR-CLIP中通常使用的365 nm UVA相比，312 nm UVB在将含4SU的RNA与蛋白质交联方面效率显著更高32。使用312 nm与365 nm进行的RBR-ID直接比较表明，312 nm UVB能够鉴定出更大比例的已知RNA结合蛋白24。
目前还有另外两种可用于全蛋白质组范围RNA结合蛋白（RBP）鉴定的方法。其中一种称为RBDmap，与RBR-ID类似，均利用紫外线交联和质谱分析技术。R.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
R.B. 获得了Searle学者项目、W.W. Smith基金会（C1404）以及March of Dimes基金会（1-FY-15-344）的支持。B.A.G. 感谢美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01GM110174和NIH R01AI118891，以及美国国防部（DOD）资助项目BC123187P1的支持。R.W.-T. 获得了美国国立卫生研究院（NIH）培训资助项目T32GM008216的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| KnockOut DMEM | 赛默飞世尔科技 | 10829018 | |
| 胎牛血清，经鉴定，美国来源 | 赛默飞世尔科技 | 26140079 | |
| L-谷氨酰胺溶液 200 mM | 西格玛 | G7513 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | 西格玛 | P0781 | |
| MEM 非必需氨基酸溶液 (100×) | 西格玛 | M7145 | |
| 2-巯基乙醇 | 西格玛 | M3148 | |
| ESGRO 白血病抑制因子 (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | 西格玛 | PZ0162 | |
| 明胶溶液，2% 水溶液 | 西格玛 | G1393 | |
| 4-硫尿苷 | 西格玛 | T4509 | 50 mM 储存液，溶于水 |
| Spectrolinker XL-1500 | 赛默飞世尔科技 | 11-992-90 | |
| 苯甲基磺酰氟 | 西格玛 | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | 西格玛 | 542334 | 辛基苯氧基聚乙氧基乙醇去垢剂的商用形式 |
| 碘乙酰胺 | 西格玛 | I6125 | |
| 胰蛋白酶，测序级 | Promega | V5111 | |
| Empore 固相萃取盘 | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 反相树脂 | 赛默飞世尔科技 | 1133903 | |
| 苯并核酸酶 | 西格玛 | E8263 | 高纯度核酸酶 |
| Sonic Dismembrator Model 100 | 赛默飞世尔科技 | 已停产 | 已更新为 FB505110 |
| 高效液相色谱级乙腈 | 费希尔化学 | A955-4 | |
| 高效液相色谱级水 | 赛默飞世尔科技 | W6 4 | |
| 三氟乙酸 | 赛默飞世尔科技 | A11650 | |
| 碳酸氢铵 | 西格玛 | A6141 | |
| 乙酸 | 西格玛 | 49199 | |
| 甲酸 | 西格玛 | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | HPLC 色谱柱填料 |
| 纳米色谱柱毛细管 (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant 软件 | 马克斯·普朗克生物化学研究所 | 可对多次质谱运行数据进行色谱对齐 |
参考文献
- Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
- Rinn, J. L., Chang,....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
