我们描述了一种利用紫外光介导的光交联和质谱技术在活细胞中鉴定RNA结合蛋白并绘制其RNA结合区域的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
非编码RNA在多种细胞核过程中发挥重要作用，包括调控基因表达、染色质结构以及DNA修复。在大多数情况下，非编码RNA的作用由蛋白质介导，而这些蛋白质的功能又受到其与非编码RNA相互作用的调控。与此一致的是，已有越来越多参与细胞核功能的蛋白质被发现能够结合RNA，其中少数蛋白质的RNA结合区域已被定位，通常通过耗时且基于候选基因的方法实现。
本文报道了一种高通量、全蛋白组范围内无偏见鉴定RNA结合蛋白及其RNA结合区域的详细实验方案。该方法依赖于将光反应性尿苷类似物掺入细胞RNA中，随后通过紫外光介导的蛋白质-RNA交联，再结合质谱分析，以鉴定蛋白组中与RNA交联的肽段。尽管本方案以小鼠胚胎干细胞为例进行描述，但该流程可轻松适用于多种培养细胞。
引言
RBR-ID 方法的目的是鉴定新的 RNA 结合蛋白（RBPs），并在肽段水平上绘制其 RNA 结合区域（RBRs），以促进 RNA 结合突变体的设计以及对蛋白质-RNA 相互作用的生物学和生物化学功能的研究。
在生物分子中，RNA具有独特性，因为它既能作为传递遗传信息的信使，又能折叠成复杂的三维结构，发挥类似于蛋白质的生化功能1,2。越来越多的证据表明，非编码RNA（ncRNA）在多种基因调控和表观遗传通路中发挥重要作用3,4,5，而这些调控功能通常由与特定RNA相互作用的蛋白质协同介导。尤其值得关注的是，近期已鉴定出一组与被广泛研究的长链非编码RNA（lncRNA）Xist相互作用的蛋白质，这为理解该lncRNA如何在雌性细胞中介导X染色体失活提供了重要线索6,7,8。值得注意的是，其中多个与Xist相互作用的蛋白质并不含有任何经典的RNA结合结构域9，因此仅基于其一级序列无法通过in silico方法预测其RNA结合活性。考虑到在任意特定细胞中表达的lncRNA可达数千种10，可以合理推测其中许多lncRNA可能通过与尚未发现的RNA结合蛋白（RBPs）相互作用来发挥功能。因此，开发一种实验策略以鉴定这些新型RBPs，将极大促进解析ncRNA生物学功能的研究工作。
先前通过实验手段鉴定RNA结合蛋白（RBPs）的方法主要依赖于多聚腺苷酸化RNA（polyA+ RNA）的筛选，并结合质谱分析（MS）11,12,13,14,15。尽管这些实验将大量蛋白质新增至潜在RBPs列表中，但其设计本身仅能检测与多聚腺苷酸化转录本结合的蛋白质。然而，大多数小RNA以及许多长链非编码RNA（lncRNA）并不具有多聚腺苷酸化修饰16,17，因此与这些RNA相互作用的蛋白质很可能在上述实验中被遗漏。最近一项研究利用机器学习方法分析蛋白质-蛋白质相互作用组数据库，识别出能与多个已知RBPs共纯化的蛋白质，并发现这些频繁出现的RBP互作伙伴更可能具有RNA结合活性18。然而，该方法依赖于对现有大规模相互作用数据库的挖掘，仅能识别那些可在非变性条件下与已知RBPs共纯化的蛋白质，因而无法涵盖不溶性蛋白、膜整合蛋白以及丰度极低的蛋白质。
将一种蛋白质鉴定为 真正有效的 RBP 通常不会自动提供有关蛋白质-RNA 相互作用的生物学和/或生物化学功能的信息。为解决这一问题，通常需要鉴定参与相互作用的蛋白质结构域及氨基酸残基，以便设计特定突变体，用于在每种新发现的 RBP 背景下验证 RNA 结合功能的作用19,20此前，我们课题组及其他研究团队利用重组蛋白片段和缺失突变体来鉴定RNA结合区域（RBRs）19,20,21,22；然而，此类方法耗时耗力，且难以适用于高通量分析。最近，一项研究报道了一种利用质谱技术以高通量方式绘制RNA结合活性的实验策略23然而，该方法依赖于两次polyA+ RNA筛选，因此具有与上述RBP鉴定方法相同的局限性。
我们开发了一种称为RNA结合区域鉴定（RNA binding region identification, RBR-ID）的技术，该技术利用蛋白质-RNA光交联和定量质谱法，在活细胞中鉴定与RNA相互作用的蛋白质及蛋白质区域，且无需假设RNA的多聚腺苷酸化状态，因此可包含结合于非多聚腺苷酸化RNA（polyA- RNA）的RNA结合蛋白24。此外，该方法完全依赖于交联，对蛋白质的溶解性或可及性无特殊要求，因此适用于绘制定位于膜结构（例如核膜）或难溶性区室（例如核基质）中的RNA结合活性。本文以小鼠胚胎干细胞（mESCs）的细胞核为例，描述了执行RBR-ID的实验步骤；但经过少量修改后，该方案应适用于多种细胞类型，前提是这些细胞能够有效从培养基中摄取4SU。
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方案
1. 小鼠胚胎干细胞的培养与扩增
注意：小鼠胚胎干细胞易于培养，且由于其快速的细胞周期，可迅速扩增至生化实验所需的大数量。健康的小鼠胚胎干细胞每12小时数量翻倍。
- 在37 °C、5% CO₂的组织培养孵箱中，使用mESC培养基（见下文）于明胶包被的培养板上将mESCs扩增至所需数量2，以及 >95% 湿度
注意：应为 +4SU 样本和 -4SU 对照组准备足够数量的培养板，以满足 3 - 5 次生物学重复的需要。每组使用一块 10 cm 培养板（即 5 × 10⁶ 至 1 × 10⁷ 个细胞）已足以满足每个生物学重复的需求。 - mESCs 培养基由添加了15%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、0.5×青霉素/链霉素、1×非必需氨基酸、100 µM β-巯基乙醇、1,000 U/mL 白血病抑制因子（LIF）、3 µM CHIR99021 和 1 µM PD0325901 的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）组成。
- 在传代mESCs之前，准备好所需数量的10 cm培养皿。
- 加入4 mL 0.1%明胶水溶液，确保完全覆盖培养板表面；室温（RT）孵育10分钟；弃去明胶溶液。
- 当细胞数量达到每块培养板约1000万个时进行传代，通常在接种后约48小时。
注意：由于小鼠胚胎干细胞（mESCs）以密集克隆形式生长，培养皿中的细胞不应达到100%汇合度，这与单层生长的细胞系不同。例如 HEK293 或 3T3 细胞）。当小鼠胚胎干细胞（mESC）培养皿中细胞融合度达到约 50% 时即应传代，且必须在培养基变黄之前完成。- 为分离细胞，用含2 mM EDTA的1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤长满小鼠胚胎干细胞（mESC）的培养板一次，随后加入溶于DMEM的0.05%胰蛋白酶，将培养板放回孵箱孵育5分钟（37 °C，5% CO₂）2，以及 >95% 湿度
- 从培养箱中取出培养板，用移液器反复吹打数次，加入等体积的DMEM重悬细胞。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并确保细胞呈单细胞悬液状态（即 无细胞团块），在室温下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1–2 mL DMEM中。
- 以每平方厘米10,000个细胞的密度接种细胞2 在mESC培养基中（即 每10 cm培养皿接种约800,000个细胞，使用步骤1.3.1中制备的明胶包被培养皿。
2. 活细胞中蛋白质–RNA 相互作用的交联
注意：RNA-蛋白质交联由光活化核糖核苷类似物4-硫代尿苷（4SU）介导。4SU的吸收峰波长比内源性核苷酸更长，且只能掺入RNA中；因此可使用中波长UVB选择性地交联RNA与蛋白质25,26。对经4SU处理的细胞进行UVB照射，可导致含4SU的RNA与氨基酸之间形成共价交联，据报道其优先交联的氨基酸为Tyr、Trp、Met、Lys和Cys27。
- 按照步骤1所述，将mESCs扩增至所需数量的10 cm培养皿。
注意：应准备足够数量的培养板，用于+4SU样本和-4SU对照组的3–5次生物学重复。每组使用一块10 cm培养板（即 每个生物学重复使用 500 万至 1000 万个细胞即可。 - 在培养皿中的细胞达到汇合之前，将4SU直接加入培养基中，使其终浓度为500 µM。-4SU对照组培养皿不做处理。
- 轻轻摇动培养板，使4SU在培养基中均匀分布。随后将培养板放回原组织培养孵育箱中孵育2小时（37 °C，5% CO₂）。2，以及 >95% 湿度
- 将培养板转移至装有冰的容器中，并弃去培养基。
- 用 5 mL 冰冷的 PBS 轻柔地冲洗平板。
注意：请轻柔冲洗，否则细胞可能脱落。 - 加入 2 mL 冰冷的 PBS，将无盖的培养板放入配备发射 UVB（312 nm）灯泡的交联仪中。以 1 J/cm² 的能量设置照射培养板2.
注意：必须移除塑料盖，否则它们可能会遮挡紫外线，从而阻碍细胞交联。 - 使用细胞刮刀收集细胞，并转移至含有预冷 PBS 的锥形管中。在 4 °C 条件下，以 2,000 x g 离心 5 分钟。
- 移去上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL预冷的含2 mM EDTA和0.2 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）的PBS中。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数。预期从10 cm和15 cm培养皿中分别获得500万至1000万和1000万至2000万个细胞。
- 在 4 °C 条件下，以 2,000 x g 离心 5 分钟。
注意：沉淀的细胞可立即用于步骤3，也可在液氮中速冻后于-80 °C长期保存。此处可作为潜在的暂停点。
3. 细胞核的分离
注意：分离细胞核可去除细胞质蛋白，从而增加核蛋白的覆盖度。此步骤可用其他形式的细胞分馏方法替代，以研究不同细胞区室中的RNA结合蛋白（RBPs）。
- 准备预冷的缓冲液 A（10 mM Tris-HCl pH 7.9，4 °C，1.5 mM MgCl2，10 mM KCl）。每 1000 万个细胞（按步骤 2.9 计数）至少使用 2.5 mL 缓冲液 A 进行提取。
注意：缓冲液 A 的储备液（例如 500 mL 瓶装）可预先配制，并在 4 °C 下保存 6 个月。- 使用前，在所需体积的预冷缓冲液 A（每 1000 万个细胞 2.5 mL）中加入 0.5 mM 二硫苏糖醇（DTT）和 0.2 mM PMSF。
- 每 1000 万个细胞使用 2 mL 缓冲液 A 洗涤细胞，在 4 °C 下以 2,500 × g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液，向每 1000 万个细胞加入 500 µL 含 0.2% 非离子性、非变性去污剂（如辛基苯氧基聚乙氧基乙醇，见材料表）的缓冲液 A，4 °C 下旋转孵育 5 分钟。
- 在 2,500 × g 下离心 5 分钟。
- 移除上清液，沉淀物为不含细胞质的完整细胞核。
注意：细胞核可立即用于步骤 4，或在液氮中速冻后长期保存于 -80 °C。此处可作为实验暂停点。
4. 细胞核裂解
注意：交联的细胞核在兼容质谱分析的缓冲液中裂解，以释放蛋白质和蛋白质-RNA复合物。
- 加入裂解缓冲液（9 M 尿素，100 mM Tris-HCl，pH 8.0，24 °C），每 1000 万个细胞加入 200 µL。使用 1/8" 探头，设置超声功率为 50%，超声处理 5–10 秒以剪切染色质。
- 在 12,000 × g 离心 5 分钟，收集上清液 175 µL，避免触及沉淀。
注意：下一步 RBR-ID 步骤将使用 100 µL 上清液，剩余的 75 µL 裂解物可储存于 -80 °C，用于后续实验和/或 Western 印迹分析。 - 通过 Bradford 法或类似方法测定蛋白浓度28。使用适量裂解缓冲液将不同样品的蛋白浓度稀释至 1 mg/mL 或最低样品浓度。
注意：来自 1000 万个 mESC 细胞核的蛋白产量预计为 100– 200 µg。
5. 胰蛋白酶消化
注意：蛋白质被消化以生成适用于自下而上质谱（MS）分析的肽段。
- 向核裂解液中加入DTT溶液（终浓度5 mM），在室温下孵育1小时。
- 加入新鲜配制的碘乙酰胺溶液（终浓度14 mM），避光室温孵育30分钟。
- 用5倍体积的50 mM NH4HCO3稀释裂解液。
- 加入胰蛋白酶（蛋白量 : 胰蛋白酶 = 200 : 1 µg : µg），37 °C过夜孵育。
6. 肽的脱盐
- 每个样品准备一个自制的层析小柱（stage tip）。
- 6.1.1. 将一片固相萃取C18材料置于200 µL移液枪头底部。
- 在C18圆盘上方加入50 µL寡核苷酸R3反相树脂。将层析小柱插入离心适配器中，并将带适配器的小柱放入1.5 mL微量离心管内。
- 向小柱中加入100 µL 100%乙腈进行洗涤。在1000 × g条件下离心1分钟，去除溶剂。
- 用50 µL 0.1%三氟乙酸（TFA）进行平衡。在1000 × g条件下离心1分钟。
- 向消化后的蛋白质样品中加入100%甲酸，将pH值调节至2–3。
注意：每1 mL稀释的肽段样品约需5 µL甲酸，但应测量pH值，并在必要时补充甲酸。 - 将样品加载到自制的层析小柱上，在1000 × g条件下离心1分钟，直至样品完全通过小柱。
- 用50 µL 0.1% TFA洗涤结合在柱上的肽段。在1000 × g条件下离心1分钟。
- 向层析小柱中加入50 µL洗脱缓冲液（75%乙腈，0.025% TFA）以洗脱肽段，并在1000 × g条件下离心1分钟，使洗脱缓冲液完全流出小柱。
- 使用真空离心浓缩仪在150 × g、1–3 kPa条件下干燥样品1小时。
注意：干燥后的肽段可在-80 °C长期保存。此步骤可作为实验暂停点。
7. 去除交联的 RNA
注意：用核酸酶处理肽以去除交联的 RNA。
- 用 50 µL 2× 核酸酶缓冲液（100 mM NH4HCO3，4 mM MgCl2）重悬沉淀。
- 假设肽的 A280 为 1 时浓度为 1 mg/mL，通过 280 nm 处的吸光度测定肽浓度。
注意：预期浓度为 1 mg/mL。 - 使用 2× 核酸酶缓冲液将所有样品调整至 1 mg/mL 或调整至最低浓度。
- 每份样品配制 50 µL H2O 加 1 µL 高纯度核酸酶（≥250 U）的主混合液（参见材料表）。
- 取 50 µL 肽样品，加入 50 µL H2O 与核酸酶主混合液。
- 在 37 °C 下孵育 1 小时。随后进行质谱分析。
注意：肽样品现已准备好用于质谱分析。可立即分析，也可无限期保存于 -80 °C。此步骤可作为潜在的暂停点。
8. 纳米液相色谱、质谱及原始数据处理
注意：由于4SU交联会改变肽段的质量，其离子在液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）中不计入非交联肽段的强度，因此非交联肽段的强度在交联后会显得降低。这种降低的程度和一致性反映了每个肽段发生蛋白质-RNA交联的程度24。
- 配制HPLC流动相如下：将0.1%甲酸溶于HPLC级水中（流动相A）；将0.1%甲酸溶于HPLC级乙腈中（流动相B）。
- 若具备纳米高效液相色谱仪（nano-HPLC），连接一根规格如下纳米柱：内径75 µm；填充C18-AQ颗粒；长度20 - 25 cm。
注意：若所用高效液相色谱仪支持较高流速，请根据指定流速选用合适尺寸的色谱柱。较高的流速会降低色谱分析的灵敏度。 - 将HPLC方法设置如下：流速250 - 300 nL/min；梯度洗脱程序为在120 min内缓冲液B从2%升至28%，随后5 min内从28%升至80%，接着以80%缓冲液B等度洗脱10 min。
注意：如果高效液相色谱仪在上样前不具备自动柱平衡功能，则应在上样前以0% B条件运行10分钟，再开始程序。 - 将质谱采集方法设置为数据依赖性采集（DDA），如同标准的鸟枪法蛋白质组学实验。仪器工作周期应交替进行全扫描质谱（MS）和最强信号的串联质谱（MS/MS）扫描。采用适用于蛋白质组学质谱运行的最优参数设置。
注意：为获得可靠结果，应使用能够以高分辨率模式至少完成全扫描质谱（full MS scan）的仪器例如 轨道阱，飞行时间）。为了实现准确的定量，需确保全扫描质谱（full MS scans）之间的时间间隔不超过3秒。过长的循环周期可能影响提取离子色谱图的准确定义。 - 将1 - 2 µg样品上样至HPLC色谱柱，按预设程序运行HPLC-MS/MS方法。每个生物学重复至少进行两次独立进样，并将其视为技术重复。
- 在质谱分析后，将原始文件导入蛋白质组学软件包，通过提取离子色谱法进行串联质谱（MS/MS）谱图鉴定和肽段定量。我们推荐能够对多次质谱运行数据进行色谱对齐的软件包（参见 材料表)29,30.
- 如果软件套件中提供此选项，则启用 "运行间匹配" 开始数据处理之前。
- 分析完成后，导出肽段列表及其定量值。
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结果
图1展示了RBR-ID的工作流程。由于该技术的交联效率相对较低，因此在生物学重复样本中，必须同时考虑观察到的效应的耗竭程度及其一致性（P-值）。图2显示了RBR-ID结果的火山图。位于RNA识别基序（RRM）结构域重叠区域的肽段表现出高度一致的耗竭水平。RRM结构域可作为RBR-ID分析的阳性对照。
RBR-ID 可用于在活细胞中定位 RBRs。可通过计算每个肽段的 RBR-ID 评分来估计其 RNA 结合潜力：RBR-ID 评分 = -log2(标准化的 +4SU 强度 / 标准化的 -4SU 强度) × (log10(P-值))2。图3展示了将 ...
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讨论
我们描述了一种在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中进行RBR-ID的详细实验方案，并可通过适当修改应用于任何能够将4SU掺入RNA的细胞。其他细胞类型可能需要对该方法进行优化，以确保足够的信噪比。此外，尽管本方案重点研究核内RNA结合蛋白（RBPs），但通过采用不同的细胞组分分离策略，RBR-ID技术可轻松适用于其他细胞区室，例如细胞质或特定细胞器。可能需要优化的参数包括4SU浓度和掺入时间，以及紫外交联的能量。这些参数对于高效形成RNA-蛋白质交联并获得满意的信噪比至关重要。我们已证明，与PAR-CLIP中通常使用的365 nm UVA相比，312 nm UVB在将含4SU的RNA与蛋白质交联方面效率显著更高32。使用312 nm与365 nm进行的RBR-ID直接比较表明，312 nm UVB能够鉴定出更大比例的已知RNA结合蛋白24。
目前还有另外两种可用于全蛋白质组范围RNA结合蛋白（RBP）鉴定的方法。其中一种称为RBDmap，与RBR-ID类似，均利用紫外线交联和质谱分析技术。R...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
R.B. 获得了Searle学者项目、W.W. Smith基金会（C1404）以及March of Dimes基金会（1-FY-15-344）的支持。B.A.G. 感谢美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01GM110174和NIH R01AI118891，以及美国国防部（DOD）资助项目BC123187P1的支持。R.W.-T. 获得了美国国立卫生研究院（NIH）培训资助项目T32GM008216的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| KnockOut DMEM | 赛默飞世尔科技 | 10829018 | |
| 胎牛血清，经鉴定，美国来源 | 赛默飞世尔科技 | 26140079 | |
| L-谷氨酰胺溶液 200 mM | 西格玛 | G7513 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | 西格玛 | P0781 | |
| MEM 非必需氨基酸溶液 (100×) | 西格玛 | M7145 | |
| 2-巯基乙醇 | 西格玛 | M3148 | |
| ESGRO 白血病抑制因子 (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | 西格玛 | PZ0162 | |
| 明胶溶液，2% 水溶液 | 西格玛 | G1393 | |
| 4-硫尿苷 | 西格玛 | T4509 | 50 mM 储存液，溶于水 |
| Spectrolinker XL-1500 | 赛默飞世尔科技 | 11-992-90 | |
| 苯甲基磺酰氟 | 西格玛 | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | 西格玛 | 542334 | 辛基苯氧基聚乙氧基乙醇去垢剂的商用形式 |
| 碘乙酰胺 | 西格玛 | I6125 | |
| 胰蛋白酶，测序级 | Promega | V5111 | |
| Empore 固相萃取盘 | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 反相树脂 | 赛默飞世尔科技 | 1133903 | |
| 苯并核酸酶 | 西格玛 | E8263 | 高纯度核酸酶 |
| Sonic Dismembrator Model 100 | 赛默飞世尔科技 | 已停产 | 已更新为 FB505110 |
| 高效液相色谱级乙腈 | 费希尔化学 | A955-4 | |
| 高效液相色谱级水 | 赛默飞世尔科技 | W6 4 | |
| 三氟乙酸 | 赛默飞世尔科技 | A11650 | |
| 碳酸氢铵 | 西格玛 | A6141 | |
| 乙酸 | 西格玛 | 49199 | |
| 甲酸 | 西格玛 | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | HPLC 色谱柱填料 |
| 纳米色谱柱毛细管 (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant 软件 | 马克斯·普朗克生物化学研究所 | 可对多次质谱运行数据进行色谱对齐 |
参考文献
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