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方法文章

在成年斑马鱼大脑中模拟淀粉样蛋白-β42 的毒性与神经退行性变

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DOI：

10.3791/56014

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2017年10月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1German Centre for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Dresden within Helmholtz Association, 2B CUBE, Center for Molecular Bioengineering, Technische Universität Dresden, 3Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD), TU Dresden

本文内容

摘要

本方案描述了单体淀粉样蛋白-β42肽的合成、表征及注射方法，用于在成年斑马鱼中诱导淀粉样蛋白毒性，建立阿尔茨海默病模型，随后进行组织学分析及聚集体检测。

摘要

阿尔茨海默病（AD）是一种严重的神经退行性疾病，其特征是毒性淀粉样蛋白-β42（Aβ42）肽的积累，导致突触退化、炎症反应、神经元死亡以及学习能力缺陷。在AD情况下，人类无法再生丢失的神经元，部分原因是神经干细胞/前体细胞（NSPCs）的增殖能力受损以及神经发生减少。因此，有效的再生疗法还应增强NSPCs的增殖能力和神经发生潜能。斑马鱼（Danio rerio）具有强大的再生能力，我们可以通过研究其基本的分子机制，设计出治疗AD的策略。基于此，建立一种类似AD的斑马鱼模型十分必要。利用我们的方法，可将具有组织穿透能力的Aβ42肽合成衍生物导入成年斑马鱼脑内，并分析疾病病理变化及再生反应。相较于现有方法或其他动物模型，该模型的优势在于斑马鱼能够揭示脊椎动物大脑如何自然再生，从而帮助我们通过靶向内源性NSPCs更好地治疗人类神经退行性疾病。因此，在成年斑马鱼脑内建立的淀粉样蛋白毒性模型可能为神经科学和临床医学领域的研究开辟新的途径。此外，该方法操作简便，可实现经济高效且高效的实验评估。本文描述了将Aβ42肽合成并注射入斑马鱼脑内的具体步骤。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种慢性进行性疾病，其特征是大脑皮层神经元和突触的丧失1,2,3,4,5。AD 的经典神经病理学标志是淀粉样肽的沉积以及神经纤维缠结（NFTs）的形成6。老年斑，也称为淀粉样斑块，由淀粉样蛋白-β（Aβ）肽组成，这些肽在脑实质中形成 β-折叠结构5。Aβ42 在 AD 患者体内的积聚在疾病进展中起着早期且关键的作用。AD 会引发一系列事件，导致突触功能障碍、可塑性受损以及神经元丢失7,8,9,10。

成年硬骨鱼类斑马鱼的大脑是研究干细胞可塑性调控11,12,13,14,15,16,17,18,19,20以及中枢神经系统（CNS）多种疾病的理想模型，包括阿尔茨海默病（AD）21,22,23,24。由于存在大量可用的实验方法19,20,25,26,27,28,29,30,31，这些研究具有重要的信息价值且切实可行。斑马鱼能够通过部分分子程序的激活来补充中枢神经系统13,15,32,33,34,35,36,37,38，这些程序在神经元丢失后被启动19,39,40,41,42,43,44。因此，在斑马鱼中建立神经退行性疾病模型有助于探索脊椎动物大脑中再生能力与干细胞生物学的新问题。

近期，我们通过向成年斑马鱼脑内注射合成的 Aβ42 肽段（表 1）39，建立了一种淀粉样蛋白毒性模型。该注射可引发类似人类脑部病理的神经退行性表型（例如，细胞死亡、小胶质细胞活化、突触退化以及记忆障碍），表明斑马鱼可用于诱导脑内神经退行性变，Aβ42 肽段可通过免疫组织化学染色进行检测，并可鉴定成年斑马鱼中枢神经系统（CNS）中再生的分子机制39。在本实验方案中，我们采用脑室注射法（CVMI）27,39,45,46，将合成的淀粉样蛋白肽段注入斑马鱼脑内，以模拟淀粉样蛋白沉积（图 1）。CVMI 提供了一种新型的肽段递送方式，这些肽段在注射后会形成 β-折叠结构并发生聚集，从而发挥毒性作用。肽段在脑内均匀分布，靶向整个头尾轴的脑室区域45。此外，该方法还可用于分析成年斑马鱼脑内神经干细胞和祖细胞（NSPCs）在淀粉样蛋白沉积后的形态学和分子学反应。此类研究将有助于我们理解哺乳动物脑修复成功的机制。我们的方法可用于阐明在出现类似阿尔茨海默病（AD）症状后，成功启动再生反应、补充丢失神经元并实现功能恢复所必需的分子机制。

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方案

本方案是根据欧盟指南（2010/63）以及卡尔斯鲁厄理工学院（KIT）欧洲生物与医学鱼类模型学会（EuFishBioMed）建议的标准操作程序。此后所述所有方法均已获得伦理委员会批准（德累斯顿地方管理局；文件编号 TVV-52/2015）。

1. Aβ42 肽的制备

  1. 使用标准的9-芴甲氧羰基（Fmoc）化学法，在自动化固相多肽合成仪上以2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）作为偶联试剂合成多肽（见表1）52。合成规模为100 µmol。
  2. 在自动化多肽合成仪中装入500 mg的Fmoc保护树脂作为固相载体（载样量为0.2 mmol/g）。根据各合成仪的要求，计算所需体积并加入浓度为0.5 M的溶解态Fmoc保护氨基酸。
    注：计算方式确保每种Fmoc保护氨基酸以五倍过量重复偶联两次至树脂上47。
  3. 将多肽合成所需的试剂溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中。例如，配制浓度为0.48 M的活化剂HBTU，45% v/v N-甲基吗啉（NMM）（碱），以及5% v/v乙酸酐（封端混合液），用于封端未反应的氨基。
  4. 在新鲜配制的裂解液中，通过搅拌装置持续混合固相载体，裂解所有多肽。裂解液组成为：三氟乙酸（TFA）: 三异丙基硅烷（TIS）: 水 : 二硫苏糖醇（DTT）= 90 (v/v) : 5 (v/v) : 2.5 (v/v) : 2.5 (m/v)，反应4小时。对于100 µmol的合成规模，使用10 mL裂解液。
  5. 将裂解液缓慢加入100 mL预冷的乙醚中以沉淀裂解产物。使用孔径为0.45 µm的聚四氟乙烯（PTFE）滤膜过滤装置过滤，并用20 mL预冷乙醚洗涤沉淀。
  6. 收集滤纸上的多肽沉淀，取100 mg沉淀多肽溶于5 mL体积比为1:1的去离子水与乙腈混合液中。
  7. 采用反相高效液相色谱法（HPLC），在配备粒径为10 µm的多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯色谱柱的半制备型HPLC系统上进行纯化。
    1. 使用柱温加热装置预热色谱柱，并保持柱温在50 °C。以4 mL/min的流速，在25分钟内采用5%至100%溶剂B的梯度洗脱，通过自动馏分收集器收集所有主要组分。
      注：溶剂A为含0.1% TFA的水溶液，溶剂B为含0.1% TFA的乙腈溶液52。
    2. 在220 nm波长下监测色谱图，收集相应峰组分，并采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行分析。
  8. 通过反相超高效液相色谱法（UPLC）在220 nm波长下检测，使用UV检测器监测，使样品流经分析型C18色谱柱（粒径1.7 µm），确认多肽纯度。通过质谱法确认多肽产物的结构。
    注：UPLC系统连接电喷雾电离质谱（ESI-MS）及串联四极杆检测器。
  9. 将目标多肽的正确组分收集至圆底烧瓶中，在0.052 mbar的真空条件下冻干成疏松粉末。将真空泵连接至维持在-78 °C的冷冻装置。可长期保存于-80 °C。
  10. 使用冻干多肽配制储备液，浓度为1 mM，溶剂为乙腈: DMF: 色谱纯水（体积比1:1:1），用于后续实验。该溶液可稳定保存至少6个月，因多肽在此溶液中不发生聚集。

2. 注射混合物的制备

  1. 制备磷酸盐缓冲液（PBS）（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4，pH 7.4），用于稀释冻干肽。
  2. 将肽溶解于PBS中，使其终浓度为20 µM。现用现配，充分混匀后置于冰上保存直至注射。操作时间不得超过30分钟，以防止溶液中肽发生聚集。

3. 麻醉

  1. 用循环系统的普通养鱼水配制麻醉剂的母液，即0.1%的乙基-m-氨基苯甲酸甲磺酸盐（MESAB）。将麻醉液稀释至最终浓度为0.0025%（v/v）。
  2. 从养殖 tanks 中取出所需数量的鱼，放入盛有5 L系统水的转运容器中。
  3. 用40 mL麻醉剂半充满一个塑料培养皿（90 mm），用于后续注射操作。
  4. 将鱼置于麻醉剂中孵育，直至鳃盖运动完全停止。

4. 脑室微量注射

  1. 注射装置的准备
    1. 使用拉针仪制备玻璃注射毛细管，参数设置如下：加热循环，537；拉制循环，250；速度，1.5 s；时间，80 ms。
    2. 将压力源的压力调节至 25 psi。
    3. 设置显微注射仪参数如下：维持压力 20 psi；喷射压力 10 psi；周期值 2.5；门控值 100 ms。
    4. 将注射溶液吸入玻璃毛细管中。将玻璃毛细管插入显微注射持针器中。调整注射角度至 45°。
      注：更详细的实验方案可参见参考文献27,46。
  2. 将一条鱼放入盛有麻醉溶液的新培养皿中（同步骤 3.3）。
  3. 用镊子夹住鱼体，并调整至适合注射的方位。
  4. 使用 30 G 针头的尖端在视顶盖区域的颅骨上制造切口，位置为两侧骨板交汇处。切勿将针尖插入脑组织，以免引起出血和损伤。更多细节请参见参考文献27,45,46。
  5. 将玻璃毛细管插入切口。
    1. 仅使用针头尖端，穿透颅骨深度不得超过 1 mm。持续固定鱼体，并将玻璃毛细管尖端经切口插入。
    2. 将玻璃毛细管尖端以 45° 角朝向端脑方向，注入 1 µL 溶液。液体在注射后立即扩散。

5. 恢复

  1. 将鱼放回运输容器中，直至其恢复。将容器连接到持续循环的养鱼用水系统，以确保最佳水质。
    注意：恢复通常需要1分钟。如果恢复时间更长，则必须缩短鱼在麻醉剂中的暴露时间（此参数需由实验人员进行优化）。

6. 组织制备与切片

  1. 在处死斑马鱼前，等待所需的时间段。
    注意：这取决于具体的实验问题。淀粉样蛋白沉积最早可在注射后1天观察到。
  2. 根据伦理法规采用适当的方法处死鱼类例如，用0.1 M MESAB处理鱼类。
  3. 使用尖头镊子在背侧视顶盖上方剪开颅骨，然后用手术刀在胸鳍后方解剖头部。
  4. 使用2%多聚甲醛（PFA）在4 °C下过夜固定头部样本。每个头部样本使用3 mL PFA，置于带螺口盖的塑料管中。
    注意：处理多聚甲醛（PFA）时应穿戴适当的个人防护装备。
  5. 为进行冷冻保护和脱钙处理，将头部在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中洗涤三次，然后转移至20%蔗糖/20%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中，于4 °C孵育过夜。
  6. 将组织包埋于切片树脂中：将样品置于含有7.5%明胶/20%蔗糖溶液的塑料组织学模具中，在干冰上冷冻（约3–5分钟可使组织块完全冻结）。冷冻后的样品可保存于-80 °C，或直接进行下一步（冷冻切片）。
  7. 使用冷冻切片机将头部组织切成12 µm厚的冷冻切片，具体操作如所述28,42将冷冻切片直接转移至载玻片上，并于 -20 °C 保存以长期使用。

7. 免疫组织化学染色与显微镜观察

注意：所有孵育步骤均需在湿化室中进行，且所有洗涤步骤每次均为 10 分钟。

  1. 室温下干燥切片30分钟。解冻后，用PBS洗涤切片两次，再用PBSTx（含0.03% Triton-X-100的PBS）洗涤一次。
  2. 加入一抗（抗Aβ42抗体，以PBSTx按1:500稀释），于4 °C孵育过夜。 次日，用PBS洗涤一次，再用PBSTx洗涤两次。
  3. 将切片与二抗（荧光标记检测抗体，按1:500稀释）以及DAPI（1 μg/mL）共同加入PBSTx中，室温孵育2小时。
  4. 用PBSTx洗涤三次。最后一次洗涤后，取100 μL 70%甘油封片剂，加盖盖玻片封固切片。 
  5. 使用共聚焦显微镜采集荧光图像（例如，采用20X PL APO N.A. 0.7物镜，激发波长488 nm，标准绿色滤光片；图2）39。

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结果

采用高效液相色谱法纯化合成的多肽，并利用质谱法对纯化的淀粉样β多肽进行表征。高效液相色谱柱被加热至 50 °C 以改善Aβ肽的分离效果，并收集所有组分。为鉴定正确合成的肽段，对所有组分进行质谱分析。UPLC色谱图显示了该化合物的纯度。在UPLC上呈现单一峰的HPLC组分（即，所需淀粉样蛋白β肽的正确质荷比）被进一步用于实验（图2).

可通过多种光谱学方法评估肽段形成聚集体的功能39,48,49，也可将肽段在室温下于磷酸盐缓冲液（PBS）中孵育超过1小时，从而形成聚集体。在此情况下，溶液中应可见沉淀物和较大的聚集体。

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讨论

淀粉样肽可进行修饰，以包含序列变异或各种标签。例如，可生成 scrambled 淀粉样肽，并在肽的 N 末端标记荧光标签，或与载体肽连接39。在本方案中，由于载体肽 TR 作为一种细胞穿透肽能够有效将货物转运至脑组织深部，因此被选用39。此外，我们的方法允许注射并分析多种可能引起毒性聚集的肽50,51。因此，该系统提供了一种灵活的方法，用于手动将毒性蛋白注射到斑马鱼脑中，并分析此类毒性的细胞效应。

淀粉样肽会快速聚集，因此储备液必须保存在水-二甲基甲酰胺-乙腈溶液中，并且仅在注射前0.5小时与磷酸盐缓冲液（PBS）混合。如果溶液中存在较大聚集体，则注射液应在注射前10分钟内配制。注射效率是获得一致结果的重要参数。有关如何进行良好且可重复的注射操作，请参考我们之前发表在JoVE上的论文46。若注射后未观察到聚集现象，则必须优化...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

本工作由德国神经退行性疾病中心（DZNE）和亥姆霍兹协会（VH-NG-1021）、CRTD、德累斯顿工业大学（FZ-111，043_261518）以及德国研究基金会（DFG）（KI1524/6）（C.K.）；以及由莱布尼茨协会（SAW-2011-IPF-2）和联邦教育与研究部（BMBF）（BioLithoMorphie 03Z2E512）（Y.Z.）资助。我们还要感谢Ulrike Hofmann在多肽合成方面的帮助，以及Nandini Asokan、Prayag Murawala和Elly Tanaka在拍摄该实验流程过程中提供的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Fmoc 保护的氨基酸IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)用于固相多肽合成（SPPS）的 Fmoc 法氨基酸
N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐（HBTU）IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)RL-1030活化剂
氧化吗啉（Oxyma）IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)RL-1180消旋抑制剂
N,N-二异丙基乙胺IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)SOL-003碱
二甲基甲酰胺IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)SOL-004溶剂
N-甲基吗啉Thermo Fisher (Kandel) GmbH, GermanyA12158碱
1-羟基苯并三唑水合物（HOBT）Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA)157260 ALDRICH活化剂
哌啶MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)822299Fmoc 脱保护试剂
二氯甲烷（DCM）MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)106050溶剂
甲酸（FA）MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)100264HPLC 缓冲液组分
三氟乙酸（TFA）MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)808260裂解混合试剂
三异丙基硅烷（TIS）MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)233781 ALDRICH裂解混合试剂
乙腈（用于 UPLC/LCMS）Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH34967-1L溶剂
乙腈（用于 HPLC）VWR International Ltd, England83639.320溶剂
乙醚VWR International Ltd, England23811.326多肽沉淀用溶剂
二硫苏糖醇（DTT）VWR International Ltd, England0281-25G裂解混合试剂
TentaGel S RAM Fmoc Rink 酰胺树脂Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany)S30023SPPS 固相载体
带滤膜的 5 ml 多肽合成注射器Intavis AG (Cologne, Germany)34.274SPPS 及固相裂解反应管
聚四氟乙烯（PTFE）滤膜Sartorius Stedtim (Aubagne, France)11806-50-N沉淀多肽的过滤
聚偏二氟乙烯（PVDF）注射器滤膜Carl Roth GmbH + Co. KG KarlsruheKC78.1HPLC 前过滤
多肽合成仪Intavis, Cologne, GermanyResPep SL自动化固相多肽合成仪
Water Alliance HPLCWaters, Milford Massachusetts, USAWaters 2998, Waters e2695半制备型反相高效液相色谱（HPLC）
PolymerX，粒径 10μm，250×10 mmPhenomenex Ltd. Germany00G-4328-N0多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯 HPLC 色谱柱
Milli-Q Advantage A10，配备 Milli-Q 滤膜EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USALCPAK0001水纯化系统
过滤装置Sartorius Stedtim (Aubagne, France)16307多肽沉淀用过滤单元
配备紫外检测器的 UPLC AquityWaters, Milford Massachusetts, USAM09UPA 664M用于 LC-MS 的分析型反相超高效液相色谱（UPLC）
ACQUITY UPLC BEH C18，粒径 1.7 μm，50×2.1 mmWaters, Milford Massachusetts, USA186002350分析型 C18 色谱柱
ACQUITY TQ 检测器Waters, Milford Massachusetts, USAQBB908电喷雾电离质谱（ESI-MS）
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany16706, 101542带真空泵的冷冻干燥仪
Paradigm 酶标仪Beckman Coulter
MESAB（间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）Sigma-AldrichA5040
培养皿Sarstedt821.472
磷酸盐缓冲液（PBS）Life Technologies, GIBCO10010-056
针头Becton-Dickinson305178
解剖显微镜Olympus, Leica, Zeiss因制造商而异
Dumont 镊子World Precision Instruments501985
Gillies 解剖镊World Precision Instruments501265
玻璃注射毛细管World Precision InstrumentsTWF10
PicoNozzleWorld Precision Instruments5430-12
气动 PicoPumpWorld Precision InstrumentsSYS-PV820
环形照明器；环形导光管Parkland ScientificILL-RLG
冷冻切片机LeicaCM1950

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