从人脐带血中分离内皮祖细胞

摘要

本实验方案的目的是从脐带血中分离内皮祖细胞。这些细胞的一些应用包括将其作为生物标志物用于识别心血管疾病风险患者、治疗缺血性疾病，以及构建组织工程化的血管和心脏瓣膜结构。

摘要

外周血中内皮祖细胞（EPCs）的存在及其在血管发生中的作用最早由 Ashara 及其同事报道¹。随后，其他研究者证实了来源于骨髓的类似类型 EPCs 的存在^2,3。最近，Yoder 和 Ingram 发现，与从成人外周血中分离的 EPCs 相比，来源于脐带血的 EPCs 具有更高的增殖潜能^4,5,6。除了参与出生后的血管发生外，EPCs 还显示出作为构建组织工程血管和心脏瓣膜结构的细胞来源的潜力^7,8。目前存在多种分离方案，其中一些涉及利用内皮和造血标志物对前述来源获得的单个核细胞（MNCs）进行细胞分选，或使用特制的内皮细胞生长培养基培养这些 MNCs，或结合这些技术⁹。本文介绍一种无需免疫分选，仅使用添加生长因子的特制内皮细胞培养基进行 EPCs 分离与培养的方案，并通过 Western blotting 和免疫染色对分离得到的细胞进行鉴定。

引言

多位研究者已对人EPCs的特性及其潜能进行了研究^{5,10,11,12,13}。EPCs可被描述为一类循环细胞，能够黏附于缺氧、缺血、损伤或肿瘤形成部位的内皮组织，并参与新生血管结构的形成^4,14。人们观察到EPCs以出生后血管发生的形式参与血管新生，这一发现加深了对其病理生理机制的理解，并推动了其在治疗领域的应用^4,15,16。个体体内EPCs的数量已被证实与心血管疾病病理相关^{9,15,16,17,18,19,20}。其他研究还成功将EPCs分化为类似瓣膜成纤维细胞的表型，并提出这些细胞可用于组织工程心脏瓣膜的构建^7,21。

分离内皮祖细胞所需的特定细胞表面分子尚未明确，不同研究之间存在差异⁴多个研究团队已在不同培养条件下，开展了单个核细胞（MNCs）与特定基质黏附的实验。^1,17,22,23，表明推测的EPCs可能表现出不同的表型特征。这些特征包括缺乏吞噬能力、在Matrigel中形成管状结构的能力，以及摄取Dil-乙酰化低密度脂蛋白的能力。高克隆形成能力和增殖潜能是可用于对EPCs进行分级的两个特性⁵. EPCs 也可以形成 体外 与人胎儿肺成纤维细胞共培养时的管状结构⁴这些细胞已知可表达内皮细胞表面标志物，并共享部分造血标志物。^13,24,25被广泛接受用于EPC表型鉴定的阳性表达标志物包括CD31、CD34、血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）、血管性血友病因子（vWF）、CD133、c-Kit以及血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）。^4,18共表达 CD90、CD45、CD14、CD115 或 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的细胞不被视为内皮祖细胞（EPCs），因其增殖潜能有限、具有吞噬细菌的能力，且无法形成 从头合成 人类血管 体内^4,7本文概述了一种无需细胞分选技术即可从人脐带血中分离内皮祖细胞的改良方案。在本研究中，我们采用 CD31、CD34 和 VEGFR2 作为阳性标记物，α-SMA 作为阴性标记物。

本文提出一种无需细胞分选、直接从脐带血中分离和培养内皮祖细胞的方法，该方法采用添加生长因子的专用内皮细胞生长培养基（EGM）。该EGM含有血管内皮生长因子（VEGF）和成纤维细胞生长因子（FGF），可增强内皮细胞的存活、增殖和迁移能力²⁶。培养基中还包含维持细胞铺路石样形态的抗坏血酸、提供血管生成和迁移功能的胰岛素样生长因子-1（IGF-1），以及可提高培养基中生长因子长期稳定性的肝素²⁶。此外，在内皮细胞培养基中还可添加表皮生长因子（EGF），以促进细胞增殖与分化，以及氢化可的松，以增强细胞对EGF的敏感性²⁶。我们证明，使用该特定生长培养基所获得的EPC数量高于内皮基础培养基（EBM）或杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。

方案

本研究经阿肯色大学机构审查委员会批准（批准编号 16-04-722）。脐带血单位在阿肯色脐带血库使用柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖（CPD）溶液采集，未达到储存标准的单位被捐赠用于研究。脐带血单位在采集后24小时内以室温由专人运送至实验室。

1. 从脐带血中分离内皮祖细胞

1. 试剂的准备。
   1. 通过将内皮细胞基础培养基（EBM）加入含10%胎牛血清（FBS）的培养基中，并补充20 ng/mL胰岛素样生长因子（IGF）、1 µg/mL抗坏血酸、5 ng/mL重组人表皮生长因子（rhEGF）、22.5 µg/mL肝素、0.5 ng/mL血管内皮生长因子（VEGF），以及10 ng/mL重组人成纤维细胞生长因子B（rhFGF-B）、0.2 µg/mL氢化可的松和2%青霉素-链霉素-谷氨酰胺，配制EGM。使用0.2 µm聚醚砜（PES）膜真空滤器对培养基进行灭菌。
   2. 使用0.02 N乙酸配制浓度为50 µg/mL的大鼠尾I型胶原溶液。使用0.2 µm注射器滤器对该溶液进行灭菌。
   3. 用2 mL已配制的大鼠尾I型胶原溶液预包被6孔板的每个孔。将板置于维持在5% CO₂和37 °C的培养箱中，至少孵育1小时后再接种细胞。
   4. 用Hanks平衡盐溶液（HBSS）以1:1比例稀释约25 mL脐带血。
   5. 使用150 mM氯化钠、1% Triton X-100、0.5%脱氧胆酸钠、1 mM β-甘油磷酸钠、0.1% SDS和50 mM Tris（pH 8.0）配制放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液。
2. 内皮祖细胞的分离。
   1. 在分离前，将所有已配制的试剂在37 °C水浴中预热。
   2. 向50 mL离心管中加入20 mL密度梯度介质试剂。
   3. 小心地将20 mL稀释后的脐带血沿管壁缓慢加入含有密度梯度介质的离心管中，避免破坏分层，移液时应将移液器枪头对准管壁。
   4. 在室温下以800 x g离心30分钟（离心机转子刹车关闭），根据各组分密度进行分离（图1）。切勿扰动不同层次。
   5. 小心吸除血浆层，移液过程中避免扰动其他细胞层，直至移液器枪头能够接触到单个核细胞（MNC）层（见图1）。弃去吸除的血浆。
      注意：使用移液器吸除血浆时，应在MNC层上方保留少量血浆层（图1），以减少扰动。
   6. 使用连接18号针头的注射器收集含有MNC的白膜层，并转移至新的离心管中。
   7. 向收集的MNC中加入等体积的EBM。在4 °C下以500 x g离心10分钟，弃去上清液。
      注意：由于存在红细胞/红血球，细胞沉淀可能呈红色。
   8. 加入5 mL氯化铵溶液以裂解红细胞。将离心管置于冰上孵育5–10分钟，期间偶尔轻轻震荡。
      注意：此步骤需谨慎控制时间，避免超时，否则可能对MNC造成损伤。
   9. 在4 °C下以500 x g离心10分钟，弃去上清液。若仍有红细胞残留，重复步骤1.2.8和1.2.9，直至沉淀中无红色可见。
   10. 将沉淀重悬于已配制的EGM中，并使用血细胞计数板对MNC进行计数。
   11. 吸除已包被大鼠尾I型胶原的6孔板（来自步骤1.1.3）中的液体，用1x磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤各孔三次。
   12. 将重悬于EGM中的MNC沉淀以每孔1 × 10⁷个MNC的浓度接种至胶原包被的6孔板中，放入37 °C、5% CO₂培养箱中培养。
   13. 24小时后，吸除培养基，用EGM洗涤各孔一次，每孔加入3 mL新鲜EGM，放回37 °C、5% CO₂培养箱中继续培养。
   14. 连续7天每天更换新鲜EGM培养基。7天后，每隔一天更换一次EGM培养基。
   15. 使用明场显微镜每天对6孔板进行拍照，以追踪内皮细胞克隆的生长情况。标记克隆出现的位置，以便持续观察其生长动态。
       注意：通常需要5至9天时间，克隆才会在培养中显现。
3. 内皮祖细胞的扩增。
   1. 用大鼠尾I型胶原（50 µg/mL）包被T-25培养瓶，置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育至少60分钟。接种前吸除液体，并用1x PBS洗涤T-25培养瓶三次。
   2. 当内皮细胞克隆大小达到约3 mm时，使用每孔150 µL的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化。将6孔板放回37 °C、5% CO₂培养箱中孵育2–3分钟。
   3. 轻轻敲击6孔板使贴壁细胞脱落，立即加入2 mL EGM，将细胞收集至15 mL离心管中。
   4. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并计算初始接种密度。
   5. 在400 x g下离心15 mL离心管5分钟。将细胞沉淀重悬于EGM中，并接种约500,000个细胞至T-25培养瓶。标记该培养瓶为第1代（Passage 1），放回37 °C、5% CO₂培养箱中继续培养。
      注意：可将细胞接种于EBM和DMEM中，以比较其在不同培养基中的生长情况。
   6. 后续传代时，当培养瓶细胞融合度达到90%时，重复步骤1.3.1–1.3.5，以10⁴个细胞/cm²的密度将细胞重新接种至T-75或T-175培养瓶中。随后进行分离细胞的表征分析（步骤2和3）。

2. 使用蛋白质印迹法对分离细胞进行表征

1. 在扩增步骤中每次传代时加入 50 - 100 µL 裂解缓冲液，以对分离的细胞进行表征。从约 500,000 个或更多的细胞中收集蛋白质。
2. 用力吹打数次以破裂细胞并释放蛋白质。收集缓冲液并转移至微量离心管中。
3. 将微量离心管在 500 × g 条件下离心，小心地将上清液转移至新的微量离心管中。标记后于 -80 °C 长期保存。
4. 使用 Bradford 法或 BCA 法测定每管中的蛋白质含量^27,28,29。
5. 按照标准流程进行 Western 印迹分析^27,28,29。每份样品分析 5 µg 总蛋白中 CD31、CD34、VEGFR2 和 α-SMA 的表达水平。使用 α-微管蛋白对数据进行归一化处理。

3. 间接免疫荧光

1. 将18 mm玻璃盖玻片在50%乙醇中进行超声处理并干燥。将洁净的盖玻片置于12孔板中，在生物安全柜内打开紫外灯过夜，以达到灭菌效果。
2. 用50 µg/mL的大鼠尾I型胶原蛋白包被盖玻片，并将培养板转移至37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育至少60分钟。
3. 吸除胶原溶液，向12孔板中每孔加入1 mL 1× PBS洗涤盖玻片，随后吸除PBS，重复洗涤两次。
4. 在每孔中接种250,000个培养的EPCs，并放回37 °C、5% CO₂培养箱中孵育至少3天，之后进行免疫染色。
5. 用1× PBS洗涤培养板3次。向每孔加入1 mL冰甲醇，在室温下孵育15分钟以固定细胞。
6. 采用标准方案进行免疫染色^27,28,29。使用适当稀释比例的抗体（例如，CD31（1:20）、CD34（1:50）、α-SMA（1:100）和VEGFR2（1:50））。
7. 使用落射荧光显微镜对免疫染色后的盖玻片进行成像。

结果

内皮祖细胞的分离与扩增：
提供了一个示意图（图1），展示了整体实验流程。将人脐带血与密度梯度介质进行密度梯度离心后，可观察到不同的血液成分层。将单个核细胞（MNCs）接种至胶原蛋白处理的培养板上后，可在第5至7天首次观察到细胞集落的生长（图2A）。这些集落在早期持续生长，呈现纺锤形细胞形态（图2A-2D），随后逐渐发展为鹅卵石样形态（图2E-2F）。图3A 显示了培养过程中细胞总数随时间的变化，每个数据点代表每次传代时收获的累积细胞数量。图3<...

讨论

如前所述，贴壁的内皮祖细胞（EPC）具有鹅卵石样形态。我们分离得到的单个核细胞（MNC）在培养早期呈现纺锤形细胞集落（图2A-2D），经过十天的培养后逐渐发展为鹅卵石样细胞集落（图2E-2F）。不同研究团队对EPC的命名有所不同，包括晚期内皮祖细胞¹⁰、内皮集落形成细胞⁵或内皮祖细胞¹²。需要注意的是，这些细胞在功能上是相同的，并表达相似的细胞表面标志物。在培养期间观察到的细胞数量（图3）增长至近10⁸个细胞，与以往文献报道一致，体现了EPC典型的高增殖潜能^3,5。事实上，已有研究发现，来源于人脐带血的EPC具有较...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A) 分离与培养
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	该产品包含配制内皮细胞生长培养基所需的所有生长因子
胎牛血清	Thermofisher Scientific	26140079
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100倍浓缩液）	Thermofisher Scientific	10378016
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02
Hank's 平衡盐溶液	Thermofisher Scientific	14170-112
氯化铵	Stem Cell Technologies	7850
1× 磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermofisher Scientific	14190250
大鼠尾胶原 I 型	Corning	354236
冰醋酸	Amresco	0714-500ML
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Thermofisher Scientific	25300054
HEPES 缓冲液	Thermofisher Scientific	15630080
DMEM 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）	Thermofisher Scientific	10566-016
B) 抗体与细胞裂解物
CD31	Abcam	ab28364	用于 Western blot 检测，稀释比例为 1:250
CD34	Santa Cruz Biotechnology	sc-7045	用于 Western blot 检测，稀释比例为 1:100
α-SMA	abcam	ab5694	用于 Western blot 检测，稀释比例为 1:100
α-微管蛋白	abcam	ab7291	用于 Western blot 检测，稀释比例为 1:2,500
VEGFR2	abcam	sc504	用于 Western blot 检测，稀释比例为 1:100
人脐静脉内皮细胞裂解物	Santa Cruz Biotechnology	sc24709
瓣膜间质细胞裂解物			由本实验室自主培养的原代细胞系，使用 RIPA 缓冲液裂解制备
C) Western blot 与免疫染色
10× Tris/甘氨酸/SDS 缓冲液	Biorad	161-0772	用作电泳运行缓冲液
10× Tris/甘氨酸缓冲液	Biorad	161-0771	用作转膜缓冲液
Immobilon-FL 转膜膜	Merck Millipore	IPFL0010	这是一种孔径为 45 µm 的 PVDF 转膜膜，在本实验方案中称为 Western blot 膜
4× Laemmli 样品缓冲液	Biorad	161-0747
2-巯基乙醇	Biorad	161-0710
10% Criterion TGX 预制胶	Biorad	5671033
Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Thermofisher Scientific	P36930	用于免疫染色盖玻片的封片，以便长期保存
甲醇	VWR Analytical	BDH1135-4LP