从人脐带血中分离内皮祖细胞

摘要

本实验方案的目的是从脐带血中分离内皮祖细胞。这些细胞的一些应用包括将其作为生物标志物用于识别心血管疾病风险患者、治疗缺血性疾病，以及构建组织工程化的血管和心脏瓣膜结构。

摘要

外周血中内皮祖细胞（EPCs）的存在及其在血管发生中的作用最早由 Ashara 及其同事报道¹。随后，其他研究者证实了来源于骨髓的类似类型 EPCs 的存在^2,3。最近，Yoder 和 Ingram 发现，与从成人外周血中分离的 EPCs 相比，来源于脐带血的 EPCs 具有更高的增殖潜能^4,5,6。除了参与出生后的血管发生外，EPCs 还显示出作为构建组织工程血管和心脏瓣膜结构的细胞来源的潜力^7,8。目前存在多种分离方案，其中一些涉及利用内皮和造血标志物对前述来源获得的单个核细胞（MNCs）进行细胞分选，或使用特制的内皮细胞生长培养基培养这些 MNCs，或结合这些技术⁹。本文介绍一种无需免疫分选，仅使用添加生长因子的特制内皮细胞培养基进行 EPCs 分离与培养的方案，并通过 Western blotting 和免疫染色对分离得到的细胞进行鉴定。

引言

多位研究者已对人EPCs的特性及其潜能进行了研究^{5,10,11,12,13}。EPCs可被描述为一类循环细胞，能够黏附于缺氧、缺血、损伤或肿瘤形成部位的内皮组织，并参与新生血管结构的形成^4,14。人们观察到EPCs以出生后血管发生的形式参与血管新生，这一发现加深了对其病理生理机制的理解，并推动了其在治疗领域的应用^4,15,16。个体体内EPCs的数量已被证实与心血管疾病病理相关^{9,15,16,17,1....}

方案

本研究经阿肯色大学机构审查委员会批准（批准编号 16-04-722）。脐带血单位在阿肯色脐带血库使用柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖（CPD）溶液采集，未达到储存标准的单位被捐赠用于研究。脐带血单位在采集后24小时内以室温由专人运送至实验室。

1. 从脐带血中分离内皮祖细胞

1. 试剂的准备。
   1. 通过将内皮细胞基础培养基（EBM）加入含10%胎牛血清（FBS）的培养基中，并补充20 ng/mL胰岛素样生长因子（IGF）、1 µg/mL抗坏血酸、5 ng/mL重组人表皮生长因子（rhEGF）、22.5 µg/mL肝素、0.5 ng/mL血管内皮生长因子（VEGF），以及10 ng/mL重组人成纤维细胞生长因子B（rhFGF-B）、0.2 µg/mL氢化可的松和2%青霉素-链霉素-谷氨酰胺，配制EGM。使用0.2 µm聚醚砜（PES）膜真空滤器对培养基进行灭菌。
   2. 使用0.02 N乙酸配制浓度为50 µg/mL的大鼠尾I型胶原溶液。使用0.2 µm注射器滤器对该溶液进行灭菌。
   3. 用2 mL已配制的大鼠尾I型胶原溶液预包被6孔板的每个孔。将板置于维持在5% CO₂和37 °C的培养箱中，至少孵育1小时后再接种细胞。
   4. 用Hanks平衡盐溶液（HBSS）以1:1比例稀释约25 mL脐带血。
   5. 使用150 mM氯化钠、1% ....

结果

内皮祖细胞的分离与扩增：
提供了一个示意图（图1），展示了整体实验流程。在使用密度梯度介质对人脐带血进行密度梯度离心后，可观察到不同的血液成分分层。将单个核细胞（MNCs）接种至胶原蛋白处理的培养板上后，可在接种后的第5至7天首次观察到细胞集落的形成（图2A）。这些集落在早期持续生长，呈现纺锤形细胞形态（图2A-2D），随后逐渐发展为鹅卵石样形态（图2E-2F）。图3A展示了培养过程中细胞总数随时间的变化，每个数据点代表每次传代时累计收获的细胞数量。图3

讨论

如前所述，贴壁的内皮祖细胞（EPC）具有鹅卵石样形态。我们分离得到的单个核细胞（MNC）在培养早期呈现纺锤形细胞集落（图2A-2D），经过十天的培养后逐渐发展为鹅卵石样细胞集落（图2E-2F）。不同研究团队对EPC的命名有所不同，包括晚期内皮祖细胞¹⁰、内皮集落形成细胞⁵或内皮祖细胞¹²。需要注意的是，这些细胞在功能上是相同的，并表达相似的细胞表面标志物。在培养期间观察到的细胞数量（图3）增长至近10⁸个细胞，与以往文献报道一致，体现了EPC典型的高增殖潜能^3,5。事实上，已有研究发现，来源于人脐带血的EPC具有较.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A) 分离与培养
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	该产品包含配制内皮细胞生长培养基所需的所有生长因子
胎牛血清	Thermofisher Scientific	26140079
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100倍浓缩液）	Thermofisher Scientific	10378016
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02
Hank's 平衡盐溶液	Thermofisher Scientific	14170-112
氯化铵	Stem Cell Technologies	7850
1× 磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermofisher Scientific	14190250
大鼠尾胶原 I 型	Corning	354236
冰醋酸	Amresco	0714-500ML
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Thermofisher Scientific	25300054
HEPES 缓冲液	Thermofisher Scientific	15630080
DMEM 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）	Thermofisher Scientific	10566-016
B) 抗体与细胞裂解物
CD31	Abcam	ab28364	用于 Western blot 检测，稀释比例为 1:250
CD34	Santa Cruz Biotechnology	sc-7045	用于 Western blot 检测，稀释比例为 1:100
α-SMA	abcam	ab5694	用于 Western blot 检测，稀释比例为 1:100
α-微管蛋白	abcam	ab7291	用于 Western blot 检测，稀释比例为 1:2,500
VEGFR2	abcam	sc504	用于 Western blot 检测，稀释比例为 1:100
人脐静脉内皮细胞裂解物	Santa Cruz Biotechnology	sc24709
瓣膜间质细胞裂解物			由本实验室自主培养的原代细胞系，使用 RIPA 缓冲液裂解制备
C) Western blot 与免疫染色
10× Tris/甘氨酸/SDS 缓冲液	Biorad	161-0772	用作电泳运行缓冲液
10× Tris/甘氨酸缓冲液	Biorad	161-0771	用作转膜缓冲液
Immobilon-FL 转膜膜	Merck Millipore	IPFL0010	这是一种孔径为 45 µm 的 PVDF 转膜膜，在本实验方案中称为 Western blot 膜
4× Laemmli 样品缓冲液	Biorad	161-0747
2-巯基乙醇	Biorad	161-0710
10% Criterion TGX 预制胶	Biorad	5671033
Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Thermofisher Scientific	P36930	用于免疫染色盖玻片的封片，以便长期保存
甲醇	VWR Analytical	BDH1135-4LP