小鼠骨骼肌形态及纤维类型组成的半自动分析

摘要

肌球蛋白重链同工型的免疫组织化学染色已成为骨骼肌纤维类型鉴定的先进技术即，I型、IIA型、IIX型、IIB型）。本文介绍了一种染色方案，并提供一种新型半自动算法，可促进对肌纤维类型及肌纤维形态的快速评估。

摘要

多年来，骨骼肌纤维类型的区分主要依靠肌球蛋白ATP酶染色法进行观察。近年来，肌球蛋白重链（MyHC）同工型的免疫组织化学染色已成为更精细区分纤维类型的方法。目前，可根据MyHC表达谱精确识别I型、IIA型、IIX型和IIB型纤维；然而，这些数据的手动分析可能十分耗时且极为繁琐。因此，快速、准确地评估纤维类型组成及纤维形态成为一种非常理想的工具。本文介绍了一种先进的实验方案，结合对小鼠后肢肌肉冷冻切片进行MyHC免疫组织化学染色，并配合一种新型的半自动分析算法，以加速纤维类型和纤维形态的分析。正如预期，腓肠肌主要显示I型和IIA型纤维的染色，而无IIX型或IIB型纤维的染色。相反，胫骨前肌主要由IIX型和IIB型纤维构成，含有少量IIA型纤维，几乎不含或完全不含I型纤维。我们采用了多种图像转换方法生成概率图，用于测量纤维形态的不同参数（即横截面积（CSA）、最大和最小Feret直径）。所获得的这些参数值与手动测量结果进行了比较，两种分析方法在CSA、最大Feret直径和最小Feret直径方面均无显著差异（所有p > 0.05），表明本方法具有良好的准确性。因此，本免疫染色分析方案可广泛应用于多种衰老和肌病模型中肌肉组成变化的研究。

引言

长期以来人们已知骨骼肌由多种类型的单根肌纤维组成¹。最初，根据收缩特性将肌纤维分为两类，并相应地命名为慢缩纤维（I型）和快缩纤维（II型）。随后又根据纤维的代谢特征进一步区分这两类纤维。由于I型纤维富含线粒体且依赖氧化代谢，因此通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-四唑盐还原酶（NADH-TR）脱氢酶²或琥珀酸脱氢酶（SDH）³染色可观察到强阳性反应。相比之下，II型纤维的NADH-TR脱氢酶或SDH染色较弱且程度不一，根据其相对氧化能力粗略地分为两个快缩亚型（IIA型和IIB型）。这些纤维类型之间的差异可通过肌球蛋白-ATP酶染色更清晰地显示：在pH 4.0条件下预孵育后，I型纤维染色较深；而在pH 10.0条件下预孵育后，IIB型纤维沉淀物吸收明显，IIA型纤维则呈中等染色⁴。

最近，肌球蛋白重链（MyHC）同工型的免疫组织化学染色已成为更精细区分肌纤维类型的方法⁵I型、IIA型和IIB型肌纤维可根据其MyHC表达谱被精确区分。此外，还鉴定出另一种快速收缩、代谢特征介于中间的肌纤维类型，即IIX型。⁶表达多种MyHC的混合纤维也已得到证实^5,<....

方案

所有涉及小鼠的实验程序均经科罗拉多大学安舒茨医学校区机构动物护理与使用委员会批准（编号：91813(05)1D）。

1. 第1天：使用牛血清白蛋白（BSA）封闭的初级（1°）免疫染色

1. 风干小鼠后肢肌肉的冰冻切片（例如，胫骨前肌，腓肠肌）置于带电载玻片上约 30 分钟¹¹使用疏水性屏障PAP笔在切片周围画出边界。
2. 放置约 ~ 250 µL 每张载玻片上加入5% BSA/磷酸盐缓冲液（BSA/PBS）以封闭非特异性抗体结合位点，室温孵育1小时。
3. 封闭期间，将1以1:50的比例稀释° 5% BSA/PBS 中的抗体上清液（均为小鼠单克隆抗体；参见 表1^6,12）；准备 250 µL 每张载玻片加入适量溶液。保持 1° 抗体储备液及稀释液置于冰上。

表1：用于区分My....

结果

后肢肌肉（即，从一只年龄不详的雄性C57BL/6小鼠中分离出的胫骨前肌、比目鱼肌，被置于盛有OCT包埋剂的塑料模具中，浸入液氮冷却的异戊烷进行速冻。随后，使用冷冻切片机切取8-10 µm 连续切片在 -20 °C 并转移至不同的带正电荷的玻璃载片上¹².

我们选择胫骨前肌和比目鱼肌，是因为这些肌肉分别主要由快肌纤维和慢肌纤维组成^13,14在对I型、IIA型、IIX型和IIB型MyHC分别进行免疫组织化学染色后，采集了明场和荧光图像。左侧面板的 图1 用所列的I型、IIA型、IIX型和IIB型MyHC特异性抗体对腓肠肌进行免疫染色后的切片展示 表1.

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讨论

本文为骨骼肌纤维类型的鉴定提供了实用的指导，并介绍了一种用于数据分析的新算法。

由于我们的结果在很大程度上证实了先前研究报告^5,8,10的结论，并且与我们自身的手动测量结果一致，因此该算法似乎是准确的。尽管如此，我们仍遇到了一些不常见的实验陷阱，包括因切片伪影导致的纤维边界不清。通过仔细切片并在分析前对处理后的切片进行仔细检查，可将这些伪影的影响降至最低。特别是，可通过在同一图像上进行多轮重新分类，以获得更清晰的对比度，从而避免图像分割效果欠佳的问题。

本方案中最关键的步骤是第4.2步，即通过在特定纤维上绘制线条来界定该切片的细胞内和细胞外区域，从而区分出"1类"或"2类"区域。显然，这种人工区分至关重要，因为它决定了肌纤维的边界；此步骤中的任何误差都将对纤维尺寸的评估产生不利影响。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A9418-100G	5% in PBS
疏水屏障笔	Scientific Device Laboratory	9804-02
显微镜载玻片	Globe Scientific	1358W
盖玻片	Fisher Scientific	12-544-E
Immumount	Thermo Scientific	9990402
指甲油	L'Oreal
Nikon Eclipse TE-200 倒置荧光与明场显微镜		已停产
SPOT RT/KE	SPOT Imaging Solutions	RT940
Dell Optiplex
BA-F8 一抗	爱荷华大学发育研究杂交瘤库		单克隆小鼠 IgG2b；1:50
SC-71 一抗	爱荷华大学发育研究杂交瘤库		单克隆小鼠 IgG1；1:50
BF-F3 一抗	爱荷华大学发育研究杂交瘤库		单克隆小鼠 IgGM；1:50
6H1 一抗	爱荷华大学发育研究杂交瘤库		单克隆小鼠 IgGM；1:50
Alexa Fluor 594 anti-IgG2b	Invitrogen	A21145	山羊抗小鼠；1:200
Alexa Fluor 488 anti-IgG1	Invitrogen	A21121	山羊抗小鼠；1:200
Alexa Fluor 594 anti-IgGM	Invitrogen	A21044	山羊抗小鼠；1:200
OCT 包埋剂	Sakura Finetek	4583
异戊烷	Fisher Scientific	O3551-4	用液氮冷却
PBS	Fisher Bioreagents	BP665-1	10x，稀释至1x
Kim擦拭纸	Kimberly-Clark	06-666A