肌球蛋白重链同工型的免疫组织化学染色已成为骨骼肌纤维类型鉴定的先进技术即，I型、IIA型、IIX型、IIB型）。本文介绍了一种染色方案，并提供一种新型半自动算法，可促进对肌纤维类型及肌纤维形态的快速评估。
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摘要
摘要
多年来，骨骼肌纤维类型的区分主要依靠肌球蛋白ATP酶染色法进行观察。近年来，肌球蛋白重链（MyHC）同工型的免疫组织化学染色已成为更精细区分纤维类型的方法。目前，可根据MyHC表达谱精确识别I型、IIA型、IIX型和IIB型纤维；然而，这些数据的手动分析可能十分耗时且极为繁琐。因此，快速、准确地评估纤维类型组成及纤维形态成为一种非常理想的工具。本文介绍了一种先进的实验方案，结合对小鼠后肢肌肉冷冻切片进行MyHC免疫组织化学染色，并配合一种新型的半自动分析算法，以加速纤维类型和纤维形态的分析。正如预期，腓肠肌主要显示I型和IIA型纤维的染色，而无IIX型或IIB型纤维的染色。相反，胫骨前肌主要由IIX型和IIB型纤维构成，含有少量IIA型纤维，几乎不含或完全不含I型纤维。我们采用了多种图像转换方法生成概率图，用于测量纤维形态的不同参数（即横截面积（CSA）、最大和最小Feret直径）。所获得的这些参数值与手动测量结果进行了比较，两种分析方法在CSA、最大Feret直径和最小Feret直径方面均无显著差异（所有p > 0.05），表明本方法具有良好的准确性。因此，本免疫染色分析方案可广泛应用于多种衰老和肌病模型中肌肉组成变化的研究。
引言
长期以来人们已知骨骼肌由多种类型的单根肌纤维组成1。最初，根据收缩特性将肌纤维分为两类，并相应地命名为慢缩纤维（I型）和快缩纤维（II型）。随后又根据纤维的代谢特征进一步区分这两类纤维。由于I型纤维富含线粒体且依赖氧化代谢，因此通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-四唑盐还原酶（NADH-TR）脱氢酶2或琥珀酸脱氢酶（SDH）3染色可观察到强阳性反应。相比之下，II型纤维的NADH-TR脱氢酶或SDH染色较弱且程度不一，根据其相对氧化能力粗略地分为两个快缩亚型（IIA型和IIB型）。这些纤维类型之间的差异可通过肌球蛋白-ATP酶染色更清晰地显示：在pH 4.0条件下预孵育后，I型纤维染色较深；而在pH 10.0条件下预孵育后，IIB型纤维沉淀物吸收明显，IIA型纤维则呈中等染色4。
最近，肌球蛋白重链（MyHC）同工型的免疫组织化学染色已成为更精细区分肌纤维类型的方法5I型、IIA型和IIB型肌纤维可根据其MyHC表达谱被精确区分。此外，还鉴定出另一种快速收缩、代谢特征介于中间的肌纤维类型，即IIX型。6表达多种MyHC的混合纤维也已得到证实5,7,8一些物种（如猫和狒狒）已知不表达IIB型肌球蛋白重链6尽管肌球蛋白重链（MyHC）免疫染色目前是评估肌肉组成的先进技术，但若缺乏自动化辅助，通过该技术获得数据的分析过程繁琐且耗时。为此，已开发出若干种半自动化方法用于分析此类数据。5,9,10在此，我们介绍一种用于免疫组织化学鉴定肌纤维类型的相对标准方案5,7,8,10, 以及一种新型半自动算法，可准确快速地分析纤维类型和纤维形态。
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方案
所有涉及小鼠的实验程序均经科罗拉多大学安舒茨医学校区机构动物护理与使用委员会批准（编号：91813(05)1D）。
1. 第1天：使用牛血清白蛋白（BSA）封闭的初级（1°）免疫染色
- 风干小鼠后肢肌肉的冰冻切片（例如，胫骨前肌，腓肠肌）置于带电载玻片上约 30 分钟11使用疏水性屏障PAP笔在切片周围画出边界。
- 放置约 ~ 250 µL 每张载玻片上加入5% BSA/磷酸盐缓冲液（BSA/PBS）以封闭非特异性抗体结合位点，室温孵育1小时。
- 封闭期间，将1以1:50的比例稀释° 5% BSA/PBS 中的抗体上清液（均为小鼠单克隆抗体；参见 表16,12）；准备 250 µL 每张载玻片加入适量溶液。保持 1° 抗体储备液及稀释液置于冰上。
表1：用于区分MyHC的初级抗体。
- 吸除5% BSA/PBS封闭液后，加入 250 µL 1 的° 将抗体稀释液加入相应的载玻片。添加 250 µL 5% BSA/PBS 的二抗2°) 仅抗体阴性对照切片。
- 孵育于 4 °C 在湿润环境中孵育24 - 48 h。
注意：用铝箔包裹并铺有湿润滤纸的培养皿可作为合适的培养环境。
2. 第2天：使用荧光抗体进行二抗免疫染色
- 吸去一抗溶液或对照 5% BSA/PBS 溶液。用 5% BSA 将所有切片洗涤三次，每次 10 分钟。
- 洗涤的同时，用 5% BSA/PBS 配制纯化的荧光素偶联二抗的 1:200 稀释液（见表 2，均为山羊抗小鼠抗体）。每张切片准备 250 µL 溶液。将荧光素偶联的二抗置于冰上并避光保存。
表2：用于可视化初级抗体对MyHC识别的荧光素偶联二抗。
- 第三次加入5% BSA/PBS封闭液并吸出后，向所有载玻片中加入250 µL二抗稀释液。在避光、湿润的环境中室温孵育90分钟。
- 吸除二抗溶液。用5% BSA/PBS对所有载玻片洗涤三次，每次10分钟。
- 用PBS冲洗。干燥10分钟。
- 使用非永久性、低粘度的水溶性封片剂封固盖玻片。
- 干燥后，用指甲油密封载玻片边缘。完全干燥后置于避光的载玻片盒中保存。
3. 使用落射荧光显微镜对载玻片进行成像
- 用少量浸有70%乙醇的实验室擦拭纸清洁载玻片。
- 使用配备摄影装置的落射荧光显微镜获取免疫染色肌肉切片的数字图像（参见材料表）。
- 选择约1 mm2的区域（10倍物镜，1.4 NA）。
- 通过505 nm长通滤光片观察Alexa 488标记的二抗荧光信号，通过595 nm长通滤光片观察Alexa 594标记的二抗在激发下产生的荧光信号。使用配备兼容成像软件的PC计算机对图像进行数字化处理，并从成像软件中添加标尺，用于后续分析。
4. 使用 Fiji 分析图像
注意：在进行分析之前，必须通过 https://imagej.net/Fiji/Downloads 安装Fiji（可从美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院免费获取）。此外，本流程中使用的宏文件包含在补充文件中。请将宏文件放置于一个易于访问的目录中。
- 在 Fiji 中加载选定切片的明场图像。导航至 插件 → 分割 → 可训练的 Weka 分割
- 为了界定切片的细胞区域，在纤维上画一条线，然后单击 "加入班级 1"然后，在纤维之间的空隙处画一条线，然后单击 "添加到第二类" 标记细胞外结构域。重复操作，直至每一类中均有5-10个标记。
- 点击“训练分类器”。在生成的红色和绿色叠加图像上，如有必要，手动添加更多标签至分割错误的图像区域（参见步骤 4.2）。重复此过程，直至纤维（红色）与纤维间间隙（绿色）被正确分离。
- 点击 "获取概率" 并将图像保存到新命名的文件夹中。
- 重复上述步骤（4.2 - 4.3），使用同一视野下拍摄的荧光图像。将免疫染色的纤维标记为 "1类" 以及所有非荧光区域作为 "2类"将生成的概率图保存到与处理后的明场图像相同的文件夹中。
- 在 Fiji 中打开一个先前保存的概率图。在成像软件提供的比例尺上绘制一条直线。转到 分析 → 设定比例尺。更改参数（即，已知距离，长度单位）设置为比例尺所示的相应数值，然后检查 "全球" 使用标尺框对每幅图像的尺度进行标准化。
- 导航至插件 → 宏 → 运行 → 泰亚吉 等 纤维定量宏文件.ijm（参见 补充文件）。此时将立即出现一个导航窗格。打开该图像所在的文件夹，此时会弹出一个对话框。对于每个对话框，更改 "背景" 下拉值至 "光。"
注意：文件夹中将自动生成纤维轮廓的图像以及包含结果数据的电子表格文件（横截面积和Feret直径是量化纤维形态最关键的参数；测量参数可在“Analyze Set Measurements”中调整）。Fiji软件的孔隙分析功能生成的纤维形态数据将自动导出至电子表格文件，适用于荧光图像和明场图像。 - 通过将视野中表达特定MyHC的荧光纤维数量除以相应明场图像中的总纤维数量，计算该视野中表达给定MyHC的纤维比例。
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结果
后肢肌肉（即，从一只年龄不详的雄性C57BL/6小鼠中分离出的胫骨前肌、比目鱼肌，被置于盛有OCT包埋剂的塑料模具中，浸入液氮冷却的异戊烷进行速冻。随后，使用冷冻切片机切取8-10 µm 连续切片在 -20 °C 并转移至不同的带正电荷的玻璃载片上12.
我们选择胫骨前肌和比目鱼肌，是因为这些肌肉分别主要由快肌纤维和慢肌纤维组成13,14在对I型、IIA型、IIX型和IIB型MyHC分别进行免疫组织化学染色后，采集了明场和荧光图像。左侧面板的 图1 用所列的I型、IIA型、IIX型和IIB型MyHC特异性抗体对腓肠肌进行免疫染色后的切片展示 表1.
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讨论
本文为骨骼肌纤维类型的鉴定提供了实用的指导，并介绍了一种用于数据分析的新算法。
由于我们的结果在很大程度上证实了先前研究报告5,8,10的结论，并且与我们自身的手动测量结果一致，因此该算法似乎是准确的。尽管如此，我们仍遇到了一些不常见的实验陷阱，包括因切片伪影导致的纤维边界不清。通过仔细切片并在分析前对处理后的切片进行仔细检查，可将这些伪影的影响降至最低。特别是，可通过在同一图像上进行多轮重新分类，以获得更清晰的对比度，从而避免图像分割效果欠佳的问题。
本方案中最关键的步骤是第4.2步，即通过在特定纤维上绘制线条来界定该切片的细胞内和细胞外区域，从而区分出"1类"或"2类"区域。显然，这种人工区分至关重要，因为它决定了肌纤维的边界；此步骤中的任何误差都将对纤维尺寸的评估产生不利影响。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢博特彻基金会和肌萎缩侧索硬化协会（#17-II-344）对本研究的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| 疏水屏障笔 | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| 显微镜载玻片 | Globe Scientific | 1358W | |
| 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| 指甲油 | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 倒置荧光与明场显微镜 | 已停产 | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 一抗 | 爱荷华大学发育研究杂交瘤库 | 单克隆小鼠 IgG2b；1:50 | |
| SC-71 一抗 | 爱荷华大学发育研究杂交瘤库 | 单克隆小鼠 IgG1；1:50 | |
| BF-F3 一抗 | 爱荷华大学发育研究杂交瘤库 | 单克隆小鼠 IgGM；1:50 | |
| 6H1 一抗 | 爱荷华大学发育研究杂交瘤库 | 单克隆小鼠 IgGM；1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | 山羊抗小鼠；1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | 山羊抗小鼠；1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | 山羊抗小鼠；1:200 |
| OCT 包埋剂 | Sakura Finetek | 4583 | |
| 异戊烷 | Fisher Scientific | O3551-4 | 用液氮冷却 |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x，稀释至1x |
| Kim擦拭纸 | Kimberly-Clark | 06-666A |
参考文献
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