矢状面运动学步态分析可提供关于运动执行方式的高度精确信息。本文描述了这些技术在识别经受自身免疫介导脱髓鞘小鼠步态缺陷中的应用。这些方法也可用于表征其他具有运动功能障碍的小鼠模型的步态缺陷。
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方法文章
C57BL/6小鼠经MOG35-55诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎后的矢状面运动学步态分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
矢状面运动学步态分析常用于表征多发性硬化症（MS）患者的运动功能障碍。本文描述了这些技术在一种被称为实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的小鼠MS模型中识别步态异常的应用。通常采用临床评分量表来评估EAE小鼠的瘫痪和运动功能障碍，但该量表仅提供等级数据，难以反映运动障碍的具体特征。EAE疾病严重程度也可通过转棒实验来评估，该方法可衡量整体运动协调能力。相比之下，矢状面后肢运动学步态分析能够提供关于运动障碍方式的高度精确信息。本方法通过在小鼠后肢贴附反光标记点，使其在跑步机上行走时检测关节运动。利用运动分析软件记录行走过程中标记点的运动轨迹，并由此计算出运动学步态参数。本文展示了如何利用这些步态参数定量分析EAE小鼠髋关节、膝关节和踝关节的运动受损情况。这些技术可用于更深入理解疾病机制，并为MS及其他影响运动功能的神经退行性疾病寻找潜在治疗方法。
引言
步态是一系列用于实现运动的肢体重复性动作。步态由步态周期组成，每个周期可分为两个时相：支撑相，即足部在地面上向后移动以推动身体向前；以及摆动相，此时足部离开地面并向前移动。步态异常是多种神经退行性疾病（如脊髓损伤（SCI）、多发性硬化（MS）、肌萎缩侧索硬化（ALS）、帕金森病（PD）和脑卒中）的典型特征；这些疾病的临床前啮齿类动物模型通常能够重现相应的步态功能障碍1。小鼠运动基本调控机制已被广泛深入研究2,3。此外，已有多种人类神经系统疾病的小鼠模型4。因此，对小鼠进行步态分析是一种有效的手段，可用于测量具有明确解剖学基础的多种运动功能缺陷。在小鼠模型中开展步态研究，有助于揭示神经退行性疾病中运动功能障碍的神经病理学基础，并有助于发现潜在的治疗方法。
已用于测量啮齿类动物步态的技术包括肉眼观察（例如，Basso 小鼠评分5和开放场地实验6）以及从腹侧平面分析步态7。近年来，测量后肢运动矢状面运动学的方法逐渐受到关注，因为这些方法能够提供更多关于运动执行的信息，因而对步态的细微变化更为敏感
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方案
本方案遵循加拿大动物护理委员会指南，并已获得戴尔豪斯大学实验室动物委员会批准。
1. 制作反射标记：
- 使用手持打孔器，从一张反光纸上打下所需数量的小圆片。每次记录每个动物需要5个标记点，其中2个大标记点和3个小标记点。
- 使用精细剪刀，从圆片边缘向中心做一条直线切割。
- 撕下标记点的纸背衬，露出粘性表面。用精细镊子牢固夹住标记点，用手指将其边缘向内弯曲，使其形成圆锥形。制作小标记点时，将圆锥卷得紧一些；制作大标记点时，将圆锥卷得松一些。
- 使用手持热熔胶枪，在圆锥形标记点内部填充胶水，同时用镊子夹住圆锥尖端，将标记点粘附到一块平整的纸板上。胶水可防止标记点在记录过程中塌陷或弯曲，以确保最佳的反光效果。待胶水干燥（约10分钟）后，用手术刀将标记点从纸板上取下（图1A）。
2. 准备用于记录的动物
- 使用异氟烷气体（2.5%；氧气流速2升/分钟）对小鼠进行麻醉2将小鼠放入诱导室中进行麻醉。小鼠失去意识后，将其置于循环水浴加热毯上方的鼻罩中。麻醉的目的是在标记物放置过程中固定小鼠；该操作不引起疼痛，因此无需评估麻醉深度。
- 双眼涂抹眼用润滑剂。
- 使用电动剪毛器剃除目标后肢的毛发。从踝关节开始，向上....
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结果
图1 是小鼠运动学步态分析流程的示意图。首先，制备反光标记物并将其放置于小鼠的5个解剖学标志点上。随后，当小鼠在跑步机上行走时，记录其步态。利用运动分析软件提取运动学数据，用于后续分析。
图2A-C展示了对照CFA小鼠在连续三次记录会话（间隔一周）中髋关节、膝关节和踝关节角度的步态周期。波形之间的重叠表明，第1至第3次会话的步态周期偏差极小。图2D-F展示了另一只对照CFA小鼠的步态周期，该小鼠在第1至第3次记录会话中表现出更大的行走变异性。尽管步态周期在y轴方向有所偏移，但各次记录之间的波形形状保持一致。此类变异性水平在小鼠行走中较为典型。
图3A-C 展示了EAE小鼠在连续三次记录会话中.......
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讨论
在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠中，测量运动功能障碍的两种最常用方法是临床评分和转棒实验中的跌落潜伏期27,28。这些技术存在若干局限性。尽管临床评分使用方便且应用广泛，但其仅能提供等级数据，即无法确定不同临床评分之间差异的具体程度。此外，临床评分无法精确反映运动功能障碍的具体特征。转棒实验在一定程度上弥补了临床评分的某些不足，但仅能评估总体运动协调能力，无法测量行走的特定方面。
相比之下，运动学步态分析能够提供关于运动特定方面的敏感指标，包括各个关节的活动范围和平均角度。在MOG35-55 EAE小鼠中，早在发病第9天（DPI9）即可检测到髋关节和膝关节运动的细微缺陷，比临床症状或转棒实验缺陷的出现提前约5至9天26。即使临床体征已完全缓解，这些缺陷仍持续存在，并且在未出现转棒实验缺陷的情况下亦可观察到26。重要的是，通过均方根差（RMS .......
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
我们感谢Sid Chedrawe在拍摄过程中提供的技术支持。本工作获得了加拿大多发性硬化症协会（资助号：EGID 2983）的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 相机 | Nikon | Nikon D750 | 用于拍摄视频 |
| 反光胶带 | B&L Engineering | MKR-Tape-2 | |
| 精细剪刀 | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| 镊子 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 热熔胶枪 | Craftsmart | E231647 | |
| 4号手术刀柄 | Roboz | R5-9884 | |
| 10号手术刀片 | Feather | 2020-12 | |
| C57BL/6小鼠 | Charles River Laboratories | ||
| 麻醉机 | EZ Anesthesia | EZ-AF9000 Auto Flow System | |
| 循环水加热毯 | Androit | HTP-1500 | |
| 局部眼用润滑剂 | Refresh | DIN00210889 | |
| 剃毛器 | Oster | 78997-010 | |
| 高速相机 | Fastec | Fastec IL3-100 | |
| 高功率光源 | Smith Victor Corporation | Model 700 SG (600 Watt quartz light, 120 Volts) | |
| 灯架 | Promaster | LS1 | |
| 跑步机 | 德国科隆大学动物学研究所定制 | ||
| Microsoft Excel 2016 | Microsoft | Version 2016 | |
| KinemaJ | Nicolas Stifani | 这是为 ImageJ 开发的一个脚本 | |
| KinemaR | Nicolas Stifani | 这是为 Rstudio 开发的一个脚本 | |
| Vicon Motus | Vicon Motus | Version 9.00 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.00 |
参考文献
- Giladi, N., Horak, F. B., Hausdorff, J. M. Classification of gait disturbances: distinguishing between continuous and episodic changes. Mov Disord. 28 (11), 1469-1473 (2013).
- Kiehn, O. Decoding the organization of spinal circuits that control locomotion.....
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重印与许可
