需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

C57BL/6小鼠经MOG35-55诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎后的矢状面运动学步态分析

8.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/56032

⸱

2017年11月4日

 ,  ,  ,  , 
1Pharmacology, Dalhousie University, 2Medical Neuroscience, Dalhousie University, 3Psychiatry, Dalhousie University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

矢状面运动学步态分析可提供关于运动执行方式的高度精确信息。本文描述了这些技术在识别经受自身免疫介导脱髓鞘小鼠步态缺陷中的应用。这些方法也可用于表征其他具有运动功能障碍的小鼠模型的步态缺陷。

摘要

矢状面运动学步态分析常用于表征多发性硬化症（MS）患者的运动功能障碍。本文描述了这些技术在一种被称为实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的小鼠MS模型中识别步态异常的应用。通常采用临床评分量表来评估EAE小鼠的瘫痪和运动功能障碍，但该量表仅提供等级数据，难以反映运动障碍的具体特征。EAE疾病严重程度也可通过转棒实验来评估，该方法可衡量整体运动协调能力。相比之下，矢状面后肢运动学步态分析能够提供关于运动障碍方式的高度精确信息。本方法通过在小鼠后肢贴附反光标记点，使其在跑步机上行走时检测关节运动。利用运动分析软件记录行走过程中标记点的运动轨迹，并由此计算出运动学步态参数。本文展示了如何利用这些步态参数定量分析EAE小鼠髋关节、膝关节和踝关节的运动受损情况。这些技术可用于更深入理解疾病机制，并为MS及其他影响运动功能的神经退行性疾病寻找潜在治疗方法。

引言

步态是一系列用于实现运动的肢体重复性动作。步态由步态周期组成，每个周期可分为两个时相：支撑相，即足部在地面上向后移动以推动身体向前；以及摆动相，此时足部离开地面并向前移动。步态异常是多种神经退行性疾病（如脊髓损伤（SCI）、多发性硬化（MS）、肌萎缩侧索硬化（ALS）、帕金森病（PD）和脑卒中）的典型特征；这些疾病的临床前啮齿类动物模型通常能够重现相应的步态功能障碍1。小鼠运动基本调控机制已被广泛深入研究2,3。此外，已有多种人类神经系统疾病的小鼠模型4。因此，对小鼠进行步态分析是一种有效的手段，可用于测量具有明确解剖学基础的多种运动功能缺陷。在小鼠模型中开展步态研究，有助于揭示神经退行性疾病中运动功能障碍的神经病理学基础，并有助于发现潜在的治疗方法。

已用于测量啮齿类动物步态的技术包括肉眼观察（例如，Basso 小鼠评分5和开放场地实验6）以及从腹侧平面分析步态7。近年来，测量后肢运动矢状面运动学的方法逐渐受到关注，因为这些方法能够提供更多关于运动执行的信息，因而对步态的细微变化更为敏感8,9,10,11。用于研究小鼠在跑台上行走时后肢在矢状面内运动的运动学技术9,12，已在脊髓损伤（SCI）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、创伤性皮质损伤、脑卒中和亨廷顿病的研究中得到广泛探讨8,9,10,11,13,14,15,16。相比之下，这些技术在多发性硬化小鼠模型运动功能障碍研究中的应用仍较为有限17。

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症（MS）最常用的小鼠模型18。诱导EAE的两种主要方法是主动免疫和被动接种。在主动EAE模型中，小鼠被接种髓鞘抗原，从而引发由自身反应性T细胞介导的神经炎症和脊髓及小脑的脱髓鞘。而被动EAE则是通过将患有主动EAE的小鼠体内的自身反应性T细胞转移至未致敏小鼠体内来诱导19。如其他文献所述，疾病进程和神经病理学特征受到中枢神经系统（CNS）抗原类型和小鼠品系的影响20,21,22,23,24,25。在EAE实验中，对照组小鼠仅注射不含髓鞘抗原的完全弗氏佐剂（CFA）。EAE的特征为进行性上升性瘫痪，起始于尾部无力，可能累及前肢，导致共济失调和瘫痪20。我们近期对接受髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55（MOG35-55）诱导EAE的C57Bl/6小鼠的步态变化进行了表征。这些研究表明，步态分析优于传统的行为学分析，因为踝关节运动偏离正常值的程度与EAE小鼠腰段脊髓白质丢失程度高度相关26。相比之下，白质丢失与另外两种传统行为学指标（临床评分和转棒实验）之间的相关性则弱得多26。

本文描述了利用运动学步态分析来检测在跑轮上行走的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠矢状面内的运动功能障碍。在后肢放置五个反光标记点，以识别高速视频记录中髋关节、膝关节和踝关节的运动。使用运动分析软件提取关节活动范围的运动学数据。本文讨论了这些技术在MOG35-55诱导的EAE模型中量化运动功能障碍的应用价值。这些技术也可用于研究其他神经退行性疾病小鼠模型的步态异常。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本方案遵循加拿大动物护理委员会指南，并已获得戴尔豪斯大学实验室动物委员会批准。

1. 制作反射标记：

  1. 使用手持打孔器，从一张反光纸上打下所需数量的小圆片。每次记录每个动物需要5个标记点，其中2个大标记点和3个小标记点。
  2. 使用精细剪刀，从圆片边缘向中心做一条直线切割。
  3. 撕下标记点的纸背衬，露出粘性表面。用精细镊子牢固夹住标记点，用手指将其边缘向内弯曲，使其形成圆锥形。制作小标记点时，将圆锥卷得紧一些；制作大标记点时，将圆锥卷得松一些。
  4. 使用手持热熔胶枪，在圆锥形标记点内部填充胶水，同时用镊子夹住圆锥尖端，将标记点粘附到一块平整的纸板上。胶水可防止标记点在记录过程中塌陷或弯曲，以确保最佳的反光效果。待胶水干燥（约10分钟）后，用手术刀将标记点从纸板上取下（图1A）。

2. 准备用于记录的动物

  1. 使用异氟烷气体（2.5%；氧气流速2升/分钟）对小鼠进行麻醉2将小鼠放入诱导室中进行麻醉。小鼠失去意识后，将其置于循环水浴加热毯上方的鼻罩中。麻醉的目的是在标记物放置过程中固定小鼠；该操作不引起疼痛，因此无需评估麻醉深度。
  2. 双眼涂抹眼用润滑剂。
  3. 使用电动剪毛器剃除目标后肢的毛发。从踝关节开始，向上延伸至脊柱及肋骨下缘；确保无残留毛发，以免影响标记物的粘附。
    注：此处记录的是右后肢；但任一后肢均可使用。
  4. 用永久性记号笔标记髂嵴和髋关节的位置。髂嵴位于肋骨下缘稍下方，通过将小鼠身体下方的膝盖并拢即可轻松触诊。
    注：可通过屈曲和伸展腿部来确定骨盆与股骨之间的关节点，从而找到髋关节。
  5. 使用精细镊子夹住尖端 small 标记物，并将其底部浸入速干胶或等效替代胶中。将标记物置于第四趾末端，保持 2-3 秒，使胶水干燥。以相同方法，将另外两个小标记物分别置于跖趾关节和踝关节处图1B).
  6. 位置 大 髂嵴和髋关节上的标记点图1B）的方式与小标记物相同。
  7. 将小鼠从鼻罩中取出，立即使用转移笼将其转移至记录室。将小鼠放置于静止的跑步机上，使其从麻醉中完全恢复。

3. 步态记录

  1. 在记录小鼠步态之前，先拍摄一张位于跑台上的已知尺寸校准块的照片。
    注意：这将使视频中的像素能够转换为实际测量值。相机应放置在距离跑步机约120 cm处。
    1. 将相机置于与跑步机相同高度和水平的位置。在采集校准图像后的所有录制过程中，保持相机位置不变。
  2. 小鼠从麻醉中完全恢复后，将跑步机调至低速（5 cm/s），使小鼠开始行走。确保跑步机传送带的运行方向使小鼠身上的标记朝向相机。
  3. 逐渐将跑步机速度增加至 20 cm/s；此速度适用于大多数健康小鼠保持稳定的步态。
    注意：尽管让所有小鼠以相同速度行走是最理想的情况，但有些小鼠可能无法持续达到该速度。
    1. 如果小鼠无法以 20 cm/s 的速度行走，应根据需要降低速度，并务必记录此情况。逐步降低跑步机速度，直至获得稳定的步态周期。
      注意：后续数据分析可校正速度差异。
  4. 小鼠稳定行走后开始录像（即以稳定的速度行走，不后仰或左右摇摆）。持续记录，直至采集到 8 到 12 个连续的步态周期。每段视频均需记录 treadmill 的速度以及所记录小鼠的侧边。
  5. 记录完成后，关闭跑步机并将小鼠放回笼中。每次记录之间需彻底清洁跑步机，因为先前小鼠留下的气味可能影响后续小鼠的行为。为减少应激和皮肤损伤，不要移除标记物；让小鼠自行脱落。

4. 分析

  1. 使用运动分析软件处理视频。
    注意：在我们的实验中，使用了由 Dr. Nicolas Stifani 编写的、专为成像和统计软件设计的自定义脚本（参见材料表）。以下步骤均通过所选的运动分析软件完成。
    1. 从视频中提取标记点的像素坐标，并利用校准视频将像素值转换为厘米，计算每一帧中的关节角度。
    2. 确定每个步态周期的起始和结束时间，从而获得步态持续时间和步长信息。
    3. 将步态周期的持续时间归一化为 200 个归一化帧，使摆动相和支撑相分别由 100 个帧表示。
  2. 基于归一化帧，使用电子表格软件计算用于数据分析的运动学参数（参见材料表）。
    1. 为确定某一特定关节的平均角度，取归一化帧内所有角度的均值，公式如下：
      figure-protocol-1
      注意：此处 x 表示在给定归一化帧中的角度值，n 表示归一化帧的编号。
    2. 为确定某只小鼠特定关节的运动范围，用一组归一化帧中的最大角度减去最小角度，公式如下：
      运动范围 = Anglemaximum - Angleminimum。
      注意：此处 Anglemaximum 和 Angleminimum 分别表示在归一化步态周期内达到的最大和最小角度。
    3. 为计算均方根（RMS）差值，首先将每个实验时间点的平均角度减去基线记录的平均角度；然后对每个差值进行平方，计算所有平方值的均值，并对均值取平方根。公式如下：
      figure-protocol-2
      注意：此处 figure-protocol-3 表示基线记录的平均角度；y 表示每个实验时间点的平均角度；n 表示归一化帧的数量。均方根差（RMS difference）是一种用于评估步态相对于基线记录偏离程度的测量指标。
  3. 使用科学绘图和统计软件对数据进行分析和展示（参见材料表）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

图1 是小鼠运动学步态分析流程的示意图。首先，制备反光标记物并将其放置于小鼠的5个解剖学标志点上。随后，当小鼠在跑步机上行走时，记录其步态。利用运动分析软件提取运动学数据，用于后续分析。

图2A-C展示了对照CFA小鼠在连续三次记录会话（间隔一周）中髋关节、膝关节和踝关节角度的步态周期。波形之间的重叠表明，第1至第3次会话的步态周期偏差极小。图2D-F展示了另一只对照CFA小鼠的步态周期，该小鼠在第1至第3次记录会话中表现出更大的行走变异性。尽管步态周期在y轴方向有所偏移，但各次记录之间的波形形状保持一致。此类变异性水平在小鼠行走中较为典型。

图3A-C 展示了EAE小鼠在连续三次记录会话中...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠中，测量运动功能障碍的两种最常用方法是临床评分和转棒实验中的跌落潜伏期27,28。这些技术存在若干局限性。尽管临床评分使用方便且应用广泛，但其仅能提供等级数据，即无法确定不同临床评分之间差异的具体程度。此外，临床评分无法精确反映运动功能障碍的具体特征。转棒实验在一定程度上弥补了临床评分的某些不足，但仅能评估总体运动协调能力，无法测量行走的特定方面。

相比之下，运动学步态分析能够提供关于运动特定方面的敏感指标，包括各个关节的活动范围和平均角度。在MOG35-55 EAE小鼠中，早在发病第9天（DPI9）即可检测到髋关节和膝关节运动的细微缺陷，比临床症状或转棒实验缺陷的出现提前约5至9天26。即使临床体征已完全缓解，这些缺陷仍持续存在，并且在未出现转棒实验缺陷的情况下亦可观察到26。重要的是，通过均方根差（RMS ...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

我们感谢Sid Chedrawe在拍摄过程中提供的技术支持。本工作获得了加拿大多发性硬化症协会（资助号：EGID 2983）的资金支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
相机NikonNikon D750用于拍摄视频
反光胶带B&L EngineeringMKR-Tape-2
精细剪刀Fine Science Tools15023-10
镊子Fine Science Tools11252-20
热熔胶枪CraftsmartE231647
4号手术刀柄RobozR5-9884
10号手术刀片Feather2020-12
C57BL/6小鼠Charles River Laboratories
麻醉机EZ AnesthesiaEZ-AF9000 Auto Flow System
循环水加热毯AndroitHTP-1500
局部眼用润滑剂RefreshDIN00210889
剃毛器Oster78997-010
高速相机FastecFastec IL3-100
高功率光源Smith Victor CorporationModel 700 SG (600 Watt quartz light, 120 Volts)
灯架PromasterLS1
跑步机德国科隆大学动物学研究所定制
Microsoft Excel 2016MicrosoftVersion 2016
KinemaJNicolas Stifani这是为 ImageJ 开发的一个脚本
KinemaRNicolas Stifani这是为 Rstudio 开发的一个脚本
Vicon MotusVicon MotusVersion 9.00
GraphPad PrismGraphPadVersion 6.00

参考文献

  1. Giladi, N., Horak, F. B., Hausdorff, J. M. Classification of gait disturbances: distinguishing between continuous and episodic changes. Mov Disord. 28 (11), 1469-1473 (2013).
  2. Kiehn, O. Decoding the organization of spinal circuits that control locomotion. Nat Rev Neurosci. 17 (4), 224-238 (2016).
  3. Akay, T., Tourtellotte, W. G., Arber, S., Jessell, T. M. Degradation of mouse locomotor pattern in the absence of proprioceptive sensory feedback. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16877-16882 (2014).
  4. Hafezparast, M., Ahmad-Annuar, A., Wood, N. W., Tabrizi, S. J., Fisher, E. M. Mouse models for neurological disease. Lancet Neurol. 1 (4), 215-224 (2002).
  5. Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
  6. Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785(2014).
  7. Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. J Neurosci Methods. 206 (1), 7-14 (2012).
  8. Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behav Brain Res. 311, 340-353 (2016).
  9. Leblond, H., L'Esperance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. J Neurosci. 23 (36), 11411-11419 (2003).
  10. Ueno, M., Yamashita, T. Kinematic analyses reveal impaired locomotion following injury of the motor cortex in mice. Exp Neurol. 230 (2), 280-290 (2011).
  11. Zorner, B., et al. Profiling locomotor recovery: comprehensive quantification of impairments after CNS damage in rodents. Nat Methods. 7 (9), 701-708 (2010).
  12. Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. J Neurosci Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
  13. Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
  14. Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
  15. Taylor, T. N., Greene, J. G., Miller, G. W. Behavioral phenotyping of mouse models of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 211 (1), 1-10 (2010).
  16. Chen, K., et al. Differential Histopathological and Behavioral Outcomes Eight Weeks after Rat Spinal Cord Injury by Contusion, Dislocation, and Distraction Mechanisms. J Neurotrauma. 33 (18), 1667-1684 (2016).
  17. de Bruin, N. M., et al. Multiple rodent models and behavioral measures reveal unexpected responses to FTY720 and DMF in experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 300, 160-174 (2016).
  18. Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
  19. Emerson, M. R., Gallagher, R. J., Marquis, J. G., LeVine, S. M. Enhancing the ability of experimental autoimmune encephalomyelitis to serve as a more rigorous model of multiple sclerosis through refinement of the experimental design. Comp Med. 59 (2), 112-128 (2009).
  20. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  21. Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (5), e224(2007).
  22. Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
  23. Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778(2012).
  24. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).
  25. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).
  26. Fiander, M. D., Stifani, N., Nichols, M., Akay, T., Robertson, G. S. Kinematic gait parameters are highly sensitive measures of motor deficits and spinal cord injury in mice subjected to experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 317, 95-108 (2017).
  27. Jones, M. V., et al. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).
  28. van den Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
  29. Sasaki, M., Lankford, K. L., Brown, R. J., Ruddle, N. H., Kocsis, J. D. Focal experimental autoimmune encephalomyelitis in the Lewis rat induced by immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein and intraspinal injection of vascular endothelial growth factor. Glia. 58 (13), 1523-1531 (2010).
  30. Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129 (Pt 8), 1972-1983 (2006).
  31. Franco-Pons, N., Torrente, M., Colomina, M. T., Vilella, E. Behavioral deficits in the cuprizone-induced murine model of demyelination/remyelination. Toxicol Lett. 169 (3), 205-213 (2007).
  32. Goldberg, N. R., Hampton, T., McCue, S., Kale, A., Meshul, C. K. Profiling changes in gait dynamics resulting from progressive 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced nigrostriatal lesioning. J Neurosci Res. 89 (10), 1698-1706 (2011).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

矢状面运动后肢关节角度反射标记点放置跑步机行走记录运动分析软件髋膝踝角度步态周期波形运动功能障碍量化
C57BL/6小鼠经MOG35-55诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎后的矢状面运动学步态分析
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。