本文介绍了一种利用共聚焦显微镜对小鼠继发性腭融合过程进行活体成像的实验方案。该方案可与多种荧光报告小鼠品系及信号通路抑制剂联合使用，以获得机制性见解。本方案亦可适用于其他发育系统的活体成像研究。
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本文内容
摘要
摘要
继发性腭板的融合以形成完整的继发性腭是哺乳动物发育过程中的关键事件，该过程若受到干扰，可导致继发性腭裂，这是人类常见的先天性畸形之一。继发性腭融合已被广泛研究，由此提出了多种可能介导该过程的细胞机制。然而，这些研究大多是在发育过程中不同时间点获取的固定胚胎组织上进行的，或基于在固定时间点分析的离体培养组织，属于静态观察。由于腭融合是一种动态形态发生过程，静态分析在研究此类动态过程时存在局限性，目前对介导腭融合的具体动态细胞行为仍了解不足。本文介绍一种活体成像方案，用于 离体 小鼠胚胎次级腭融合。为了研究腭融合过程中的细胞行为，采用上皮细胞特异性 Keratin14-cre 用于标记腭上皮细胞 ROSA26-mTmGflox 报告基因胚胎。为了可视化丝状肌动蛋白， Lifeact-mRFPruby 报告基因小鼠被用于实验。通过分离胚胎第14.5天（E14.5）阶段刚发生黏附的继发性腭突，并将其培养在含琼脂糖的培养基中，置于玻璃底培养皿内，从而利用倒置共聚焦显微镜对继发性腭融合过程进行活体成像。利用该方法，我们检测到继发性腭融合过程中多种新的细胞行为。深入理解不同细胞行为在时空上的协调机制，对于揭示这一动态形态发生过程具有重要意义。本实验方案可应用于基因突变小鼠品系，或经药物抑制剂处理的培养样本，以进一步推动对继发性腭融合调控机制的研究。
引言
组织融合是多个器官发育过程中的重要步骤。唇裂和腭裂、脊柱裂以及心脏畸形等主要的人类先天性出生缺陷，均可能由组织融合缺陷导致1。小鼠继发性腭融合已被广泛研究，以揭示发育过程中调控组织融合的细胞与分子机制2,3,4。在小鼠中，继发性腭的发育始于约E11.5时期，此时两侧上颌突分别向外生长形成继发性腭突。腭突最初沿舌侧垂直生长，直至约E14.0时期，此时腭突发生抬升并转为水平方向位于舌上方。随后向内侧方向的生长导致两侧腭突的上皮相互接触，在E14.5时期形成中线表皮缝（MES）。在继发性腭突之间存在的MES必须被清除，以便在E15.5时期实现间充质的融合，从而形成完整且完全闭合的继发性腭3。
两个独立的腭突之间如何形成共有的上皮MES细胞层，随后又如何将其去除以实现间充质的融合，一直是腭发育研究中的核心问题。根据小鼠组织学和电子显微镜（EM）研究、外植体培养研究以及功能性小鼠遗传学实验，该过程涉及多种基本的细胞行为。每个腭突内侧边缘上皮（MEE）伸出的类似丝状伪足的突起有助于初始接触5,6，随后这些上皮细胞嵌入到....
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方案
所有动物实验均按照加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会的方案进行。
1. 活体成像培养基的制备
- 液体培养基的制备
- 在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）/F12 培养基中加入 20% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、200 µg/mL L-抗坏血酸和 15 mM HEPES。
注意：活细胞成像培养基需在成像前新鲜配制。该培养基含有酚红，长时间活细胞成像过程中可能引起光毒性。改用不含酚红的培养基可能改善长期成像效果。
- 在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）/F12 培养基中加入 20% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、200 µg/mL L-抗坏血酸和 15 mM HEPES。
- 低熔点琼脂糖溶液的制备
- 将 350 mg 低熔点琼脂糖溶解于 10 mL 经高压灭菌的蒸馏水中，配制成 3.5% 的储备液。
- 充分混匀琼脂糖溶液，并在 70 °C 水浴中孵育，使其完全溶解。
- 在加入活细胞成像培养基前，将琼脂糖溶液置于 37 °C 水浴中冷却。
- 将 1 mL 琼脂糖储备液加入 5 mL 液体活细胞成像培养基中，得到终浓度为 0.6% 的溶液。
- 将含琼脂糖的培养基置于 37 °C 水浴中保温，以防止提前凝固。
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结果
腭突外植体培养的活体成像揭示了介导腭融合的多种细胞过程6。两个上皮细胞之间的初始接触由细胞膜突起介导（图2B-2E）。当两层上皮相遇时，首先形成多细胞层的中缝上皮结构（MES），随后通过上皮汇聚过程发生细胞交错，最终整合为单层上皮的MES（图2A-2E 和 图2K-2O）。位于更深Z层面的上皮细胞也逐渐被移向MES的口腔侧，从而参与上皮汇聚过程（图2K）。在腭中部的MES中还观察到细胞向后方迁移的现象（图2F-2J）。此外，我们在腭融合过程中发现了上皮细胞外排事件.......
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讨论
活体成像结合三维器官外植体培养可提供有关细胞过程的详细信息，这些信息无法通过传统固定组织切片的染色分析获得。利用 体外 小鼠胚胎继发性腭外植体培养中，我们观察到多种有趣的细胞行为，由此提出一种涉及上皮汇聚与细胞挤出的腭融合新机制。
此类研究中的一个常见挑战是长时间连续激光激发导致的荧光漂白。在本研究中，我们使用了白光共聚焦显微镜和转盘共聚焦显微镜。成像软件（LAS-AF）中的漂白校正功能可在一定程度上校正随时间推移出现的信号强度下降（方案4.1）。由于漂白校正能力有限，因此在每种成像系统中仔细优化激光功率和曝光时间至关重要。我们还验证了在活体成像培养基中培养3天后，腭部融合过程仍能正常进行6。
活体成像中的另一个常见问题是组织漂移。在活体成像过程中，最小化漂移至关重要，因为焦平面的变化可能干扰对形态发生动态变化的准确理解。虽然许多共聚焦显微镜可通过控制热漂移来部分解决该问题（例如显微镜中的“定焦系统”），但组织相对于玻璃底的位移无法通过这些方法校正。使用琼脂糖以.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 M. Douglas Benson 在关于次级腭成像的初步讨论中提供的帮助。同时感谢 David Castaneda-Castellanos（Leica）和 Chris Rieken（Zeiss）在共聚焦显微镜成像条件调整方面提供的协助。我们感谢 Lynsey Hamilton（Bitplane）在使用 Imaris 软件进行定量图像分析方面的有益建议。本研究由美国国立卫生研究院/国家牙科与颅面研究所（NIH/NIDCR）R01 DE025887 项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂 | |||
| DMEM/F12 | 生命科技 | 11330-032 | |
| 胎牛血清 | 生命科技 | 16000-044 | |
| L-谷氨酰胺 | 生命科技 | 25030-081 | |
| L-抗坏血酸 | Sigma | A4544-100G | |
| 青霉素/链霉素 | 生命科技 | 15140-122 | |
| 低熔点琼脂糖 | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35 mm 玻璃底培养皿 | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| 凡士林（Vaseline） | Sigma | 16415-1Kg | |
| <强>小鼠 | |||
| 角蛋白14-cre | MGI: J:65294 | 等位基因 = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | 等位基因 = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | 等位基因 = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| <强>显微镜 | |||
| 白光SP5共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer 转盘共聚焦显微镜 | 蔡司显微镜 |
参考文献
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birt....
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