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用于核小体密度分析的天然染色质免疫沉淀测序文库的构建

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DOI：

10.3791/56085

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2017年12月12日

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1Department of Microbiology and Immunology, Michael Smith Laboratories Centre for High-Throughput Biology, University of British Columbia, 2Canada's Michael Smith Genome Science Center, BC Cancer Agency

本文内容

摘要

我们提出一种改进的天然染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）方法，用于生成适用于核小体密度ChIP-seq分析框架的序列数据集，该框架整合了微球菌核酸酶（MNase）可及性与组蛋白修饰检测。

摘要

我们介绍了一种改进的天然染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）实验方案，该方案与基于高斯混合分布的分析方法（核小体密度 ChIP-seq；ndChIP-seq）兼容，能够实现全基因组范围内微球菌核酸酶（MNase）可及性与组蛋白修饰的联合检测。核小体的位置和局部密度，以及其组蛋白亚基的翻译后修饰，共同协作调控局部转录状态。ndChIP-seq 生成的核小体可及性与组蛋白修饰的联合测量数据，可同时解析这些特征。ndChIP-seq 方法适用于数量较少且无法使用交联依赖型 ChIP-seq 协议的原代细胞。综上所述，ndChIP-seq 能够在罕见原代细胞群体中，结合局部核小体密度对组蛋白修饰进行检测，从而深入揭示调控 RNA 转录的共有机制。

引言

真核生物基因组通过重复的核小体结构被包装成染色质，每个核小体由两份拷贝的四种组蛋白（例如，H2A、H2B、H3 和 H4）以及缠绕在其周围的146个碱基对的DNA组成1,2。染色质重塑复合物可调控基因启动子区域内的核小体位置，并通过改变DNA对转录因子和RNA聚合酶复合物的可接近性，参与基因表达的调控3,4。

核小体中组蛋白的氨基末端尾部会经历多种共价修饰，包括特异性氨基酸的乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化、甲酰化和羟基化5,6,7,8。这些修饰的位置和程度决定了染色质的状态，从而影响染色质结构，并调控分子复合物对转录激活区域的可及性7。鉴于核小体密度和组蛋白修饰均在基因转录的局部调控中发挥作用，我们开发了一种天然染色质免疫沉淀（ChIP）方法，可同时检测核小体密度和组蛋白修饰水平9,10。

天然染色质免疫沉淀测序（Native ChIP-seq）利用微球菌核酸酶（MNase）在细胞核内以其天然状态消化完整的染色质11,12，这一特性已被用于绘制核小体定位图谱13,14,15。核小体密度ChIP-seq（ndChIP-seq）则利用MNase优先进入染色质开放区域的特性，生成结合了MNase可及性与组蛋白修饰信息的测量数据10。ndChIP-seq适用于稀有原代细胞、组织以及培养细胞中组蛋白修饰的分析。本文提供了一项详细实验方案，可用于生成适用于先前所描述分析框架的测序数据集10，该框架通过成对末端测序读段边界确定免疫沉淀后DNA片段大小，从而同时研究MNase可及性与组蛋白修饰状态。此前，将该方案应用于10,000个来源于人脐带血的原代CD34+细胞及人胚胎干细胞时，揭示了这些细胞类型中染色质结构与组蛋白修饰之间的独特关系10。由于ndChIP-seq能够同时测量核小体可及性和组蛋白修饰，因此可在单个核小体水平上揭示细胞群体中的表观基因组特征，并将异质性信号解析为其组成成分。ndChIP-seq对细胞异质群体进行探索的一个实例是双价启动子的研究，即在同一启动子区域同时存在H3K4me3（一种激活标记）和H3K27me3（一种抑制标记）的现象10。

方案

注意：本方案每单次免疫沉淀（IP）反应所需的最低细胞输入量为 10,000 个细胞。打印所提供的实验工作表，并将其作为规划实验的参考指南。未特别说明时，室温孵育默认为 ~22 °C。所有缓冲液配方详见表 1。所有缓冲液应于 4 °C 保存，并在实验过程中置于冰上，除非另有说明。

1. 细胞准备

  1. 培养的细胞
    1. 用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并使用血细胞计数板准确测定细胞浓度。如果细胞数量超过一百万个，则增加 PBS 的体积。
    2. 根据细胞计数结果，将相当于 70,000–100,000 个细胞的样品分装至无菌 1.5 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 6 分钟。使用移液器缓慢吸除并弃去上清液（避免扰动细胞沉淀），然后将沉淀重悬于预冷的裂解缓冲液 + 1× 蛋白酶抑制剂混合物（PIC）中，调整至 1,000 个细胞/µL 的浓度。通过上下吹打 20–30 次充分混匀。必须确保细胞团块被完全分散，尽量避免产生气泡。
    3. 立即进入 ndChIP-seq 实验方案的第 1 天（第 2 节），或将细胞沉淀在液氮中速冻后于 -80 °C 保存。
  2. 分选的细胞
    1. 将 70,000–100,000 个分选后的16细胞收集到含有 350 µL Hank's 平衡盐溶液（HBSS）或含 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS 的 1.5 mL 管中。
    2. 在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 6 分钟，收集每份细胞样品。使用移液器缓慢吸除上清液（避免扰动细胞沉淀），然后将沉淀重悬于预冷的裂解缓冲液 + 1× PIC 中，最终浓度为 1,000 个细胞/µL。通过上下吹打 20–30 次充分混匀裂解缓冲液，确保细胞团块完全分散。尽量避免产生气泡。
    3. 立即进入 ndChIP-seq 实验方案的第 1 天（第 2 节），或将细胞沉淀在液氮中速冻后于 -80 °C 保存。

2. 第1天：ndChIP-seq

  1. 抗体-磁珠复合物的制备
    1. 准备一个37 °C水浴和一个装有冰的冰桶。在冰上操作，配制1x免疫沉淀缓冲液/1x蛋白酶抑制剂混合物（1x IP buffer/1x PIC）以及1x抗体（Ab）稀释缓冲液，并置于冰上保存。取出蛋白A（或G）磁珠（参见 讨论 从4 °C保存条件下取出（用于选择标准），并轻轻脉冲式涡旋充分混匀。保持在冰上。
      注意：脉冲涡旋是指每次试管中形成完整涡流时即停止涡旋。
    2. 每个免疫沉淀反应取24 µL Protein A（或G）磁珠，转移至新的2 mL离心管中。记录磁珠体积，并将管子置于冰上。例如，进行7个免疫沉淀反应时，使用24 µL × 7 = 168 µL。
    3. 将试管置于试管磁架上，等待溶液变澄清，以表明磁珠已分离。在不扰动磁珠的情况下，小心使用移液器吸除上清液并弃去。从试管磁架上取下试管，置于冰上。
    4. 加入等体积的即，加入含有1×蛋白酶抑制剂混合物（PIC）的冰冷免疫沉淀缓冲液，体积等于初始珠体积。用移液器轻柔吹打混匀，切勿涡旋震荡。
    5. 将IP缓冲液+1×PIC+磁珠放回管磁架上，静置直至溶液变澄清，表明磁珠已分离。在不扰动磁珠的情况下，用移液器小心吸去上清液并弃去。用预冷的IP缓冲液+1×PIC再洗涤两次，共洗涤3次。
    6. 最后一次洗涤后，将珠子重悬于等体积的溶液中（即，加入含有1×蛋白酶抑制剂混合物（PIC）的冰冷免疫沉淀缓冲液，体积等于初始珠体积。用移液器轻柔吹打混匀，禁止涡旋振荡。将离心管置于冰上保存。
    7. 在冰上，将10 mL IP缓冲液 + PIC加入25 mL V型储液槽中。使用多通道移液器，将130 µL预冷的IP缓冲液 + 1x PIC混合液加入洁净的V底96孔板的各个孔中，每孔用于一次免疫沉淀。每孔对应一个IP样品。标记该孔板为 "Ab-珠复合物".
    8. 向每孔含有 IP 缓冲液 + PIC 的溶液中加入 12 µL 洗涤后的 Protein A（或 G）磁珠，用移液器吹打混匀。将剩余的洗涤磁珠置于冰上保存。
    9. 从冷藏保存处取出经验证的抗体，如有需要，置于冰上解冻。在冰上操作，用1×抗体稀释缓冲液将抗体稀释至所示浓度 表2.
    10. 向Ab-bead复合物板的每个孔中加入1 µL适当稀释的抗体（表1）。记录孔板与抗体对应的编号。使用多通道移液器，通过上下吹打20次混匀每一行，每行之间更换吸头。用铝制板盖将抗体-磁珠复合物板密封严实，置于4 °C旋转平台上孵育至少2小时。
      注意：此孵育步骤可一直进行，直至准备开始步骤 2.4。
  2. 细胞裂解与染色质消化
    1. 在冰上操作，配制 1× 裂解缓冲液 + 1× 蛋白酶抑制剂混合物（PIC），以及 1 mL MNase I 稀释缓冲液表3）并置于冰上保存。
    2. 从 -80 °C 保存处（或冰上，若为新鲜制备）取出细胞沉淀。将每个细胞沉淀在 37 °C 水浴中解冻 10 s，然后转移至冰上。
    3. 向每份细胞沉淀中立即加入预冷的1×裂解缓冲液和1×蛋白酶抑制剂混合物（PIC），使终浓度为10,000个细胞/20 µL，用移液器轻柔吹打10次混匀，避免产生气泡。例如，对于70,000个细胞，终体积为140 µL。
    4. 在冰上操作，将所得裂解液每孔20 µL分装至96孔板中。用塑料封膜封板，置于冰上孵育20分钟。标记该板 "MNase 消化" 并根据模板记录各孔位置。为确保染色质消化反应时间的精确性，每次消化处理的样本不得超过两行。
    5. 在裂解即将完成前20分钟，用MNase I稀释缓冲液将MNase I酶稀释至终浓度为20 U/µL，并置于冰上保存。
    6. 在冰上操作，根据以下步骤配制MNase I消化主混合液 表 4 将混合液按每排样本20 µL分装，并额外加入5 µL死体积，置于96孔储液板的一排中，置于冰上保存。若为两排样本，总体积应为：(20 µL × 2) + 5 µL = 45 µL。
    7. 裂解液完成孵育后，将MNase消化板从冰上取出。使用多通道移液器，向每排样品中加入20 µL MNase I消化主混合液，通过上下吹打10次混匀。每排之间更换吸头。室温下准确孵育5分钟。
    8. 5分钟后，为终止反应，使用多通道移液器向每排样品中加入6 µL 250 µM的乙二胺四乙酸（EDTA），并上下吹打数次混匀。每排之间更换吸头。加入EDTA后，将移液器设定为20 µL，上下吹打10次以确保消化反应完全终止。每排之间更换吸头。
    9. 使用多通道移液器，向MNase消化样品的每行中加入6 µL 10x裂解缓冲液，通过上下吹打10次充分混匀。用塑料封膜封板，置于冰上孵育15分钟。
  3. 输入分离与预清除
    1. 孵育15分钟后，在冰上操作，将相同细胞沉淀/模板的所有孔合并至一个无菌的、预先在冰上预冷的1.5 mL离心管中（预先标记模板编号），并使用移液器缓慢而充分地混匀，避免去垢剂产生泡沫。
    2. 对于每个细胞沉淀/模板，将8 µL消化后的染色质转移至一个新的无菌0.5 mL离心管中（预先标记模板编号），并于4 °C保存过夜。此样品将作为输入对照。
    3. 将消化后的染色质剩余体积分装至新的96孔板中，每孔48 µL。细胞沉淀/模板1加入A01-A06孔，细胞沉淀/模板2加入A07-A12孔。 等等记录各孔对应的模板编号，并标记培养板 "预清除".
    4. 使用多通道移液器，向2.3.3步骤中的预清除板每孔加入120 µL 1x IP缓冲液 + 1x蛋白酶抑制剂混合物（PIC）以及12 µL经洗涤的Protein A（或G）磁珠。通过上下吹打10次混匀每一排，每排之间更换吸头。用铝制板封膜将板密封严实，于4 °C在旋转平台上孵育至少2小时。
  4. 免疫沉淀反应
    1. 开始此步骤前，请确保抗体-磁珠复合物板（步骤 2.1.10）和预清除板（步骤 2.3.4）均已孵育至少 2 小时。将两块板短暂离心，200 × g 离心 10 秒。
    2. 将抗体-磁珠复合物平板（来自步骤 2.1.10）置于平板磁架上，静置 15 秒，直至溶液变澄清。用移液器小心吸除并弃去上清液，避免扰动磁珠。从平板磁架上取下平板，置于冰上保存。
    3. 将预清除反应板（来自步骤 2.3.4）置于磁板架上，静置 15 秒，使磁珠完全吸附并使溶液澄清。用移液器小心吸取上清液，避免扰动磁珠，转移至置于冰上的对应抗体-磁珠复合物板的相应孔中，通过上下轻柔吹打混匀 15 次。用铝制封板膜密封反应板，置于 4 °C 旋转平台上孵育过夜（12–18 小时）。重新标记该板 "免疫沉淀反应".

3. 第2天：ndCHIP-seq

  1. 洗涤与洗脱
    1. 将加热混匀仪设置为 65 °C。在冰上配制低盐洗涤缓冲液和高盐洗涤缓冲液。将步骤 2.4.3 中的免疫沉淀（IP）反应板在 200 × g 条件下短暂离心 10 秒。
    2. 将 IP 反应板置于板式磁架上，静置 15 秒，待溶液变澄清。使用多通道移液器，小心吸除并弃去上清液，避免扰动磁珠。将反应板从磁架上取下，放回冰上。
    3. 向 IP 反应板中每排样品加入 150 µL 冰冷的低盐洗涤缓冲液，缓慢上下吹打 10 次，充分重悬磁珠。
    4. 将 IP 反应板再次放回板式磁架，等待磁珠分离后，使用多通道移液器小心吸除并弃去上清液，避免扰动磁珠。将反应板放回冰上，重复步骤 3.1.3 和 3.1.4，共完成 2 次洗涤。
    5. 在冰上向 IP 反应板中每排样品加入 150 µL 高盐洗涤缓冲液，通过上下吹打 10 次，缓慢混匀，充分重悬磁珠。
    6. 将 IP 反应板再次放回板式磁架，等待磁珠分离后，使用多通道移液器小心吸除并弃去上清液，避免扰动磁珠。将 IP 反应板放回冰上，并在其旁预冷一个新的 96 孔板。
    7. 向 IP 反应板中每排样品加入 150 µL 高盐洗涤缓冲液，缓慢上下吹打 10 次以充分重悬磁珠。重悬后，将每排样品转移至新的预冷 96 孔板的对应排中。将该板标记为 "IP reaction"，弃去旧板。
    8. 将新的 IP 反应板置于板式磁架上，等待磁珠分离。使用多通道移液器，小心吸除并弃去上清液，避免扰动磁珠。将反应板保持在室温下。
    9. 向 IP 反应板中每排样品加入 30 µL 染色质免疫沉淀（ChIP）洗脱缓冲液（EB），缓慢上下吹打 10 次进行混匀。注意避免产生气泡。
    10. 用 PCR 封板膜密封反应板，在加热混匀仪中于 65 °C 孵育 1.5 小时，混匀速度设为 1,350 rpm。
    11. 孵育 1.5 小时后，在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 1 分钟。将加热混匀仪的温度设置更改为 50 °C。
    12. 离心后，将 IP 反应板置于板式磁架上，等待溶液澄清。使用多通道移液器，小心将 30 µL 上清液转移至新的 96 孔板中，避免扰动磁珠。每排使用新的吸头。将该板标记为 "IP reaction"，并置于室温保存。
  2. 蛋白质消化
    1. 从 4 °C 冰箱中取出 30% PEG/1 M NaCl 磁珠17（缓冲液组成表）溶液，室温放置至少 30 分钟。关键步骤：确保磁珠溶液完全达到室温后再进行后续操作。
    2. 从 4 °C 保存条件下取出输入对照样品（步骤 2.3.2），短暂离心。使用移液器测量体积，并向每个输入对照样品中加入超纯水，使终体积为 30 µL。将输入对照样品转移至 IP 反应板中预先选定的输入孔（空孔）（步骤 3.1.12）。记录孔位与样品对应关系。
    3. 在冰上按照 表 5 配制蛋白质消化主混合液，并将其等量分装至一个 96 孔储液板的一排中。
    4. 使用多通道移液器，向 IP 反应板中每排样品加入 40 µL 蛋白质消化主混合液，缓慢上下吹打 10 次混匀。用 PCR 封板膜密封反应板，在 200 × g 条件下离心 1 分钟，然后在加热混匀仪中于 50 °C 孵育 30 分钟，转速设为 650 rpm。孵育期间，配制新鲜的 70% 乙醇（EtOH）并置于室温。
    5. 30 分钟孵育结束后，在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 1 分钟。将反应板保持在室温。
      注意：此时每孔总体积应约为 70 µL。
  3. 使用 30% PEG/1 M NaCl 磁珠溶液进行磁珠纯化
    1. 将室温下的 30% PEG/1 M NaCl 磁珠溶液分装至洁净的 96 孔储液板的一排中（每样本 75 µL × 排数）。
    2. 在室温下操作，使用多通道移液器向 IP 反应板中每排样品加入 70 µL（1:1 比例）30% PEG/1 M NaCl 磁珠溶液，上下吹打 10 次混匀。每排更换吸头。室温孵育 15 分钟。
    3. 将反应板置于板式磁架上，孵育 5 分钟，使磁珠充分分离。
    4. 使用移液器小心吸除并弃去上清液，避免扰动磁珠。保留磁珠。
    5. 在 IP 反应板仍置于磁架上的情况下，使用多通道移液器向每排样品加入 150 µL 室温 70% EtOH，孵育 30 秒。30 秒后，使用多通道移液器吸除并弃去上清液。重复此步骤一次，共完成 2 次洗涤。
    6. 第二次 EtOH 洗涤后，将“干燥”的反应板继续置于磁架上孵育 3 分钟。目视检查，确保所有 EtOH 已完全挥发。若未完全挥发，可继续孵育 1 分钟。过度干燥会导致得率降低。
    7. 将反应板从磁架上取下，使用多通道移液器向每排加入 35 µL EB（材料表）。上下吹打 10 次充分混匀，每排更换吸头。室温孵育 3 分钟以完成洗脱。
    8. 孵育结束后，将 IP 反应板放回板式磁架，孵育 2 分钟，使磁珠分离，溶液变澄清。
    9. 使用多通道移液器，小心将上清液转移至新的 96 孔板的对应孔中，避免扰动磁珠。
    10. 用铝制封板膜密封反应板，标记为 "IPed + Input DNA"，并于 4 °C 过夜保存，或于 -20 °C 长期保存（>48 小时）。

4. 第3天：文库构建

  1. 末端修复与磷酸化
    1. 末端修复/磷酸化反应的输入为步骤 3.3.10 中的 IPed + Input 板。解冻后，在 4 °C 下以 200 x g 离心 1 分钟，并将该板置于冰上保存。
    2. 从 -20 °C 冰箱中取出末端修复/磷酸化反应所需的所有试剂（酶除外）（表 6），在室温下解冻，然后立即转移至冰上。
    3. 在冰上操作，根据表 6在无菌的 1.5 mL 微量离心管中配制末端修复/磷酸化主混合液。加入所有非酶组分后，短暂涡旋混匀，然后将管子放回冰上。
    4. 从低温储存处取出相应的酶，并使用预冷的管架将其转移至实验台。通过轻弹管壁混匀每种酶，短暂离心后立即放回预冷的管架中。吸取酶时应缓慢操作，以确保转移体积准确。加入后，用移液器在主混合液中上下吹打清洗吸头。
    5. 加入酶后，轻轻脉冲涡旋主混合液 5 次，以确保所有组分均匀分布，然后短暂离心并立即将管子放回冰上。
    6. 在冰上，将适量的末端修复/磷酸化主混合液分装至新的 96 孔储液板的一整行中；分装体积为：(15 µL × 行数) + 5 µL 死体积。例如两行的计算：(15 µL × 2) + 5 µL = 每孔 35 µL。
    7. 使用多通道移液器，向每行样本中加入 15 µL 末端修复/磷酸化主混合液，并上下吹打 10 次混匀。每行之间更换吸头。用塑料封板膜密封板子，在 4 °C 下以 200 x g 离心 1 分钟，然后在室温下孵育 30 分钟。
  2. 末端修复与磷酸化后的磁珠纯化
    1. 从 4 °C 冰箱中取出 20% PEG/1 M NaCl 磁珠溶液和 30% PEG/1 M NaCl 溶液，在室温下孵育至少 30 分钟。
      注：30% PEG/1 M NaCl 溶液不含磁珠。
    2. 待两种溶液均达到室温后，为每个样本配制 80 µL 的 30% PEG/1 M NaCl 与 20% PEG/1 M NaCl 磁珠溶液的 1:2 混合液。例如 24 个样本：80 µL × 24 = 1,920 µL（640 µL 30% PEG/1 M NaCl 和 1,288 µL 20% PEG/1 M NaCl 磁珠溶液）。
    3. 将磁珠混合液等体积分装至 96 孔储液板的一整行中，并在室温下保存。将 EB 缓冲液（每样本 40 µL × 行数）分装至洁净的 96 孔储液板的另一行中。例如两行的计算：40 µL × 2 = 每孔 80 µL。
    4. 使用多通道移液器，将步骤 4.2.2 配制的 75 µL 磁珠混合液加入步骤 4.1.7 中每行的样本中，并上下吹打 10 次混匀。每行之间更换吸头。室温孵育 15 分钟。继续按照步骤 3.3.3–3.3.10 所述进行磁珠纯化操作。用塑料封板膜覆盖板子，短暂离心后置于冰上。进入步骤 4.3。
  3. A 尾添加反应
    1. 从 -20 °C 冰箱中取出 A 尾添加反应所需的所有试剂（酶除外）（表 7），在室温下解冻后立即转移至冰上。
    2. 在冰上操作，根据表 7在无菌的 1.5 mL 微量离心管中配制 A 尾添加主混合液。遵循步骤 4.1.4–4.1.6 所述的一般酶反应体系配制说明。
    3. 使用多通道移液器，向每行样本中加入 15 µL A 尾添加主混合液，并上下吹打 10 次混匀。每行之间更换吸头。用 PCR 封板膜密封板子，在 4 °C 下以 200 x g 离心 1 分钟，然后在热循环仪中于 37 °C 孵育 30 分钟。孵育结束后，以 200 x g 离心 1 分钟，将板子置于室温保存。
  4. A 尾添加后的磁珠纯化
    1. 执行步骤 4.2 所述操作。用塑料封板膜覆盖板子，标记为"A-tail + BC"，短暂离心后置于冰上。进入步骤 4.5。
  5. 接头连接
    1. 从 -20 °C 冰箱中取出接头连接反应所需的所有试剂（酶除外）（表 8），在室温下解冻后立即转移至冰上。
    2. 取出 10 µM PE 接头（补充表 1）储备液，用 EB 缓冲液稀释至 0.5 µM。短暂涡旋充分混匀。所需体积为 3 µL × 样本数。在冰上操作，将 0.5 µM PE 接头等体积分装至洁净的 96 孔储液板的 12 个孔中。保持在冰上。
    3. 在冰上操作，根据表 8在无菌的 1.5 mL 微量离心管中配制接头连接主混合液。遵循步骤 4.1.4–4.1.6 所述的一般酶反应体系配制说明。确保 5X 快速连接缓冲液完全解冻并充分混匀后再使用。
    4. 在冰上，将适量的接头连接主混合液分装至新的 96 孔储液板的一整行中。例如两行的计算：(23 µL × 2) + 5 µL = 每孔 51 µL。保持板子在冰上。
    5. 使用多通道移液器，向步骤 4.4.1 中每行样本中加入 2 µL 0.5 µM 配对末端（PE）接头并混匀。每行之间更换吸头。
    6. 使用多通道移液器，向每行样本中加入 23 µL 接头连接主混合液，并上下吹打 15 次混匀。每行之间更换吸头。用金属封板膜密封板子，标记为"Ligation"，在 4 °C 下以 200 x g 离心 1 分钟，然后在室温下过夜孵育。
  6. 第 4 天：接头连接后的磁珠纯化 #1
    1. 从 4 °C 冰箱中取出 20% PEG/1 M NaCl 磁珠溶液，在室温下孵育至少 30 分钟。在溶液平衡期间，配制新鲜的 70% 乙醇。
    2. 将 20% PEG/1 M NaCl 磁珠溶液按每样本 55 µL 分装至 96 孔储液板的一整行中，并在室温下保存。例如两行的计算：55 µL × 2 = 每孔 110 µL。
    3. 将 EB 缓冲液按每样本 50 µL 分装至洁净的 96 孔储液板的另一行中。例如两行的计算：50 µL × 2 = 每孔 100 µL。
    4. 使用多通道移液器，向步骤 4.5.6 中的连接板每行样本中加入 48 µL 20% PEG/1 M NaCl 磁珠溶液，并上下吹打 10 次混匀。每行之间更换吸头。室温孵育 15 分钟。继续按照步骤 3.3.3–3.3.7 所述进行磁珠纯化操作。
    5. 将板子从磁力架上取下，使用多通道移液器加入 45 µL EB 缓冲液（材料表）。上下吹打 10 次充分混匀。每行之间更换吸头。室温孵育 3 分钟以完成洗脱。
    6. 孵育结束后，将 IP 反应板放回磁力架上，孵育 2 分钟。使用多通道移液器，在不扰动磁珠的前提下，小心地将上清液转移至新的 96 孔板的对应孔中。标记该板为"Ligation + 1 BC"。
    7. 向每孔加入 5 µL 10x 高保真 PCR 缓冲液，并上下吹打充分混匀。每行之间更换吸头。用塑料封板膜覆盖板子，短暂离心后在室温下保存。
  7. 接头连接后的磁珠纯化 #2
    1. 按照第 4.6 节所述进行磁珠纯化，但作如下调整：向 Ligation + 1 BC 板（步骤 4.6.7）的每个活性孔中加入 60 µL 20% PEG/1 M NaCl 磁珠溶液，并用 35 µL EB 缓冲液从磁珠上洗脱。标记该板为"Ligation + 2 BC"，并置于冰上保存。
  8. PCR 扩增
    1. 从 -20 °C 冰箱中取出 PCR 反应所需的所有试剂（酶除外）（表 9），在室温下解冻后立即置于冰上。
    2. 在冰上操作，根据表 9在无菌的 1.5 mL 微量离心管中配制 PCR 主混合液。遵循步骤 4.1.4–4.1.5 所述的一般反应体系配制说明。在冰上，将适量的 PCR 主混合液分装至新的 96 孔储液板的一整行中。保持在冰上。有关样本计算，请参见步骤 4.5.4。
    3. 在冰上操作，使用多通道移液器，向 Ligation + 2 BC 板（步骤 4.7.1）的每孔中加入 2 µL 各自独特的 12.5 µM PCR 反向索引引物（补充表 2），并缓慢上下吹打混匀。每行之间更换吸头。保持板子在冰上。
    4. 在冰上操作，使用多通道移液器，向步骤 4.8.3 中每行样本中加入 23 µL PCR 主混合液，并上下吹打 10 次混匀。用 PCR 封板膜密封板子，以 200 x g 离心 1 分钟，然后在热循环仪中孵育（PCR 循环条件见表 10）。
  9. PCR 扩增后的磁珠纯化
    1. PCR 扩增后，在 4 °C 下以 200 x g 离心 1 分钟。按照第 4.6 节所述进行磁珠纯化，但作如下调整：向每个 PCR 反应中加入 51 µL 20% PEG/1 M NaCl 磁珠溶液，并用 25 µL EB 缓冲液从磁珠上洗脱。用铝膜封板，以 200 x g 离心 1 分钟。将样本储存于 -20 °C。
    2. 为验证构建的文库，使用基于荧光的检测法进行 DNA 定量，使用基于芯片的毛细管电泳分析仪（高灵敏度检测）观察最终产物，并进行富集定量 PCR（qPCR）（参见代表性结果，通过 qPCR 验证 ndChIP-seq 文库质量）。

结果

染色质消化图谱
MNase 消化的优化对于本实验方案的成功至关重要。必须生成以单核小体片段大小为主的消化图谱，同时避免过度消化，以确保能够回收到高级结构的核小体片段。理想的消化图谱中，绝大多数为单核小体片段，同时含有少量小于或大于单核小体的片段。图1展示了理想、过度消化和消化不足的片段大小分布图谱示例。需要注意的是，染色质消化不充分也会在免疫沉淀物所构建的测序文库图谱中显现出来（图2）。

通过 qPCR 验证 ndChIP-seq 文库质量
qPCR 是评估 ChIP 质量的一种成熟方法18,19,20。在对 10,000 个细胞进行 ndChIP-seq 实验时，免疫沉淀（IP）后获得的核酸产量将低于 1 ng。因此，在文库构建完成后必须进行 qPCR，以评估目标区域相对于背景的富集程度。为提供背景估计值，需同时构建来自经 MNase 消化的染色质（Input）的文库。对于每个 IP 文库，需要两组引物（常用组蛋白修饰标记的引物列表见补充表 3）。其中一组引物应特异性针对始终与目标组蛋白修饰相关的基因组区域（阳性目标），另一组则针对不带有该组蛋白修饰的区域（阴性目标）。ChIP-seq 文库的质量将通过相对于 Input 文库的富集倍数进行评估。富集倍数可使用以下公式计算，该公式假设目标基因组区域呈指数扩增：2Ctinput- CtIP。我们自行开发的 R 统计软件包 qcQpcr_v1.2 适用于低起始量的天然 ChIP-seq 文库的 qPCR 富集分析（补充代码文件）。图 3 展示了成功与不成功 ChIP-seq 文库的 qPCR 结果。高质量 ndChIP-seq 文库的最小预期富集倍数为：对于 H3K4me3 等窄峰标记为 16 倍，对于 H3K27me3 等宽峰标记为 7 倍。

模拟MNase可及性
ChIP-seq 的计算分析在每种实验条件下均具有复杂性和独特性。国际人类表观基因组计划联盟（International Human Epigenomic Consortium, IHEC）和 DNA 元素百科全书计划（The Encyclopedia of DNA Elements, ENCODE）制定的一系列指南可用于评估 ChIP-seq 文库的质量21需要注意的是，文库的测序深度会影响富集区域的检测与分辨率20检测到的峰数量随着测序深度的增加而增多，并逐渐接近平台期。我们建议，对于窄峰标记，ndChIP-seq文库的测序应遵循IHEC推荐标准，即5000万条成对读段（2500万个片段）例如，H3K4me3）以及1亿对读段（5000万片段）用于宽广型标记（例如，H3K27me3）和输入22这些测序深度能够提供足够的序列比对结果，用于通过广泛使用的 ChIP-seq 峰识别软件（如 MACS2 和 HOMER）检测最显著的峰，且未达到饱和状态。23,24高质量的哺乳动物ndChIP-seq文库其PCR重复率应低于 <10% 和参考基因组比对率 > 90%（包含重复序列读数）。成功的ndChIP-seq文库应包含高度相关的重复样本，其中包含显著比例的（> 40% 的比对读段位于 MACS2 内22 鉴定出的富集峰以及在基因组浏览器上比对读段的检查应能直观显示相对于输入文库的可检测富集信号图4）。此外，ndChIP-seq 可通过使用高斯混合分布算法来评估核小体密度（w1 * n(x; μ1,σ1) + w2 * n(x μ2σ2) = 1）时，MACS2 鉴定出的富集区域可用于建模由 MNase 可接近边界定义的核小体密度。在此模型中，w1 表示单核小体分布权重和 w2 表示二核小体分布权重。其中 w1 大于 w2，单核小体片段占主导地位，反之亦然。该分析要求文库以成对末端方式测序，以便确定片段大小。为了应用高斯混合分布算法，需首先鉴定出具有统计学显著性的富集区域。我们建议使用Input作为对照，采用MACS2进行峰识别，针对窄峰标记使用默认参数，针对宽峰标记设置q值截断值为0.01。目前多种广泛使用的统计软件包中均提供了基于高斯混合分布算法的统计工具。利用免疫沉淀样本成对末端读段边界确定的平均片段大小，结合MACS2鉴定出的富集启动子区域，可通过R语言统计软件包Mclust 3.0版本对每个启动子应用高斯混合分布算法25 用于计算加权分布。在本应用中，建议剔除包含少于30个比对片段的启动子区域，因为低于此阈值时，所得权重估计结果将不可靠。高质量的ndChIP-seq文库会产生由两个主要组分构成的高斯混合分布，其均值分别对应于单核小体和双核小体片段长度。

DNA片段分析；电泳结果显示峰强度；按大小进行凝胶分离。
图1：文库构建前MNase消化效果的评估。 芯片式毛细管电泳分析仪检测的染色质MNase消化结果，分别显示了最佳消化（A）、消化不足（B）和过度消化（C）的情况。生物学重复样本以蓝色、红色和绿色曲线表示。请点击此处查看该图的高清版本。

DNA片段分析电泳图谱，图表，碱基对，荧光单位，基因分型。
图 2：文库构建后MNase消化效果的评估。 （A）经最佳消化的输入样本（生物学重复；红色、绿色、黑色）和免疫沉淀样本（生物学重复；青色、紫色、蓝色）在文库构建后的分布图谱；（B）次优消化的输入样本（生物学重复；红色、绿色、蓝色）和免疫沉淀样本（生物学重复；青色、紫色、橙色）文库的分布图谱。请点击此处查看此图的放大版本。

显示在失败/成功文库中阳性/阴性靶标的富集倍数（2^ΔCt）的柱状图。
图3：文库构建后的定量PCR可用于评估ndChIP-seq文库的质量。 使用qcQpcr_v1.2，通过阳性与阴性靶标计算H3K4me3免疫沉淀文库相对于input文库的富集倍数，公式为2(input的Ct值 - IP的Ct值)。请点击此处查看该图的高清版本。

ChIP-seq 中的静态平衡；图表、读段密度分析、交联 ChIP-seq 与 ndChIP-seq 的比较。
图 4：由 10,000 个原代 CD34+ 脐血细胞构建的代表性 ndChIP-seq 文库。 在三个生物学重复样本的启动子区（TSS±2 Kb）计算 H3K4me3 信号（每百万比对读段数）的皮尔逊相关性，（A）重复 1 与 2，（B）重复 1 与 3，（C）重复 2 与 3。（D）UCSC 浏览器中 HOXA 基因簇的视图，分别来自每次免疫沉淀使用 100 万个细胞的交联 ChIP-seq、每次免疫沉淀使用 10,000 个细胞的成功 ndChIP-seq，以及每次免疫沉淀使用 10,000 个细胞的失败 ndChIP-seq（红色：H3K27me3，绿色：H3K4me3，黑色：Input）。（E）比对到的读段中位于 MACS2 鉴定的 H3K4me3（黑色）和 H3K27me3（灰色）富集区域内的比例。请点击此处查看该图的放大版本。

缓冲液组成
A.1. 免疫沉淀缓冲液（IP）
20 mM Tris-HCl pH 7.5
2 mM EDTA
150 mM NaCl
0.1% Triton X-100
0.1% Deoxycholate
10 mM Sodium Butyrate
A.2. 低盐洗涤缓冲液
20 mM Tris-HCl pH 8.0
2 mM EDTA
150 mM NaCl
1% Triton X-100
0.1% SDS
A.3. 高盐洗涤缓冲液
20 mM Tris-HCl pH 8.0
2 mM EDTA
500 mM NaCl
1% Triton X-100
0.1% SDS
A.4. ChIP 洗脱缓冲液
100 mM NaHCO3
1% SDS
A.5. 1x 裂解缓冲液 – 1 mL
0.1% Triton
0.1% Deoxycholate
10 mM Sodium Butyrate
A.6. 抗体稀释缓冲液
0.05% (w/v) Azide
0.05% 广谱抗菌剂（e.g. ProClin 300）
溶于 PBS
A.7. 30% PEG/1M NaCl 磁珠溶液（参考文献16）
30% PEG
1 M NaCl
10 mM Tris HCl pH 7.5
1 mM EDTA
1 mL 洗涤后的超顺磁性磁珠
A.8. 20% PEG/1M NaCl 磁珠溶液（参考文献16）
30% PEG
1 M NaCl
10 mM Tris HCl pH 7.5
1 mM EDTA
1 mL 洗涤后的超顺磁性磁珠

表1：ndChIP-seq 缓冲液成分。

组蛋白修饰浓度 (µg/µL)
H3K4me30.125
H3K4me10.25
H3K27me30.125
H3K9me30.125
H3K36me30.125
H3K27ac0.125

表2：ndChIP-seq 所需抗体用量。

Reganet体积 (µL)
超纯水478
1 M Tris-HCl pH 7.510
0.5 M EDTA10
5 M NaCl2
甘油500
总体积1,000

表3：MNase稀释缓冲液配方。

试剂体积 (µL)
超纯水13
20 mM DTT1
10x MNase 缓冲液4
20 U/µl Mnase2
总体积20

表4：MNase主混合液配方。

试剂体积 (µL)
洗脱缓冲液30
缓冲液 G28
蛋白酶2
总体积40

表5：DNA纯化主混合液配方。

试剂体积 (µL)
超纯水3.3
10x 限制性内切酶缓冲液 (例如 NEBuffer)5
25 mM ATP2
10 mM dNTPs2
T4 多核苷酸激酶 (10 U/µl)1
T4 DNA 聚合酶 (3 U/µl)1.5
DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 片段) (5 U/µl)0.2
总体积15

表6：末端修复主混合液配方。

试剂体积 (µL)
超纯水8
10x 限制性内切酶缓冲液 (e.g. NEBuffer)5
10 mM dATP1
Klenow (3'-5' exo-)1
总体积15

表7：A尾添加反应主混合液配方。

试剂体积 (µL)
超纯水4.3
5x 快速连接缓冲液12
T4 DNA 连接酶 (2000 U/µl)6.7
总体积23

表8：接头连接主混合液配方。

试剂体积 (µL)
超纯水7
25 uM PCR 引物 1.02
5x HF 缓冲液12
DMSO1.5
DNA 聚合酶0.5
总体积23

表9：PCR反应主混合液配方。

温度 (°C)持续时间 (s)循环次数
98601
9830
651510
7215
723001
4holdhold

表10：PCR运行程序。

引物序列修饰
PE_adapter 15’- /5Phos/GAT CGG AAG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG -3’5’ 修饰：磷酸化
PE_adapter 25’ - ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC*T - 3’3’ 修饰：*T 为硫代磷酸键

补充表 1：用于生成 PE 接头的引物序列。

引物名称序列索引IndexRevC（用于测序）
PCR 反向索引引物 1CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCGTGATatcacg
PCR 反向索引引物 2CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCTGATCgatcag
PCR 反向索引引物 3CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGGGTTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGGGGTTaacccc
PCR 反向索引引物 4CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGGGTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCTGGGTacccag
PCR 反向索引引物 5CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGCTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTAGCGCTagcgct
PCR 反向索引引物 6CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCTTTTGcaaaag
PCR 反向索引引物 7CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTTGTTGGccaaca
PCR 反向索引引物 8CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTAGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTAGCTAGctagct
PCR 反向索引引物 9CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCATCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTAGCATCgatgct
PCR 反向索引引物 10CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGATTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCGATTAtaatcg
PCR 反向索引引物 11CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATTCACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCATTCAtgaatg
PCR 反向索引引物 12CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGGAACTagttcc
PCR 反向索引引物 13CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTACATCGcgatgt
PCR 反向索引引物 14CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTAAGCTAtagctt
PCR 反向索引引物 15CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAAGTTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCAAGTTaacttg
PCR 反向索引引物 16CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCGGTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGCCGGTaccggc
PCR 反向索引引物 17CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGCCTCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCGGCCTaggccg
PCR 反向索引引物 18CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTTAGTTGcaacta
PCR 反向索引引物 19CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGTGGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGCGTGGccacgc
PCR 反向索引引物 20CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTATAGCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGTATAGctatac
PCR 反向索引引物 21CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTTGCCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTCCTTGCgcaagg
PCR 反向索引引物 22CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTGTACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTGCTGTAtacagc
PCR 反向索引引物 23CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGGCACGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTATGGCAtgccat
PCR 反向索引引物 24CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTTGACATatgtca

补充表 2：PCR 反向索引引物序列。

引物序列
ZNF333_genic_H3K9me3_F5'-AGCCTTCAATCAGCCATCATCCCT-3'
ZNF333_genic_H3K9me3_R5'-TCTGGTATGGGTTCGCAGATGTGT-3'
HOXA9-10_F5'-ACTGAAGTAATGAAGGCAGTGTCGT-3'
HOXA9-10_R5'-GCAGCAYCAGAACTGGTCGGTG-3'
GAPDH_genic_H3K36me3_F5'-AGGCAACTAGGATGGTGTGG-3'
GAPDH_genic_H3K36me3_R5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'
GAPDH-F5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3'
GAPDH-R5'-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3'
组蛋白修饰阳性靶标阴性靶标
H3K4me3GAPDHHOXA9-10
H3K4me1GAPDH_genicZNF333
H3K27me3HOXA9-10ZNF333
H3K27acGAPDHZNF333
H3K9me3ZNF333HOXA9-10
H3K36me3GAPDH_genicZNF333

补充表 3：常用组蛋白修饰标记（H3K4me3、H3K4me1、H3K27me3、H3K27ac、H3K9me3 和 H3K36me3）引物列表。

补充文件 1：ndChIP-seq 工作表。 请点击此处下载该文件。

补充代码文件：qcQpcr_v1.2。 用于低起始量天然 ChIP-seq 文库 qPCR 富集分析的 R 统计软件包。请单击此处下载该文件。

讨论

鉴于染色质修饰与核小体定位在转录调控中的组合特性，一种能够同时检测这些特征的方法有望为表观遗传调控提供新的见解。本文介绍的ndChIP-seq方案是一种优化的天然ChIP-seq方法，可实现对稀有原代细胞中组蛋白修饰和核小体密度的同时分析9,10。ndChIP-seq利用染色质的酶消化处理，结合双端大规模并行测序及高斯混合分布模型，能够在单个核小体水平上研究组蛋白修饰，并解析由细胞群体异质性驱动的表观基因组谱型。利用该方案，我们先前已报道了一种独特的免疫沉淀片段大小分布，该分布由双端测序读段边界确定，并与ChromHMM定义的特定染色质状态相关10,24。

ndChIP-seq 文库的质量取决于多个因素，例如抗体的特异性和灵敏度、MNase 消化反应的最佳条件以及染色质的质量。所用抗体的特异性对于成功构建 ndChIP-seq 文库至关重要。理想的抗体应对目标表位具有高亲和力，同时与其他表位的交叉反应性极低。同样重要的是，应选择对目标抗体具有最高亲和力的磁珠。

微球菌核酸酶（MNase）消化是本实验方案中一个关键步骤，对时间和酶浓度敏感。因此，在处理多个样本时，必须确保每个反应的孵育时间相等（见步骤2.2）。染色质的质量是显著影响ndChIP-seq结果的另一个重要因素。染色质若已发生断裂，会导致MNase消化图谱不理想，最终构建的文库信噪比偏低。对于细胞活力低或染色质已降解的原始样本（如福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织），不建议采用本实验方案。

在染色质提取过程中加入PIC可减少非特异性（即，随机）的染色质片段化，并保持组蛋白尾部的完整性。因此，PIC需在使用前立即加入裂解缓冲液和免疫沉淀缓冲液中。在通过流式细胞术筛选细胞时，应选择活细胞，并确保以较低流速分选细胞，以提高细胞数量估算的准确性和细胞活性。避免将细胞直接分选到裂解缓冲液中，因为鞘液会稀释裂解缓冲液，从而阻碍MNase对细胞膜的有效通透。根据细胞类型或生物体的不同，可能需要对MNase进行滴定，以获得最佳的消化效果。

哺乳动物细胞的ndChIP-seq实验要求窄峰标记的测序深度至少为5000万条成对读段（2500万个片段），宽峰标记和输入样本则需达到1亿条成对读段（5000万个片段）。若文库的测序深度显著低于此推荐值，高斯混合分布算法将无法实现最佳性能。对于单核小体与双核小体片段长度的加权分布值之间差异较小的启动子，ndChIP-seq无法将其分类为以单核小体或双核小体为主导的启动子，因此这些启动子必须在后续分析中予以剔除。可通过设置生物学重复以提高预测分布的可信度，并识别MNase消化及文库构建过程中的技术变异。

与以往的天然ChIP-seq方案不同，ndChIP-seq通过利用免疫沉淀后的片段大小，将MNase可及性测定的核小体密度与组蛋白修饰检测相结合，从而研究染色质结构和组蛋白修饰的组合效应。将ndChIP-seq应用于原代细胞和组织，将为表观遗传调控的整合特性提供新的见解，并有助于识别因细胞群体异质性所导致的表观遗传特征。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

A.L. 获得加拿大卫生研究院的加拿大研究生奖学金资助。本研究获得了不列颠哥伦比亚基因组学研究所和加拿大卫生研究院（CIHR-120589）的资助 ，作为加拿大表观遗传学、环境与健康研究联盟计划的一部分，同时获得M.H. 的特里·福克斯研究研究所项目资助（#TFF-122869）以及特里·福克斯研究研究所授予M.H. 的新研究员奖（资助号 #1039）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1M Tris-HCl –pH 7.5Thermo Scientific15567-027
1M Tris-HCl –pH 8Thermo Scientific15568-025
0.5M EDTAThermo ScientificAM9260G
5M NaClSigma1001385276
Triton X-100Sigma1001412354
脱氧胆酸钠Sigma1001437582
SDSThermo Scientific15525-017
碳酸氢钠Fisher ScientificS233-500
100% 乙醇NANA
V型底96孔板（AB 1400）Thermo ScientificAB-1400-L
Gilson P2 移液器MandelF144801
Gilson P10 移液器MandelF144802
Gilson P20 移液器MandelF123600
Gilson P100 移液器MandelF123615
Gilson P200 移液器MandelF123601
Gilson P1000 移液器MandelF123603
微球菌核酸酶 NEBM0247S
Thermo Mixer C（加热块混匀仪）Eppendorf5382000023
多通道12道P20移液器Rainin17013803
多通道12道P200移液器Rainin17013805
1.5 ml 低吸附管Eppendorf22431021
0.5 ml 低吸附管Eppendorf22431005
塑料板盖Edge Bio48461
PCR盖Bio RadMSD-1001
铝制板盖Bio RadMSF-1001
洗脱缓冲液（EB缓冲液）Qiagen19086
1M DTTSigma646563
Eppendorf 5810R 离心机 Eppendorf22625004
超纯水Thermo Scientific10977-015
Protein G 磁珠Thermo Scientific10001D
Protein A 磁珠Thermo Scientific10001D
蛋白酶抑制剂混合物Calbiochem539134
旋转平台Mandel1b109-12052010
板式磁力架Alpaqua2523
圆顶式12联管盖条Bio RadTCS1201
Buffer G2Qiagen1014636
蛋白酶Qiagen19155
管式磁力架（DynaMag-2）Thermo Scientific12321D
管式磁力架（DynaMag-2）LabCore730-006
V型塑料储液槽MandelS0100A
涡旋振荡器MandelC1801
迷你离心机Mettler ToledoXS2035
分析天平MandelLB109-12052010
快速连接反应缓冲液，5XNEBB6058S
DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）NEBM0210S
Klenow片段（3'-5'外切酶活性）NEBM0212S
T4 DNA聚合酶NEBM0203S
T4多核苷酸激酶NEBM0201S
脱氧核苷酸溶液混合物，10mMNEBN0447S
dATP溶液，10mMNEBN0440S
Quick T4 DNA连接酶NEBM0202T
腺苷-5'-三磷酸（ATP），25mMNEBP0756S
DNA聚合酶Thermo ScientificF549L
NEBuffer 2NEBB7002S
Hank's平衡盐溶液Thermo Scientific14025076
胎牛血清 Thermo ScientificA3160702
磷酸盐缓冲液 Thermo Scientific10010023
H3K4me3Cell Signaling9751S
H3K4me1DiagenodeC15410037
H3K27me3DiagenodepAb-069-050
H3K36me3Abcamab9050
H3K9me3DiagenodeC15410056
SeraMag 超顺磁性磁珠

参考文献

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