高效液相色谱分析和触多巴胺摄取对小鼠多巴胺能稳态的评价

多巴胺 (DA) 是一种调节神经递质关键的运动行为, 奖励和认知功能^1,7,8,9。DA 稳态失衡与一些神经精神疾病有牵连, 如注意缺陷多动障碍、药物成瘾、抑郁症和帕金森氏病¹。DA 是释放从前神经元进入突触裂, 它绑定到和激活受体的前突触后膜, 从而进一步传递信号。在释放后突触中 DA 的水平由 DAT^3,10进行空间和世俗控制。运输者固 da 从细胞外空间, 从而维持生理 da 水平^3,11。在小鼠中, hyperdopaminergic 的基因去除导致突触 da 水平升高, 细胞内 da 池衰竭, 突触后 DAergic 信号发生深刻变化,^10,12。

这里, 提出了两个单独的协议, 一个测量 DA 组织含量的方法, 另一个是评估 DAT 的功能. 结合加百利 et al. 的表面法测定法¹³这两种方法提供了有关 da内容和功能级别的 DAT, 以彻底评估 DA 稳态。利用这些方法可以对各种转基因小鼠或疾病模型的 DA 稳态进行定性和描述。这些工具已被实施和优化, 并在我们的实验室标准使用。目前的化验结果, 以调查的影响 da 稳态改变的 C 终端的 DAT¹⁴或表达的重组在酪氨酸羟化酶 (TH) 启动子⁵。

丹麦动物实验视察员的指导方针 (许可号: 2017-15-0201-01160) 被遵循, 并在当地动物福利监督下在一个完全 AAALAC 的认证设施中进行实验委员会.

1. 触多巴胺摄取量 (方法 1)

注意: 此协议用于两个大脑的并行评估, 但可以成功地用于执行触 DA 摄取实验与四大脑并行.

1. 准备
   1. 标签 48 1.5 毫升微型离心机管每 表 1 (每个大脑 24)。使用不同颜色的管属于每个大脑, 以防止混淆之间的样本
   2. 标签51闪烁管 #1-51.
   3. 在冰上放置磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。这将用于保持大脑的冷却.
   4. 打开离心机以允许 pre-cool 到4和 #176; C.
   5. 前称两个微离心管, 以获得确切的组织重量在触准备 (2.6 节).
   6. 通过混合4毫米 HEPES 和0.32 米蔗糖来制备均匀化缓冲。调整 pH 值为 7.4, 并保持冰.
      注: 均匀化缓冲液可保存在等分-20 和 #176 ° C, 并解冻实验的当天.
   7. 准备吸收缓冲器的组合如下:25 毫米 HEPES, 120 毫米氯化钠, 5 毫米氯化钾, 1.2 毫米 CaCl ₂ , 1.2 毫米 MgSO ₄ , 1 毫米抗坏血酸 (0.194 克/升), 5 毫米 d-葡萄糖 (0.991 克/升)。用氢氧化钠调节 pH 值至 7.4 (导致钠浓度约130毫米), 并保持在冰上.
      注: 对于2大脑, 准备1500毫升吸收缓冲。准备吸收缓冲液, 作为一个10x 的库存解决方案, 不含抗坏血酸和葡萄糖保持在4和 #176; c. 使1x 的工作解决方案新鲜的一天, 补充与抗坏血酸和葡萄糖。将 pH 值与氢氧化钠调整到 7.4.
   8. 准备吸收缓冲剂 + 配体:25 毫米 HEPES, 120 毫米氯化钠, 5 毫米氯化钾, 1.2 毫米 CaC _l2 , 1.2 毫米 MgSO ₄ , 1 毫米抗坏血酸 (0.194 克/升), 5 毫米 d-葡萄糖 (0.991 克/升), 1 和 #956; M pargyline, 100 nm 帕明, 10 nm邻苯二酚邻甲基转移酶 (COMT) 抑制剂。用氢氧化钠调节 pH 值 7.4, 保持冰层.
      注: 使用50毫升吸收缓冲剂并加入配体。Pargyline 添加, 以防止氧化降解 DA 通过单胺氧化酶 (毛)。添加 COMT 抑制剂 (RO-41-0960), 以防止 DA (儿茶酚胺在一般) 的退化, 通过 COMT。帕明被添加到抑制通过去甲肾上腺素和血清素转运蛋白的摄取, 从而使摄取的结果特定的 DAT.
   9. 准备吸收缓冲剂 + 配体 + 可卡因的组合如下:25 毫米 HEPES, 120 毫米氯化钠, 5 毫米氯化钾, 1.2 毫米 CaCl ₂ , 1.2 毫米 MgSO ₄ , 1 毫米抗坏血酸 (0.194 克/升), 5 毫米 d-葡萄糖 (0.991 克/升), 1 和 #956; M pargyline, 100 nM 帕明, 10 nM COMT 抑制剂, 500 和 #956; 我的可卡因。用氢氧化钠调整 pH 值至 7.4, 并保持冰层.
      注: 使用7毫升吸收缓冲 + 配体和添加可卡因。添加可卡因是为了获得对非特异 DA 摄取量的背景测量, 以便从数据中减去, 只留下特定于 DAT 的摄取量 (因为如上所述, SERT 和网络受到帕明的抑制)。另外, 一个高度有效的和特定的 DAT 抑制剂 GBR-12935, 可以改用.
      要点: 从现在开始, 将所有的东西都放在冰上 .
2. 触准备
   一次牺牲一只老鼠由颈椎脱位和斩首.
   2. 用剪刀切开皮肤以露出颅骨, 并切断头骨后遗留下来的任何多余的组织。沿着 缝合放血 的小直剪刀将头骨切开, 尽可能前.
   3. 将两个剪刀尖放在鼠标的每只眼睛上, 然后将头骨切开, 以除去头骨和完整的大脑的剩余部分。迅速移除大脑并将其放置在 ice-cold PBS 中。这将使它保持低温, 而第二个大脑被解剖.
   4. 使用脑基质, 解剖纹状体的3毫米冠状切面 (前后: +1.5 毫米至-1.5 毫米), 然后用穿孔器进行更精细的解剖。请参见 图 1 以了解穿孔区域.
   5. 在任何时候保持组织在冰上前进.
   6. 将组织转移到1.5 毫升微离心管上进行称量.
      注: 此重量将用于步骤 1.2.14.
   7. 对第二个大脑重复步骤 1.2. 1-1. 2.6.
   8. 一旦获得两个大脑的重量, 将组织转移到包含1毫升 ice-cold 均匀化缓冲液的匀质玻璃上.
   9. 质的组织使用马达驱动杵在 800 rpm, 10 甚至中风.
      注意: 一个笔画等于一个上下动作, 第一个笔画应该是5秒, 下面3-4 秒. 等渗介质的均匀化对于防止突 ⁶ 的破裂非常重要。使用适当的力和等渗介质将允许前终端重新包围细胞质, 突触泡, 线粒体和细胞骨架 ¹⁵ .
   10. 将匀浆转移到1.5 毫升微离心管上, 用0.5 毫升的均匀化缓冲液冲洗均匀玻璃中的匀浆.
   11. 保持样品在冰上, 而来自其他大脑的组织均匀。在步骤 1.2. 12-1. 2.13 中并行运行两个大脑.
   12. 用离心法 (1000 x g, 10 分钟, 4 和 #176; C).
   13. 将上清液 (S1) (含细胞膜和细胞质) 转移到新的1.5 毫升离心管和离心机在 1.6万 x g 为20分钟在4和 #176; C.
   14. 在40和 #956 中丢弃上清 (含细胞质) 和重颗粒 (P2) (含粗突); L 均质缓冲/镁组织 (基于步骤1.2.6 中获得的重量)。用 p1000 吸管轻轻重粗触馏分, 因为太多的力会破坏突.
       注意: 重要的是要结束至少280和 #956;如果没有, 稀释超过40和 #956; L 每毫克将是必要的。步骤 1.2. 1-1. 2.13 必须尽可能快地进行, 所有的东西都要放在冰上。一旦原油突已悬浮在均匀化缓冲区, 他们是相当稳定的, 只要他们保持在冰上 ^{6 , 15 , 16} .

2。摄取实验

1. 添加440和 #956; 在指定的 12 1.5 毫升离心管和440和 #956 中吸收缓冲 + 配体 + 可卡因; l 吸收缓冲 + 配体到36剩余的 1.5 ml 离心管 (参见 表 1 进行布局).
   注意: 在实验开始之前, 从冰中取出15分钟把他们带到室温, 但保持冰, 直到然后保存抑制剂.
2. 准备饱和度曲线 (多巴胺 (2, 5, 6-[3 h]-DA) (3-h 多巴胺) (91.1 Ci/摩尔) 在不同的最终浓度 (0.031, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 和1.0 和 #956; M).
   1. 标签六 2 mL 离心管作为10、5、2.5、1.25、0.62 和 0.31.
   2. 添加750和 #956; L 吸收缓冲 + 配体到5离心管, 最低数量.
   3. 添加1455.4 和 #956; l 吸收缓冲 + 配体, 14.6 和 #956; l 多巴胺 (1 毫米), 30 和 #956; l 3-H 多巴胺 (11 和 #956; M) 到被标记的管子 10.
   4. 传输750和 #956; L 从被标记的管子10到被标记的管子5。混合好, 并转移750和 #956; L 从这个管到2.5 管。重复这种稀释与其余的管.
3. 在将玻璃纤维过滤器放在12井过滤器桶上后, 用4毫升的吸收缓冲液进行预冲洗.
4. 添加10和 #956; 触膜悬浮液对前 24 1.5 毫升微离心管 (见 表 1 用于布局) 包含440和 #956; l 缓冲器。涡旋小心, 并在短期内降速, 以确保突被淹没在缓冲区。在 37 ^o C 处保留10分钟
   注意: 重要的是要准确的时间在吸收实验期间, 公平比较大脑。使用秒表来精确.
5. 添加50和 #956; 浓度为10和5的多巴胺和 #956; M (2.2 节) 到前两列, 并在37点处离开, C 为5分钟, 并晃动。在整整5分钟后, 通过增加1毫升 ice-cold 吸收缓冲来停止反应。对浓度2.5 和1.25 和 #956 进行同样的处理; m (第 2.2), 然后集中0.62 和0.31 和 #956; m.
6. 将样品添加到 pre-rinsed 超细纤维过滤器中, 并用 5 x 4 mL ice-cold 吸收缓冲器清洗。当前12样本被添加到滤镜中时, 将滤镜移至闪烁管。在接下来的12示例中重复此操作.
7. 对下一个大脑重复步骤 2.4-2.6.
8. 在闪烁管的底部放置一个超细纤维过滤器, 并在顶部添加25和 #181, 从而准备3最大计数管; 最大多巴胺浓度 (10 和 #956; M).
9. 将所有51闪烁管放在通风罩中1小时.
10. 在每个闪烁管上添加3毫升闪烁液, 并在1h 振动器上晃动.
11. 计数 [ ³ H]-在 beta 计数器中为 1 min.
    1. 打开程序并选择: 标签: H-3, 板/过滤: 4 毫升瓶, 4 6, 化验类型: 正常和计数时间: 1 分钟
       注意: 此步骤可在次日执行, 如果更方便的话。把样品用锡纸盖住过夜.
12. 蛋白质测定
    1. 使用标准的性能分析蛋白测定试剂盒来确定突的蛋白质浓度, 以便从每分钟数 (cpm) 到 fmol/分钟/#956 的调整; g 和适当的摄取比较在示例之间.

3。数据分析

1. 使用吸收实验中的数据对每个组进行饱和度曲线, 并计算反应速率 (V _max ) 和蔑氏常量 (K _M ).
   注意: K _M 值反映达到 V _max 的一半所需的基底浓度。因此, V _max 直接反映了 dat (最大吸收容量) 的函数, 它取决于表面上的 dat 数以及它的活动如何通过后的修改和/或相互作用的蛋白质进行调制, 以及离子梯度的变化。K _M 值是对传送器的基底亲和性的间接测量, 它也可以通过后的修改和/或相互作用的蛋白质进行调制。因此, 要完全评估功能变化, 就必须直接确定表面表达水平, 例如表面法测定。对多巴胺再的描述以及对 K _M 和 V _max 值的含义的阐述已经被 al. ¹⁷ .

4。高效液相色谱法 (方法 2)

1. 脑解剖
   1. 标签和称离心管; 每个区域每只鼠标一个.
   2. 一次性牺牲一只老鼠, 由颈部脱位和斩首。如1.2 节所述, 迅速移除大脑。立即进行进一步的解剖.
   3. 使用脑基质, 解剖一个3毫米的纹状体的冠状切片, 其次是 NAc 和 dStr 的更精细的双边解剖。请参见 图 3 以了解穿孔区域.
   4. 将组织转移到1.5 毫升离心管, 并迅速放置在干冰上。称量组织并立即将其放回干冰中.
      注: 组织重量对以后的浓度计算很重要.
   5. 使用下一鼠标重复步骤 4.1. 1-4. 1.4.
      注意: 将组织放置在 80 ^o C 上, 直到进一步处理或立即进行组织处理.

5。组织准备

1. 打开离心机以使其 pre-cool 到4和 #176; C
2. 准备均匀化解决方案 (0.1 N 高氯酸 (HClO ₄ )) 并保持在冰上.
3. 使用均匀化解决方案, 准备一个新的 0.1 pmol/和 #956; L 多巴胺标准从1毫米的股票溶液 (1万 x 稀释).
   注: 库存溶液的制备方法是将多巴胺溶解于均匀缓冲液中, 以1毫米的浓度储存, 可保存在20和 #176; C 约一个月。如果大脑的其他区域感兴趣, 标准的集中将必须被修改, 因为其他大脑区域包括 prefrontral 皮层、海马、黑质和腹盖区域比纹状体拥有多达100倍的少 DA.
4. 在每个样本中添加500和 #956、L 均质化解决方案 (, 即 NAc 和 dStr 组织; 第4.1 节) 和质样品, 使用 ultra-homogenizer 全速在大约三十年代. 在均匀化过程中保持样品在冰水中。在每个样品之间, 用清水清洗超匀浆机 (三十年代的全速).
5. 离心样品30分钟在4和 #176; C, 1.4万 x g.
6. 传输大约200和 #956; 在玻璃0.22 和 #956 上取样; m 滤镜 (1 厘米直径), 使用1毫升塑料注射器.
   注: 玻璃过滤器的使用不重要, 只要选择的过滤器是0.22 和 #956; m 除去高分子量物质.
7. 用电化学检测 (EC)-HPLC 法分析样品 ¹⁸ 如第6节所述.

6。高效液相色谱分析

1. 为移动阶段准备以下解决方案: 醋酸钠55毫米, 磺酸1毫米, Na ₂ EDTA 0.1 毫米, 乙腈 8%, 乙酸 0.1 M, pH = 3.2.
   注: 用0.1 米醋酸调节 pH 值。准确地使用 pH 值是很重要的。解决方案应 degassed 由 on-line 气 (HPLC 系统的综合部分)。使 2 L 的移动阶段, 并改变它大约每月一次 (改变它时, 噪音得到明显)。由于波动, 它需要约24小时调整后, 改变移动阶段.
2. 安装检测器:
   1. 将电压输出设置为700毫伏, 温度为32和 #176; C 在探测器烤箱上; 这是非常重要的。使用在线手册制作一个范围的程序。请参阅手册以了解详细信息)。按 表 2 添加时间程序.
      注: 在本研究中, 该程序设置为自动改变电流在设定的保留时间, 以保持 HPLC 在最佳电流和保持色谱的峰值尽可能扩大, 但仍在视野内。这是优化了纹脑裂解从小鼠.
3. 当程序已添加到检测器中时, 通过注入标准三次 (5、10和15和 #956; L).
   注: 标准 (10 和 #956; l (10 和 #956; l x 0.1 pmol/和 #956; l = 1 pmol DA)) 应每第十样品注射一次, 并将样品校准到最接近的标准。微调系统的前一天, 调整3点标准, 并检查是否色谱在预期范围内出来。如果观察到大量噪音, 则更改移动阶段。如果一个峰值大于 990 mV, 然后重新在一个较低的体积样本, 或做一个新的范围程序和新的标准曲线。检测限制被测量为3倍的噪声值的 mV, 以最低峰值为每个标准注入的值 (NA, DOPAC, DA, 5-5-hiaa, HVA, 3 MT 和 5 HT)。 通过打开 LC 解决方案并激活分析,
   1. 设置系统 1; 这从联机模式开始。键入用户 ID 和密码, 然后单击 "确定"。等待 LC 解决方案连接到仪器。转到批处理表并填写数据信息 ( 例如 , 示例类型: 未知的样本和标准的 std, 分析类型: 它 QT, 注射量:10, ISTD amt: 1 级骗局)。保存文件 (转到文件和 #62; 将批处理文件保存为 #62; 保存).
   2. 通过按下和 #39 使系统注入第一个样本; 启动批处理和 #39;。这将导致注入10和 #956; L 样品由样与溶剂交付模块.
      注: 使用0.15 毫升/分钟的泵流量和反转相的 C18 柱。这里使用了电化学检测的安培检测器。玻碳电极应设置为 0.8 V 与银/氯化参考电极。为了测定多巴胺, 使用色谱3和 #181; ODS (3) C18 (DA 2 mm x 100 mm, 粒度3和 #181; m) 来实现色谱分离.
   3. 提取记录和计算的峰值区域。 当样本完成时,
      1. 转到数据获取以跟踪色谱。转到 Lc 后运行分析-和 #62; 选择文件名 (色谱将打开)-和 #62; 单击 "查看"。在手动集成栏上, 添加所有要集成的峰值 #62; 转到数据报表并打印读出.
         注: LC 解决方案软件用于数据分析和系统控制.
4. 从峰值区域计算样本中多巴胺的浓度, 如下所示, 使用标准的已知浓度:
   1. 使用标准的峰值区域 (等于 1 pmol) 来获取因子 a.
      
   2. 使用因子 A 获取样本的浓度.
      样品浓度 (pmol 每10和 #956; L) = 因子 A 和 #215; 示例的峰值区域
   3. 使用此公式获取 ng 中的样本浓度.
      样品浓度 pmol/10 和 #181; L x 500 和 #181; L x 兆瓦多巴胺 = 样品集中在 ng
      样品浓度 (ng) = 样品浓度 (在 pmol 每10和 #956; l) 和 #160; x 500 和 #956; x 兆瓦多巴胺
   4. 使用 ng 中的样品浓度得到 t他的样本浓度在 pg/g 组织 (样本浓度在 pg/组织 g = pg/g 组织).

当前 DA 摄取协议 (图 1) 包括评估突中的 DAT 功能所需的所有步骤。我们的 DA 吸收方法 (图 2) 的代表性数据描述了带有未调整数据的饱和曲线 (图 2B) 和调节的数据 (图 2A)。饱和曲线显示野生型小鼠的摄取量。通常一个会使 DA 吸收与突变的小鼠相比, 这将导致一个饱和曲线为每个基因型5。在这种情况下, 野生类型和突变小鼠之间的差异在2A 和2B 可以解释多种因素。实验者在遵循协议的每一步时越彻底, 在描述原始 (2B) 和蛋白质调整 (2A) 数据之间的差别就越小。区别的最明显的原因是 i) 不精确的称量组织在步骤 1.2.6, ii) 丢失的组织, 而转移到和从均匀玻璃在步骤 1.2. 8-1. 2.10 和 iii) 在步骤1.2.13 中转移上清的不精确性和在台阶1.2.14 中去除上清液。我们建议对野生型小鼠进行初步实验, 以提高其精确度。

多巴胺-高效液相色谱法 (图 3) 包括了 dStr 和 NAc 小鼠所需的所有步骤。我们的代表性数据 (图 4和表 3) 描述了对野生类型小鼠进行的实验结果。

图 1: 示意图工作流描述了触 DA 吸收实验协议中的不同步骤.小鼠被颈脱位所牺牲, 其次是脑解剖和大脑基质的放置。一个3毫米厚的冠状切片从大脑中解剖, 细的解剖是由一个小区域在胼胝体下方的双边拳打。背纹状体在1毫升均匀化缓冲液中经机械干扰, 在低速时采用10分钟离心法进行匀浆。上清液转移到一个干净的管和离心在高速20分钟。含有突的球团是悬浮的, 可以进行吸收实验。吸收是通过添加 triplicates 的不同的 [3H]-DA 浓度, 从最后的浓度0.031 至1微米不等。此外, 氚 DA 的不同浓度被添加到含有500μ m 可卡因的控制样品中。最后, 对样本进行了计数, 并进行了数据分析, 揭示了 DAT 的饱和曲线.请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 来自 Drd1a-cre 鼠品系的四 C57Bl/6 野生型小鼠的触 DA 摄取实验的代表性结果.(A) 具有代表性的数据, 描述通过野生型小鼠触制剂的 DAT 吸收 da 的饱和曲线 (n = 4)。黑点是分别显示的四只小鼠的值, 绿色曲线显示了数据通常是如何通过组合每组4-6 只老鼠的数据来描述的。该图结合了四只老鼠的数据。(B) 原始数据的饱和度图, 不调整样品的实际蛋白质浓度。实质上, 它是. (C) 控件数据中数据的未经调整的版本。该图显示了含有可卡因的样品的计数, 这些样本用于减去吸收数据的背景。此控制对于确定摄取数据的可靠性非常重要, 但很少在文章中显示。如果这个数据由于某种原因不显示线性, 它表明一个关键问题与设置, 需要被辨认和解决从数据推断任何东西。R 平方: n1 = 0.9852, n2 = 0.9584, n3 = 0.9606, n4 = 0.9913。(D) 显示 DAT (VMAX) 的吸收容量的直方图。VMAX = 43.13 ± 3.2 fmol/分钟/微克蛋白)。数据显示为均值± SEM. (E) 直方图显示为 dat 为0.1 ±0.03 μ m 的 k 的m对应于旋转圆盘伏安法, 描述 dat 的 km值为0.6 μ m19。0.1 μ m 的 km值也对应于0.22 μ m 的 km值, 这些数值是由纹状体20、21中受刺激的 DA 溢出刺激模型获得的。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: 描述高性能液相色谱协议中不同步骤的示意图工作流.小鼠是由颈椎脱位, 其次是脑解剖和大脑基质放置牺牲。从大脑中解剖一个3毫米厚的冠状切面, 通过双边击打两个较小的区域进行精细解剖, 将纹状体分为 dStr 和 NAc。组织是匀浆的, 其次是快速离心。在 HPLC 法中, 以已知 DA 浓度和样品中的清为标准, 生产谱。不同峰的面积用于计算在直方图中描述的样本中 DA 的浓度。请单击此处查看此图的较大版本.

图 4: 高效液相色谱实验的代表性结果.(A) HPLC 色谱法对10μ l 样品从 dStr 注射到 C18 (2 毫米 x 100 毫米) 柱用于小分子。保留时间;去甲肾上腺素 (NA), 3.7 分钟6.7 分钟二酸 (DOPAC), 8.3 分钟 DA, 10.7 分钟 5-hydroxyindoleacetic 酸 (5-hiaa), 15.3 分钟香草酸 (HVA), 18.8 分钟 3-methoxytyamine (3 MT) 和20.8 分钟 5-5-(5-HT)。本研究仅计算 DA 峰值的值。(B) 直方图显示 DA 在 NAc 和 dStr 中的浓度基于 chromatrogram。纹区的 HPLC 分析, 包括 dStr 和 NAc C57BL/6 小鼠 (n = 7)。数据显示为平均值表示电阻的变化, 并已手动添加到色谱中. 请单击此处查看此图的较大版本.

表 1: 触准备的离心管布局。

表 2: HPLC 时间程序在本研究中的应用。

表 3: 峰值分析, 显示用于计算所示浓度的不同峰值的面积和高度图 4B.

作者没有什么可透露的。