突触体多巴胺摄取与高效液相色谱分析是研究小鼠多巴胺稳态的实验工具，分别用于评估多巴胺转运体功能和纹状体组织中多巴胺水平。本文中，我们提供了测定多巴胺组织含量及评估多巴胺转运体功能的实验方案。
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摘要
摘要
多巴胺（DA）是一种调节性神经递质，控制运动活动、奖赏过程和认知功能。多巴胺能（DAergic）神经传递功能受损与多种中枢神经系统相关疾病密切相关，例如帕金森病、注意缺陷多动障碍和药物成瘾1,2,3,4。阐明涉及多巴胺失衡的疾病机制在很大程度上依赖于动物模型来模拟疾病的某些方面，因此评估多巴胺稳态特定环节的实验方案对于揭示这些疾病的新型机制和潜在治疗靶点具有重要意义。
本文介绍了两种实用的实验方案，结合使用可实现对小鼠多巴胺能系统功能的检测。通过检测多巴胺（DA）水平和多巴胺转运体（DAT）功能，可以获得关于DA稳态的生化和功能参数5。在研究DA系统时，能够可靠地测定成年动物脑内源性DA水平至关重要。因此，本文展示了如何对小鼠脑组织进行高效液相色谱（HPLC）分析以测定DA含量。实验以背侧纹状体（dStr）和伏隔核（NAc）组织为例进行，但该方法同样适用于其他多巴胺能神经支配的脑区。
多巴胺转运体（DAT）对于多巴胺（DA）重摄取至突触前末梢至关重要，从而调控释放的DA在时间和空间上的活性。在评估多巴胺稳态时，了解纹状体中DAT的表达水平及其功能状态具有重要意义。本文提供了一种实验方案，可通过突触体6多巴胺摄取实验，同时获取关于DAT表面表达水平及其功能的信息。
现有方法结合标准免疫印迹实验方案，为研究人员提供了表征多巴胺能系统的重要工具。
引言
多巴胺（DA）是一种调节性神经递质，在运动行为、奖赏机制和认知功能中起关键作用1,7,8,9。DA稳态失衡与多种神经精神疾病相关，例如注意缺陷多动障碍、药物成瘾、抑郁症和帕金森病1。DA由突触前神经元释放至突触间隙，在此结合并激活突触前膜和突触后膜上的受体，从而进一步传递信号。释放后突触中DA的水平由DAT在空间和时间上进行调控3,10。该转运体可将DA从细胞外空间摄取回收，从而维持生理浓度的DA水平3,11。在小鼠中基因敲除DAT会导致一种高多巴胺能表型，其特征为突触DA水平升高、细胞内DA储存池耗竭以及突触后多巴胺能信号传导的显著改变10,12。
本文介绍了两种独立的实验方案，一种用于测定多巴胺（DA）组织含量，另一种用于评....
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方案
遵循丹麦动物实验监察局的指导方针（许可编号：2017-15-0201-01160），实验在本地动物福利委员会监督下，于完全通过AAALAC认证的设施中进行。
1. 突触体多巴胺摄取（方法1）
注意：本方案适用于两个脑组织的平行评估，但也可成功用于同时对四个脑组织进行突触体多巴胺（DA）摄取实验。
- 准备工作
- 根据表1标记48个1.5 mL微量离心管（每个脑组织样本24个）。为每个脑组织样本使用不同颜色的离心管，以避免样本混淆
- 标记51个闪烁瓶，编号#1–51。
- 将磷酸盐缓冲液（PBS）置于冰上，用于保持脑组织低温。
- 开启离心机，使其预冷至4 °C。
- 预先称量两个微量离心管，以在突触体分离步骤（第2.6节）中获得精确的组织重量。
- 通过混合4 mM HEPES和0.32 M蔗糖制备匀浆缓冲液。用NaOH调节pH至7.4，并置于冰上保存。
注：匀浆缓冲液可分装后于-20 °C保存，并在实验当天解冻使用。 - 通过以下成分配制摄取缓冲液：25 mM HEPES、120 mM NaCl、5 mM KCl、1.2 mM CaCl2、1.2 mM MgSO
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结果
当前的多巴胺（DA）摄取实验方案（图1）包含评估小鼠突触体中多巴胺转运体（DAT）功能所需的所有步骤。本研究中代表性DA摄取实验结果（图2）展示了野生型小鼠的饱和曲线，包括未经蛋白量调整的数据（图2B）和经蛋白量调整后的数据（图2A）。通常，实验会将野生型小鼠与突变型小鼠进行比较，从而获得每种基因型的饱和曲线5。在此情况下，图2A和2B中野生型与突变型小鼠之间的差异可能由多种因素导致。实验人员若能更严格地遵循方案中的每一步操作，则原始数据（2B）与蛋白量调整后数据（2A）之间的差异将越小。造成差异的最明显原因包括：i）步骤1.2.6中组织称重不准确；ii）在步骤1.2.8至1.2.10中，将组织转移至匀浆玻璃器或从中取出时发生组织损失；iii）步骤1.2.13中上清液转移不精确，以及步骤1.......
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讨论
本文描述了可用于阐明任意小鼠模型中多巴胺稳态的实用实验方案。我们提供了使用高效液相色谱法（HPLC）测定小鼠脑组织中多巴胺水平以及通过突触体多巴胺摄取实验评估多巴胺转运体（DAT）功能活性的详细操作步骤。下文将详细阐述HPLC实验和突触体多巴胺摄取测定的相关操作、方案及其局限性。
突触体摄取实验方案可为多巴胺转运蛋白（DAT）的功能提供有价值的见解。结合细胞表面生物素化实验13，可获得关于DAT的总量、表面表达水平及其功能性的信息。鉴于DAT在多巴胺传递中的关键作用及其在多种疾病中的参与，建立能够模拟DAT功能的检测方法已成为重要目标。突触体多巴胺摄取实验的一个优势在于，该实验可在死后 体内 化学遗传学操作以及其他不同操作 体内 药物处理或行为训练，以及对基因修饰小鼠的研究。药物处理可在突触体分离制备后进行，而非 体内 如有需要，可直接检测药物对DAT的作用效果22.
除了进行突.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了哥本哈根大学2016年卓越计划（U.G.、A.R.、K.J.）、伦德贝克基金会（M.R.）、伦德贝克基金会纳米医学生物膜研究中心（U.G.）、美国国立卫生研究院基金P01 DA 12408（U.G.）以及丹麦独立研究理事会—医学科学（U.G.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| COMT抑制剂 | Sigma Aldrich，德国 | RO-41-0960 | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 |
| [3H]-多巴胺 | 美国马萨诸塞州波士顿，珀金埃尔默生命科学公司 | NET67-3001MC | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 |
| 玻璃微纤维滤膜 | GF/C 玻璃纤维滤膜，Whatman，GE Healthcare Life Sciences，白金汉郡 | 1822-024 | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 |
| HiSafe 闪烁液 | Perkin Elmer | 1200-437 | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 | |
| BCA 蛋白检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 Pierce | 23225 | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 |
| HEPES | Sigma生命科学 | H3375 | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 |
| 蔗糖 | Sigma生命科学 | S7903 | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 |
| NaCl | Sigma生命科学 | S3014 | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 |
| KCl | Sigma生命科学 | P9541 | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 |
| CaCl2 | 默克股份公司 | 10043-52-4 | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 |
| MgSO4 | Sigma生命科学 | 63065 | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 |
| 抗坏血酸 | Sigma生命科学 | A0278 | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 |
| D-葡萄糖 | Sigma生命科学 | G7021 | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 |
| 地昔帕明 | Sigma Aldrich | D3900 | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 |
| 多巴胺 | Sigma生命科学 | H8502 | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 |
| 可卡因 | Sigma生命科学 | C5776 | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 |
| 脑基质 | ASI 仪器 | RBM2000C | 用于突触体多巴胺摄取实验的方案 |
| Cafano 机械聚四氟乙烯匀浆器 | 布赫 &和 Holm | 已停止 | 用于突触体多巴胺摄取实验的匀浆步骤 |
| Antec Decade（安培检测器） | Antec，荷兰莱顿 | 已停用：新型号 DECADE Elite / Lite™ 电化学检测器型号 175 和 176 | 高效液相色谱法实验方案 |
| Avantec 0.22 μm 玻璃滤膜 | Frisenette ApS，丹麦 | 13CP020AS | 高效液相色谱法实验方案 |
| 色谱柱：Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex，YMC Europe，Chermbeck，德国 | 部件编号：00A-3300-E0 | 高效液相色谱法实验方案 |
| LC 溶液软件 | 岛津 | LabSolutions 系列工作站 | 用于高效液相色谱（HPLC）方案 |
| 高氯酸 0.1 M | Fluka 分析 | 35418-500ml | 高效液相色谱方案（组织制备） |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | 用于高效液相色谱（HPLC）方案 |
| 磷酸二氢钠 | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | 高效液相色谱法实验方案 |
| 辛烷磺酸钠一水合物 | Aldrich | 74885 -10g | 高效液相色谱实验方案 |
| 乙腈，等度高效液相色谱级 | Scharlau | AC03402500 | 高效液相色谱法实验方案 |
| 0.22 μm 滤器 | Frisenette ApS，丹麦 | Avantec 13CP020AS | 高效液相色谱方案（组织制备） |
| 85% 正磷酸 | 默克 | 1.00563. 1000毫升 | 用于高效液相色谱（HPLC）方案 |
| 电极 | Antec，荷兰莱顿 | AN1161300 | 高效液相色谱法实验方案（参见在线手册） |
| DECADE II 电化学检测器上的检测器程序 | Antec，荷兰莱顿 | 轻量版™ 电化学检测器型号 175 和 176 | 高效液相色谱法实验方案 |
参考文献
- Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and tr....
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