利用唾液酸糖微阵列检测技术分析人血清中抗Neu5Gc IgG

摘要

唾液酸聚糖微阵列检测可用于评估人血清中的抗Neu5Gc抗体，因此有望成为一种用于癌症及其他慢性炎症介导的人类疾病的高通量诊断检测方法。

摘要

细胞表面覆盖着一层碳水化合物链（聚糖），这种聚糖在癌症中常发生改变，其中包括唾液酸（Sia）表达的变化。唾液酸是一类具有9个碳骨架的酸性糖，位于脊椎动物细胞表面聚糖的末端。哺乳动物中两种主要的唾液酸形式是 N-N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）及其羟基化形式， N-N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）。由于编码胞苷5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸（CMP-Neu5Ac）羟化酶（CMAH）的基因失活，人类无法内源性合成Neu5Gc。人体细胞通过摄入红肉和乳制品获得外源性Neu5Gc，并将其整合至细胞表面多种糖链上，尤其在癌组织中大量积累。因此，人体内存在循环抗Neu5Gc抗体，这些抗体在癌症及其他慢性炎症相关疾病中发挥多种作用，并正成为潜在的诊断与治疗靶点。本文介绍一种高通量唾液酸糖微阵列检测方法，用于评估人血清中的抗Neu5Gc抗体。含有Neu5Gc的糖链及其对应的对照糖链（含Neu5Ac的糖链），每种均带有核心伯胺基团，共价连接于环氧基修饰的玻片表面。我们以特定纳米点样仪为例，展示在16孔板格式下打印56张玻片的过程，每次打印最多可生成896个微阵列。每张玻片可用于同时筛查16份不同的人血清样本，以评估抗Neu5Gc抗体的特异性、强度及多样性。本方案详述了该稳定检测工具的操作复杂性，并为拟在微阵列平台上研究不同临床样本对Neu5Gc饮食性碳水化合物抗原免疫应答的研究者提供基本操作指南。

引言

唾液酸（Sias）是一类酸性糖，覆盖在脊椎动物细胞表面糖蛋白和糖脂的聚糖链上。在癌细胞中，唾液酸的表达会发生改变¹，并与肿瘤进展和/或转移相关^2,3。哺乳动物中两种主要的唾液酸形式是 Neu5Ac 及其羟基化形式 Neu5Gc²。由于编码 CMAH 酶的基因发生特异性失活，人类无法合成 Neu5Gc。这种非人类来源的唾液酸可通过富含 Neu5Gc 的饮食（例如红肉）进入人体，并在代谢过程中整合到人类细胞中，表现为"自身"成分^4,5。Neu5Gc 在人体上皮和内皮细胞表面以低水平存在，但在癌组织中尤其富集。人体体液免疫系统可识别 Neu5Gc 为外来抗原^2,6。Neu5Gc-聚糖的抗原复杂性可能在多个层面产生，包括 Neu5Gc 的修饰方式、连接类型、基础聚糖结构与支架，以及其密度，这些均反映在人类抗-Neu5Gc 抗体反应的复杂性上⁶。其中部分抗体可作为癌组织的生物标志物，并具有潜在的免疫治疗价值⁷。化学-酶法合成不同唾液酸聚糖技术的发展⁸，结合聚糖微阵列技术的应用^9,10，为深入分析此类抗体提供了可能。因此，随着大量天然和合成碳水化合物库的制备与操作变得更加便捷，聚糖微阵列已成为研究碳水化合物与多种生物分子相互作用的强大高通量技术^10,11,12,13。在微阵列格式中，仅需极少量样品，且通过多价展示具有生物学意义的聚糖，可在单次实验中检测数千种结合相互作用。重要的是，该技术还可用于生物标志物的发现，以及监测各类样本中的免疫应答^7,12。

成功的糖芯片制备需要考虑三个关键因素：打印机器人类型、糖链偶联化学方法以及检测光学系统。在打印仪器的选择方面，目前有两种技术可用：接触式和非接触式打印机。在接触式打印中，1-48根钢制针头浸入含有糖溶液的多孔源板中，通过直接接触功能化玻片表面的方式将溶液点样到玻片上。点样到玻片上的溶液量取决于针头在玻片表面停留的时间。通常，样品首先预点样于玻璃块上（以获得均一的点样斑点），然后再转移至玻片表面进行正式打印。在非接触式打印机（例如，压电式打印机）中，糖分子通过玻璃毛细管并在可控电信号作用下完成打印。电信号可精确调节，从而实现比接触式打印更精确的点样效果。所得斑点的尺寸和形态也相对更加均一。另一个优点是打印后样品可回收至源板中。然而，压电式打印机的主要缺点是打印喷头数量有限（4或8个），导致打印时间非常长，因此必须特别关注玻片的稳定性、温度、湿度以及样品蒸发问题。非接触式喷墨打印机需要较大的样品体积¹⁴。

与有限的打印方法可选性相比，聚糖偶联化学更为复杂，具有多种选择。所选用的固定化化学方法必须同时考虑聚糖上的活性基团以及载玻片表面的反应性。无论是化学合成还是天然分离的聚糖，在固定到特定微阵列表面时，均需具有相同的反应性基团。此外，聚糖必须纯净且均一。另一方面，固定化表面及化学方法应能提供可重复性和可靠的结合密度。目前已开发出多种固定化方法，包括共价结合和非共价（物理吸附）结合^10,11,12,13。对于初次接触聚糖微阵列技术的研究人员，可参考这些优秀的综述文章^13,15。尤为重要的是，近期提出的聚糖组学实验最低信息要求（MIRAGE）倡议，为样品制备¹⁶以及聚糖微阵列分析数据的报告¹⁷提供了指导原则，以提升这一快速发展领域的标准化水平。

本文介绍了一种使用特定接触式纳米打印机以16孔板格式制备唾液酸聚糖微阵列的详细方案。每种聚糖均含有一个伯胺基团，可通过该基团共价连接至环氧活化的玻片表面。我们还描述了利用多种人血清样本、抗体以及唾液酸结合植物凝集素对一张微阵列玻片进行检测与分析的过程。唾液酸聚糖微阵列实验主要包括微阵列制备、处理、显色及数据分析等关键步骤。微阵列的制备需预先设计阵列布局，准备聚糖样品及源板，编程控制纳米打印机，并完成玻片打印。随后，对玻片进行后续处理、显色反应和数据分析（图1）。

方案

人血清样本取自以色列血库，并根据赫尔辛基宣言和特拉维夫大学机构审查委员会的规定使用。

1. 芯片制备规划与布局

1. 确定载玻片布局。
   注：每张载玻片包含16个子阵列，分为16个相同的区块，编号为B1至B16（图1B，补充图1A）。
2. 确定点样针布局。使用四根点样针，每根针在每张载玻片上打印四个子阵列（区块）：
   针1打印区块1、2、9和10；
   针2打印区块3、4、11和12；
   针3打印区块5、6、13和14；以及
   针4打印区块7、8、15和16（补充图1A）。
3. 确定区块及384孔板布局。
   注：每块中糖类出现的顺序需仔细规划。在此示例阵列中，每个样本打印四个重复，设计荧光标记点位于右下角（以方便点阵分析），并在六个递增浓度下打印标准曲线IgG（STD）点（补充图1B）。
   1. 对于每个打印的点，首先将材料分别加入384孔板中的四个孔中（每根针对应一个孔）。
      注：材料在384孔板中的顺序取决于所设计的区块布局（补充图1B-C）。

2. 糖链和来源板的制备

1. 配制糖链打印缓冲液（300 mM 磷酸盐缓冲液 50 mL，pH 8.4）。称取 58.5 mg 一水合磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·H₂O）₂PO₄.1H₂O) 和 3.9 克七水合磷酸氢二钠（Na₂HPO₄.7H₂将40 mL去离子水（DIW）中的O调节至pH 8.4，使用4 M NaOH进行滴定。加水定容至50 mL，并通过0.2 µm膜过滤以实现灭菌。
2. 制备标记缓冲液（50 mL 187 mM 磷酸盐缓冲液，pH 5）。称取 289 mg 一水合磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·H₂O）₂PO₄.1H₂O) 和 1.94 g 七水合磷酸氢二钠（Na₂HPO₄.7H₂将40 mL去离子水中的O调节至pH 5，使用1 M HCl进行滴定。加水定容至50 mL，经0.2 µm滤膜过滤以实现灭菌。
3. 配制标准曲线缓冲液（50 mL PBS-甘油：磷酸盐缓冲液，pH 7.4，添加10%甘油（来自100%甘油储备液）），并通过0.2 µm滤膜过滤以实现灭菌。
4. 以去离子水配制每种糖链的储存液至10 mM。通过反相高效液相色谱分析结合荧光检测验证唾液酸化糖链的浓度。¹⁸.
5. 将每种聚糖用糖芯片打印缓冲液稀释至100 µM，总体积为100 µL，置于微量离心管中。
6. 制备含伯胺的荧光染料。用标记缓冲液将Alexa 555-酰肼溶解至1 mg/mL，然后在总体积1 mL中稀释至1 µg/mL。
   注意：可根据切片扫描仪选择其他含伯胺的染料，并使用适当的激发波长。
   注意：在分析过程中，标记点有助于每个区块的网格对齐。
7. 制备人IgG标准曲线稀释液：用STD曲线缓冲液配制0.5 mL浓度为160 ng/µL的人IgG储备液。将该储备液用STD曲线缓冲液依次1:1倍比稀释六次，得到浓度分别为80、40、20、10、5和2.5 ng/µL的标准品，每管总体积均为200 µL。
   注意：如果适合实验，可使用其他Ig同种型（例如， 人IgA、IgM、IgE或来自其他生物的Ig
8. 将384孔板置于冰上。使用电子多通道移液器，根据板式布局，每种糖、标记物和标准曲线IgG各取7 µL，每样四复孔，进行分装。补充图1C）。为获得更高的准确性，每份样品取 35 µL，并将其中 7 µL 分别加入样品的四个孔中。将剩余的 7 µL 每种糖链放回其原始管中。
9. 用封口膜覆盖培养板，在250 × g、12 °C条件下离心2分钟。将培养板置于室温（RT）避光保存。在室内湿度达到60–70%之前，不得揭开培养板。

3. 编程纳米打印机

1. 打开 "微阵列管理器" 软件。使用 "方法特性" 窗口。
2. 设置工作台布局：选择 "56 片配置"
   注意：此为预设配置，可用于打印56张载玻片。针对每种类型的培养板、针头和打印格式均需进行校准补充图2，步骤1）。
3. 选择 "引脚配置" | "1x4 9 mm 针式工具"
   注意：此为使用四个针脚的预设配置（补充图2，步骤 2）。
4. 定义 "针型" 计算并创建适合打印的销钉类型。
   注意：此步骤用于确定一个点样针在重新浸入样品384孔板之前可打印的点数，应根据不同类型的点样针和载玻片表面化学性质进行优化。
   注意：使用 946MP3 点样针时，需考虑两个重要问题：1）每根针最多可点样 140 个均一的点；2）在玻片上正式点样前，必须进行预点样，以去除针尖多余的液体。因此，应设置每根针在预点样模块上预先点样 20 个点（该程序已针对环氧涂层玻片上的 946MP3 点样针优化）。
   1. 计算每个样本的打印点总数。
      注意：此处每个点样针每子阵列（区组）打印4个点，每张载片包含4个子阵列，共16个点/载片。经过7张载片后，每个点样针共打印16 × 7 = 112个点。此外，点样前还有20个预点样点，总计每次蘸取需打印132个点。因此，该点样针类型被定义为 "946MP3-132 斑点" （每块每样本4个点 × 4块 × 7张载玻片 + 20个预点 = 132）
   2. 创建 "针型" (补充图2，步骤3）。按压 "设置" （软件的左侧面板）| "微点样针" | "新名称" （946MP3-132 点）。设定每次浸入的点数（132）、点直径（100 µm）、吸液量（0.25 µL）、递送量（0.7 nL）以及最小点间距（100 µm）。按下 "好的" | "好的。"
   3. 在 "方法特性" 窗口中，选择已创建的引脚类型： "946MP3-132 斑点"
5. 定义洗涤条件。设定 "开始前清洗" 和 "完成后的清洗" 到 "常规洗涤" (补充图2，步骤4）。
6. 定义 "平板列表"
   注意：此为根据 384 孔板布局设定的取样模式（从 384 孔板中蘸取的顺序）。要将该板上传至板列表中，需设置板的取样模式。
   1. 制备平板 "采样模式" 前往 "模板" (补充图3) | "采样模式" 赋予一个新名称例如， JoVE 阵列）并选择 "插入" | "填充顶部到底部" | "Pin Tool 1 × 4 9 mm" 根据预定义的孔板布局选择移液顺序（补充图1A）。按压 "好的" | "好的。"
   2. 加载平板取样模式。点击右侧的 "平板列表" 细胞补充图3) | "加板" 并选择正确的平板取样模式（ "JoVE 阵列" 步骤3.6.1中所述）。选择 "常规洗涤" 按压 "好的" | "好的。"
7. 前往 "样本板" 并将位置偏移量更改为 1（该参数决定平板在阵列仪载台上的位置）。
   注意：0 偏移位置更靠近超声波清洗仪浴槽。
8. 定义 "微阵列打印设计" 计算模块间的距离和间距。
   1. 考虑使用一种分隔工具，该工具可将载玻片划分为16个7 mm × 7 mm的微孔，亚阵列之间间距为2 mm（块间总间距为9 mm）； 补充图4).
   2. 考虑子数组的维度。
      注意：点阵之间的间距为0.275 mm，此打印设计包含12列和18行；总尺寸为：宽度（11 × 0.275 mm = 3.025 mm）和高度（17 × 0.275 mm = 4.675 mm）。计算水平间距：9 mm - (11 × 0.275 mm) = 5.97 mm。计算垂直间距：9 mm - (17 × 0.275 mm) = 4.325 mm。计算距载玻片左侧的距离：4.43 mm + 1.07 mm = 5.5 mm。计算距载玻片顶部的距离：2.95 mm + 0.55 mm = 3.5 mm。补充图4).
   3. 定义 "打印设计" (补充图5选择 "模板" | "打印设计" | "新。"
      1. 选择 "引脚设置" | "销钉工具 1 x 4 9 mm" | "Pin - 946MP3-132 点阵" 在 "通用" 标签，更改 "微阵列打印名称" (即， "JoVE 阵列"选择 "点速度" | "重复次数" (4) | "触点高度" （0 毫米）| "轻触高度" （3 毫米）| "打印至所有可用位置" (补充图 5A).
      2. 在 "微阵列" 选择水平和垂直间距（来自步骤 3.8.2 的 5.9 mm 和 4.325 mm）以及水平和垂直微阵列的数量（2）。选择 "水平打印微阵列" | "打印重复微阵列" (补充图 5B).
      3. 在子阵列选项卡中，选择最大列数（12）、最大行数（18）以及列与行之间的距离（275 µm）补充图 5C).
      4. 在测量选项卡中，选择载玻片左侧的距离（5.5 mm）、载玻片顶部的距离（3.5 mm，按步骤 3.8.2 计算）、打印载玻片的宽度（25 mm）以及打印载玻片的高度（75 mm）补充图 5D）。按压 "好的" | "好的。"
9. 点击右侧的 "微阵列打印设计" 细胞并选择已定义的设计（该 "JoVE 阵列" 来自步骤 3.8.3； 补充图6).
10. 定义 "细胞计数" (56)，并更改 "位置偏移" （0）这决定了阵列仪载台 上第一个载玻片的打印位置补充图6).
11. 定义 "微阵列预印设计" (补充图6）。选择 "玻璃块" | "预印1 x 4毫米针具"
    注意：此点间距设置可在玻璃块上预点46,464个点（适用于所有4个点样针），即每个点样针可预点46,464 / 4 = 11,616个点。当预点样块上的空间用尽后，打印机将停止运行，此时需要将点样块翻转。
    注意：要计算预点样玻璃块在处理多少个样本后会填满，请考虑以下情况：每个样本在384孔板中通过8次针头浸入完成56张载玻片（每次浸入点7张载玻片），每次浸入额外产生20个预点样位点，因此每个样本总共产生160个预点样位点。因此，11,616 / 160 = 72.6 个样本。故在处理72个样本后需翻转预点样玻璃块（为评估翻转所需时间，可测量单个样本在56张载玻片上完成全部运行所需时间，再乘以72）。
12. 选择 "使用预印设计" | "是" | "扫描条形码" （无） "打印单个重复组" （无）补充图6).
13. 点击 "验证" (补充图6).
14. 点击 "保存" 并将方法保存为 arr 文件（例如， "JoVE 阵列.arr" 补充图6).

4. 打印设计的阵列

注意：所有步骤均应在湿度为60-70%的洁净室中进行，并佩戴适当的手套和防护服装

1. 打开纳米打印机和加湿器。
2. 为清洗缓冲液和加湿系统加入去离子水。清空清洗瓶（排水口）和加湿器捕集瓶（大容量容器）（补充图 7A）。
3. 将加湿器设置为 70% 湿度，并开始加湿。
4. 打印前清洁所有点样针。准备 50 mL 热的（65 °C）针尖清洗液（将 15 g 针尖清洗试剂加入 50 mL 65 °C 水中，充分混合至固体试剂完全溶解）。
   1. 通过将针尖刷（细型）浸入针尖清洗液中，然后刷洗每个针尖表面，以对针尖进行清洗。
      注意：针尖清洗液具有腐蚀性和毒性。使用该溶液时必须始终佩戴手套和护目镜。将针浸泡在针尖清洗液中超过几分钟可能导致针永久性损坏。
   2. 在超声波清洗槽中加入 1 L 蒸馏水，将针放入可漂浮的针清洗架中并置于槽内。超声处理 5 分钟后取出针，晾干后用洁净室专用擦拭纸轻轻擦拭。
5. 打开 "Microarray Manager" 打印机软件；连接成功后，打印机指示灯将亮起（红色/绿色）。按下 "Stop" | "Clear" | "Init"（补充图 7B，步骤 1–3）；打印头臂将重置 X、Y、Z 方向的对准位置。
6. 要将针装入打印头，请按下 "Load"（补充图 7B，步骤 4），然后根据预设的打印/点样针工具布局将针放入打印头中（补充图 7C）；该布局使用 4 根针，每根针在每张载玻片上打印 4 个子阵列，从而每张载玻片共获得 16 个子阵列（补充图 1A）。放置好针后，再次按下 "Init"。
7. 在点样仪平台上组装载玻片。打开载玻片盒，用超高纯度氮气吹扫每张载玻片以清洁表面。将所需数量的载玻片放置在点样平台上。用两根手指捏住载玻片底部两个角，将其放入指定位置。握住右侧两个角，轻轻推动左侧两个角，直到载玻片紧密贴合到位。再轻轻向左下角方向推动，以确保牢固贴合（补充图 7D）。
8. 用蒸馏水、70% 乙醇和 100% 乙醇清洗预封闭玻璃片，然后自然晾干（仅使用专用洁净室擦拭纸）。将预封闭玻璃片放入平台上的指定位置。
9. 填充超声波清洗槽（补充图 7B）。按下 "Fill" 持续 55 秒，然后按下 "OK"。通过点击 "Drain" 排水 20 秒，然后按下 "OK"。重复一次填充和排水操作，然后再填充 55 秒。
10. 填充清洗槽（补充图 7B）：按下 "Prime" 持续 40 秒，然后按下 "OK"。
11. 将含有分装样品的 384 孔板放置在点样仪平台的指定位置，并移除封口膜。
12. 开始打印。
13. 打印完成后，排空超声波清洗槽（补充图 7B），并关闭加湿器。
14. 让载玻片在点样仪平台上无加湿条件下干燥 16–24 小时。
15. 使用耐酒精/溶剂的标记笔为载玻片编号，并将其存放在避光的真空密封盒中。

5. 芯片的处理与显影

1. 从真空密封盒中取出一张载玻片，置于化学通风橱中，芯片面朝上，静置5分钟，以挥发多余液体。
2. 以最高增益（950 PMT）扫描玻片，以确保所有点样均已打印。
3. 继续对载玻片上的环氧基团进行化学封闭
   1. 配制 50 mL 乙醇胺封闭液（0.1 M Tris-HCl，pH 8 和 0.05 M 乙醇胺）。将 140 mL 去离子水与 8.8 mL Tris-HCl（1.7 M，pH 8）和 0.45 mL 乙醇胺（16.6 M）混合。转移至 50 mL 染色管中补充图 8A）并升温至 50 °C。
   2. 水合玻片。将玻片放入盛有去离子水的染色管中，用铝箔覆盖，于室温下缓慢轻柔振荡孵育5分钟。
   3. 封闭载玻片上的活性环氧基团。将载玻片浸入装有预热的乙醇胺封闭液的50 mL染色管中，用铝箔覆盖，室温下缓慢轻柔振荡孵育30分钟。
   4. 将乙醇胺封闭液弃入适当的生物危害垃圾桶中，将切片放入装有50 °C去离子水的新而洁净的染色管中。用铝箔包裹，室温下缓慢轻柔振荡孵育10分钟。
   5. 弃去水，并将切片转移至玻璃染色架中（补充图 8B将玻璃染色架放入摆动板架中，在室温下以200 × g离心干燥载玻片5分钟。
4. 设置隔板并进行生物阻断。
   1. 将载玻片放入16孔隔板中（补充图 8C).
   2. 配制 PBST 洗涤液：50 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4，加入 0.1% Tween-20。
   3. 制备生物封闭液（PBS-OVA）：5 mL PBS（pH 7.4）加入1%鸡卵白蛋白（10 mg/mL）。
      注意：封闭试剂的选择对于抗Neu5Gc抗体检测的成功至关重要。卵清蛋白（ovalbumin）来源于鸡，而鸡与人类一样无法合成Neu5Gc，因此不表达这种唾液酸（Sia）。在检测Neu5Gc时，即使存在微量污染物，也可能显著降低检测的灵敏度，有时甚至完全无法检测到抗Neu5Gc的反应性。例如，最常用的封闭试剂牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）本身虽未发生糖基化，但含有携带Neu5Gc修饰的牛IgG污染物，因此在样本中的抗Neu5Gc抗体与点样糖链结合时，会与这些污染物发生竞争结合。^19,20.
   4. 预先润湿各孔。使用多通道移液器将 200 µL PBST 加入载玻片孔中，置于加盖的湿盒内，振荡孵育 5 分钟。
      注意：湿盒是一个玻璃托盘，内含一张湿润的纸巾，并用尼龙膜和铝箔覆盖，以保护样品免受光照。
   5. 轻弹并轻轻拍打至干净的纸巾上以去除 PBST，每孔加入 200 µL PBS-OVA 封闭缓冲液。置于湿盒中，室温下轻轻振荡孵育 1 小时。
5. 在 PBS-OVA 封闭缓冲液中配制一抗稀释液，具体如下所列 表 2.
   注意：为评估该唾液酸聚糖微阵列的质量控制（QC），请使用多种唾液酸（Sia）结合蛋白： Sambucus nigra 凝集素（SNA）源自接骨木树皮，预期可识别 Siaα26； 长白山槐凝集素II （MALII）预期可识别Siaα23；鸡源抗Neu5Gc IgY预期可识别所有含Neu5Gc的唾液酸糖链。此外，使用多种人血清样本以分析抗Neu5Gc IgG的免疫应答。凝集素/抗体/血清的浓度应通过实验进行校准。
6. flick 干 PBS-OVA 封闭缓冲液，每孔加入 200 µL 一抗（每孔最小体积：70 µL），在湿盒中孵育 2 h。
7. 轻拍干燥初级检测试剂，并用PBST洗涤4次（第3次与第4次之间）^rd 和 4^th 洗涤，然后在湿盒中用PBST孵育载玻片5分钟。用PBS洗涤一次。
8. 在 PBS 中配制二抗，具体如下所列 表2.
9. 用PBS轻拍干燥，加入200 µL二抗，室温振荡孵育1小时。
10. 轻拍去除二抗，用PBST洗涤四次（两次洗涤之间间隔3^rd 和 4^th 洗涤，在湿盒中用PBST孵育载玻片5分钟。
11. 小心移除框架，将载玻片放入盛有 PBS 的 50 mL 染色缸中，摇晃 5 分钟。
12. 填充两个玻片染色缸（补充图 8D用去离子水清洗载玻片，将载玻片放入载玻片架中，浸入第一浴液中，快速浸入10次，然后转移至第二浴液中再浸入10次。室温下振荡孵育10分钟。
13. 弃去水，并将玻片转移至玻璃染色架中（补充图 8B；让载玻片自然晾干）。将玻璃染色架放入摆动板架中，在200 × g、室温下离心干燥5分钟。
14. 扫描玻片后，将其存放在避光的真空密封盒中。

6. 芯片扫描与数据分析

1. 打开荧光切片扫描仪，预热5分钟，并启动扫描与分析软件。
2. 设置扫描参数（补充图9A）：使用532 nm波长、100%激光功率、350 PMT增益，平均线数为1，聚焦位置为0 µm，像素尺寸分辨率为10.0 µm。
   注意：扫描参数可根据不同类型的切片、荧光信号强度和分辨率需求进行调整。
3. 扫描已显色的切片。打开扫描仪门，将切片放入，确保阵列面朝下。在软件导航面板菜单中点击绿色的"Play"按钮开始扫描（补充图9B）。
4. 将扫描得到的图像保存为TIFF文件。
5. 准备切片用于分析。选择"Load array list"，并上传相应的GAL文件，该文件用于映射切片上每个区块中的阵列位置（补充图9C）。
   注意：GAL文件包含切片上每个点的位置（X, Y）及其身份信息。该文件可通过打印机软件导出生成，基于384孔源板中的样本标识和预设的打印设计，生成一个以制表符分隔的文本文件。
6. 设置对齐与分析参数。在软件导航面板菜单中点击"Option"按钮（补充图10）。
7. 定义对齐参数：查找圆形特征，在对齐过程中将特征尺寸调整为原始大小的50–350%，限制特征最大移动距离为40 µm，取消因背景阈值未通过而被标记的特征（CPI阈值设为0），在查找区块时估算图像的扭曲与旋转，并启用自动图像配准（10像素）（补充图10）。
8. 定义分析参数：选择W1/532比率、正常标准偏差、分析缺失特征，并进行背景扣除。点击"select"，然后选择"Local feature background median"，设置排除边缘2像素，背景区域宽度为3像素。点击"OK"。将扫描仪饱和度设为默认值（补充图10）。
   注意：背景扣除方法取决于实验设计，可根据具体需求进行调整。
9. 对特征图进行对齐。将程序切换至区块模式（点击"B"），全选所有区块（Ctrl+A），调整阵列图网格位置，并对所有区块执行对齐操作（Alt+Shift+F7）（补充图11）。
10. 优化每个区块内的特征对齐。放大至左上角区块（按"Z"进入缩放模式），再次按下"B"进入区块模式，点击该区块的网格。仅移动该区块的网格，使其与斑点完全对齐，然后按F5键对该选定区块内的特征进行对齐。重复调整网格位置并按F5对齐，直至所有斑点被准确圈定。对全部16个区块逐一执行相同操作，直至所有网格均正确就位。
11. 分析并保存数据。全选所有区块（Ctrl+A），然后执行数据分析（Alt+A）。将分析结果保存（Ctrl+U）为.gpr文件。
12. 在电子表格程序中打开保存的.gpr文件，基于局部背景扣除后的荧光强度（F532-B532）分析每个斑点的信号强度。

结果

芯片打印、孵育与分析：

使用多种糖样本和人IgG标准曲线在16个不同区块内打印唾液酸糖微阵列，需要进行彻底的校准，以确保所有样本在每张芯片的16个区块中以及同一批次打印的所有芯片之间尽可能均匀地打印。因此，在确定具体的打印参数之前，必须进行多次校准实验，包括每种样本的缓冲液组成、芯片类型及生产厂家、384孔板类型、湿度水平、384孔板中的样本体积、每种样本的预打印量、人IgG标准曲线浓度以及标记物类型。此类打印的唾液酸糖微阵列芯片的稳定性已验证可在避光、室温、真空密封盒中保存长达10个月。在每次打印实验中，还通过使用Sia结合凝集素和抗体的质量控制实验进一步监测和验证其均匀性。显色与扫描方案经过优化，通过比较同一批次内及批次间芯片上的样本，以实现一致性和准确性。芯片使用16孔分隔器进行显色，确保各区块之间的适当分离，并采用优化的封闭条件（化学和生物）、洗涤步骤及孵育时间。一抗和二抗检测经过广泛校准，以确保最大检测信号的同时将背景和非特异性结合降至最低。芯片扫...

讨论

成功的糖芯片制备需要周密的规划，并包含方案中的多个关键步骤，包括：（1）设计定义所有后续参数的区块和板布局例如， 距离、间距、样本量和打印）；（2）清洁点样针并确保针具完整性，这对控制点样均一性至关重要；（3）在打印过程中维持高湿度环境，以避免长时间打印过程中样本蒸发，从而影响点样均一性；（4）选择合适的对齐与分析参数，这些参数可能影响实验结果例如， 背景减除方法、阈值和斑点大小的灵活性）

该方法可进一步修改以满足特定的实验设计和目标。例如，可调整预点样次数，以更好地适应每种需打印到芯片上的材料类型。打印过程中的探针清洗步骤可根据不同的打印材料进行优化，采用更短或更长的清洗周期。此外，每次蘸取后探针打印的点样数量也可调整，以增加或减少点样数目，但需针对芯片上使用的每种材料分别进行校准。荧光标记物的类型及其浓度也可根据需要进行修改，前提是该标记物含有适合偶联反应的化学基团即， 用于环氧涂层载玻片的伯胺）。标准曲线的浓度和类型可进一步扩展（例如， 人/小鼠/其他生物 IgG、IgM、IgA 等等。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含伯胺的唾液酸糖链	Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services)	化合物需求请联系 info@glycohubusa.com	打印用糖链
一水合磷酸二氢钠	Sigma	S9638	打印缓冲液组分
七水合磷酸氢二钠	Sigma	S9390	打印缓冲液组分
磷酸盐缓冲液（PBS）	Hy-Labs	BP-507/500D	打印缓冲液/孵育/洗涤缓冲液
Tris碱	Sigma	T1503	载玻片封闭试剂
甘油	Sigma	G-7893	打印缓冲液组分
乙醇胺	Thermo-Fisher Scientific	0700/08	载玻片封闭试剂
卵清蛋白（V级）	Sigma	A5503	载玻片封闭蛋白
Tween-20	Sigma	P7949	载玻片洗涤去垢剂
Alexa 555-酰肼	Thermo-Fisher Scientific	A20501MP	芯片标记物
ChromPure人IgG全分子	Jackson Immunoresearch	009-000-003	打印组分
生物素化SNA	Vector Laboratories	B-1305	植物凝集素 – 结合Sia-alpha2–6连接
生物素化MALII	Vector Laboratories	B-1265	植物凝集素 – 结合Sia-alpha2–3连接
鸡抗Neu5Gc IgY	BioLegend	146903	一抗检测
Cy3-链霉亲和素	Jackson Immunoresearch	016-160-0848	生物素结合
Cy3-抗人IgG	Jackson Immunoresearch	109-165-088	针对人IgG的二抗检测
Cy3-抗鸡IgY	Jackson Immunoresearch	703-165-155	针对鸡IgY的二抗检测
人血清样本	以色列血库		一抗检测
压缩氮气（5级）			通用除尘/干燥工具
环氧涂层载玻片	Corning	40044	载玻片
环氧涂层载玻片	PolyAn	2D 104-00-221	载玻片。此类载玻片表面更疏水（相较于Corning载玻片），因此糖链打印缓冲液需添加0.005% Tween-20，以获得100 µm大小的点样斑点。
384孔微孔板	Genetix	2070	打印用微孔板
VWR实验标记笔	VWR	52877-310	载玻片标记
染色管	ArrayIt	MST	载玻片显色工具
染色缸	VWR	25608-904	载玻片显色工具
载玻片玻璃支架	VWR	631-9321	载玻片显色工具
GenePix扫描仪	Molecular devices	4000B	载玻片扫描仪
LM-60 NanoPrinter	ArrayIt	LM-60	芯片打印机
点样针	ArrayIt	946MP3	打印用针
ProPlate模块	Grace Bio-Labs	P37004	载玻片显色模块
蒸馏水	Bio-Lab	2321020500	阵列仪和加湿器所需
电子多通道移液器，8通道，体积范围2-125 μL	Thermo-Fisher Scientific (Matrix)	MA-2131 Impact2 Equalizer 384	用于向384孔板中分配样品的多通道移液器