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方法文章

利用大鼠离体阻力动脉视频显微技术评估血管调控机制

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DOI：

10.3791/56133

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2017年12月5日

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1Department of Physical Therapy, Marquette University, 2Medical College of Wisconsin, 3Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 4Graduate Programs of Nurse Anesthesia, Texas Wesleyan University, 5Office of Research, Medical College of Wisconsin

本文内容

摘要

本文描述了 体外 用于评估大鼠脑小动脉血管功能的视频显微镜实验方案。本文还描述了利用荧光标记凝集素评估微血管密度以及采用激光多普勒血流仪检测组织灌注的技术。

摘要

本方案描述了以下方法的使用 体外 利用电视显微镜评估离体脑阻力动脉（及其他血管）的血管功能，并介绍采用激光多普勒血流仪（LDF）评估组织灌注以及利用荧光标记评估微血管密度的技术 香单叶豆 (GS1)凝集素。目前研究在跨壁压条件下分离出的阻力血管的方法 体内 且在无实质细胞影响的情况下，提供了介于 体内 来自分子还原论方法的研究及其所获得的信息，对于理解整体动物水平上的整合性反应具有局限性。激光多普勒血流仪（LDF）以及利用荧光标记的GS1凝集素选择性识别微动脉和毛细血管的技术，为研究者提供了切实可行的解决方案，使其能够将从离体阻力血管研究中获得的知识进一步拓展。本文描述了这些技术的应用，以获取关于大鼠这一通用实验模型以及多种特异性基因工程模型中血管生理学与病理学的基本知识 "设计者" 能够为特定基因对重要血管表型的影响提供深入见解的大鼠品系。利用通过选择性育种策略培育的大鼠品系，以及新近建立的在大鼠中构建基因敲除模型的技术，将拓展在基因敲除小鼠模型中所获得科学结论的严谨性，并将相关知识延伸至更具生理相关性的动物模型。由于大鼠体型较大，其生理背景明确，更适合开展各类生理学研究。

引言

早期对动脉血管功能的研究主要利用传导动脉，许多情况下使用主动脉。大动脉中的力量生成通常通过将动脉环形片段连接到组织浴槽中的力传感器上来进行研究；对于主动脉，则通过切割血管成螺旋条状，使平滑肌纤维在其附着点与力传感器之间呈纵向排列，以最准确地估算平滑肌沿其长轴收缩所产生的力量。切割主动脉螺旋条的标准技术是将一根玻璃棒插入血管腔内，在血管壁上以所需角度做一切口，并在延伸切口以形成完整的螺旋条时握住暴露的血管壁边缘。随后，通常用吸水纸轻拭血管的内皮面以去除碎屑，再将血管条连接至力传感器，并将整个装置浸入充氧且温度可控的组织浴槽中。这种方法最终促成了生理学历史上最著名且最重要的发现之一——Furchgott 和 Zawadski1发现内皮源性舒张因子（EDRF，后被确认为一氧化氮）在调控血管功能中的关键作用。这一发现的关键事件是研究人员在实验中避免动脉内皮面接触外来表面，从而保持内皮完整，此时他们注意到主动脉条段并未如预期般对乙酰胆碱（ACh）产生收缩反应，反而出现了舒张。基于这一观察，研究人员开发出一种"夹心"制备方法，即将一段内皮完整的主动脉（本身无法产生收缩力）与标准的主动脉螺旋条连接，从而使原本由ACh引发的收缩反应转变为舒张反应。

目前广泛应用的该领域两项主要进展是：用于测量小阻力动脉（如肠系膜动脉3）主动收缩力的制备方法2,3 ，以及灌流阻力动脉的制备技术4,5,6。在最早期的报告之一中，Mulvany 和 Halpern3 描述了使用丝状肌动描记装置（wire myograph）来研究自发性高血压大鼠（SHR）和正常血压 WKY 对照大鼠肠系膜分离阻力动脉的主动收缩力。在丝状肌动描记系统发展之后，又开发了灌流阻力动脉制备方法，以使血管研究更接近于in vivo状态4,5,6。  尽管这两种方法均能提供有价值的结果，但灌流动脉制备具有额外优势，包括更有效地维持动脉内在的主动张力；并允许研究者考察血管对跨壁压力变化产生的主动肌源性反应，以及对血流速率变化和内皮剪切应力变化的反应（参见 Halpern 和 Kelley 的综述6）。

本文的主要目标是介绍如何采用经典的视频显微技术，利用分离并插管的阻力动脉，精确获取关于这些关键血管中调节主动张力机制的信息，且排除神经、体液或实质细胞影响的干扰。本文以标准大鼠模型为基础，并结合我们对新型基因工程大鼠品系的研究实例，向读者展示通过电视显微技术可获得的有关血管功能的各类深入认识。这些方法可广泛应用于研究者自主选择的任何对照组和实验组研究中，包括通过选择性近交繁殖和新近开发的基因工程技术所建立的强有力的新实验大鼠模型。

得益于电视显微技术的高精度，对灌流动脉标本的直径变化进行测量，可提供有关内皮依赖性和非内皮依赖性血管舒张机制的极具价值的信息，同时还能揭示高血压、高盐饮食及其他实验干预条件下血管调控机制的重要（有时是意料之外的）改变。此外，通过测定经钙离子螯合剂处理后达到最大程度舒张的离体灌流阻力动脉的压力-直径关系，2+无药物溶液或药理性血管扩张剂，可使研究者评估因血管重塑引起的动脉结构变化，并计算被动应力-应变关系7 可为动脉被动力学特性的变化提供重要见解，这些变化可能独立于（或叠加于）主动调节机制的变化而影响动脉功能。还需注意的是，对离体阻力动脉研究所得的信息，可与利用激光多普勒血流仪（LDF）获得的信息相互补充，后者是一种在整体动物水平评估组织灌注的实用方法8,9,10，并通过使用荧光标记的GS1凝集素评估微血管密度获得信息，该凝集素特异性结合小动脉和毛细血管基膜中的糖蛋白部分11,12后一种方法能够对微血管密度进行高度准确的估算，且不受传统计数法估算微血管密度时常见困难的影响。 体内例如，可识别因小动脉主动闭合导致血流停止的无灌注血管。联合使用这些方法，有助于将离体阻力动脉的功能性改变与微循环水平的组织灌注变化相关联；本文还将提供这些有价值的方法与套管动脉技术结合应用的一些实例。

本文重点介绍利用视频显微技术评估远交系Sprague-Dawley大鼠动脉中的血管变化。然而需要指出的是，这些技术在揭示通过选择性育种或基因编辑技术培育的高度特化转基因大鼠品系的表型改变方面也已被证明具有极高价值。在本论文中，我们举例说明了视频显微技术如何在多种重要的大鼠模型中提供有关血管功能的重要信息，包括Dahl盐敏感型（SS）大鼠——这是一种近交系大鼠品系，是研究盐敏感性高血压机制应用最广泛的实验模型18,19,20,21,22,23；以及通过将SS大鼠与盐不敏感的Brown Norway（BN）大鼠品系进行选择性育种所构建的同源染色体置换系（consomic）大鼠。在这些同源染色体置换系大鼠中，每条来自Brown Norway大鼠的染色体被逐一导入Dahl SS24,25,26遗传背景中。利用同源染色体置换系大鼠已为识别参与血压盐敏感性及其他表型（包括血管反应性）的特定染色体提供了宝贵线索24,25,26,27,28。

利用SS大鼠和携带单个BN染色体的同源染色体大鼠进行的选择性育种策略，也已成功培育出近交系 congenic 大鼠，其Dahl SS遗传背景中仅导入了单个Brown Norway大鼠的较小染色体片段22,29这些研究可为影响关键生理变量（如血压、肾脏损伤和血管反应性）的特定基因或染色体的特定区域提供极为宝贵的线索。22,29大鼠遗传学工具箱的另一项重要进展是利用先进的基因编辑技术（包括ZFNs、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）以及最新的CRISPR-Cas9）开发出的大鼠基因敲除模型。13,14,15,16,17这些强大技术的出现使得大鼠基因敲除成为可能，这是一个极为重要的进展，因为迄今为止的基因敲除研究几乎全部依赖（并持续依赖）小鼠。本文的另一项实验部分展示了利用动脉插管技术和视频显微镜评估缺乏关键抗氧化及细胞保护性转录因子核因子（红系衍生2）样2（NRF2）的大鼠中生理调控机制的价值。30,31，这些品系是在Sprague-Dawley遗传背景下利用TALEN技术开发的17在这些实验中， 体外 采用视频显微技术对NRF2基因缺失的功能性效应进行验证，并评估一种基于直接上调NRF2介导的抗氧化防御机制的潜在有效治疗策略。鉴于维生素C和E等抗氧化剂在临床试验中效果不佳，NRF2在应对人类血管氧化应激方面具有重要的治疗意义。32.

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方案

本研究中所述的所有方案均经威斯康星医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，所有操作均符合美国国立卫生研究院（NIH）实验室动物福利办公室（OLAW）的法规要求。

1. 溶液与容器室的准备

  1. 在进行一系列实验之前，配制2 L 20倍浓缩盐储备液，其成分为：278 g/L NaCl；14 g/L KCl；11.52 g/L MgSO₄4 .7H2O；以及 9.4 g/L CaCl2 .2H2O. 同时配制2 L 20倍浓缩缓冲液母液，成分为80.8 g/L NaHCO₃3 和 0.4 g/L EDTA，以及 2 L 的 20 倍浓缩 Ca2+-无菌储备液，包含 281.6 g/L NaCl；14 g/L KCl 和 11.52 g/L MgSO₄4 .7H2O.
    注意：20倍浓缩液可保存在冰箱中，待使用时取出。
  2. 实验当天，按以下步骤从20倍浓缩储备液配制2 L生理盐溶液（PSS）：将100 mL 20倍盐储备液加入盛有1,800 mL去离子水的2 L锥形瓶或烧杯中，置于磁力搅拌器上搅拌。在持续通入含21% O₂的混合气体进行平衡的同时，加入100 mL 20倍缓冲液储备液。2，5% CO2，平衡 N2，并用磁力搅拌子搅拌。缓慢加入0.28 g NaH2PO4 在监测 pH 的同时，必要时用巴斯德吸管滴加 6 N HCl 或 6.5 N NaOH 溶液，调节 pH 至 7.4。PSS 配制完成并调节 pH 后，向 PSS 中加入 1.98 g 葡萄糖。
    注意：必须缓慢加入 NaH2PO4 在监测PSS的pH值时，最后加入NaH2PO4 至碱性溶液（pH >7.4）可能形成磷酸钙沉淀，表现为溶液浑浊或容器底部出现白色沉淀。
    注意：PSS 的最终组成为 119 mM/L NaCl；4.7 mM/L KCl；1.17 mM/L Mg2SO4；1.6 mM/L CaCl2；1.18 mM/L NaH2PO4；24 mM/L NaHCO₃3；0.03 mM/L EDTA；以及 5.5 mM/L 葡萄糖。尽管不同实验室的生理盐溶液（PSS）配方可能有所不同，但该配方非常适合维持离体阻力动脉的血管张力、内皮功能以及对血管活性物质的反应。
  3. 为确定动脉的最大直径并评估其活性张力，通过诱导血管最大程度扩张，配制 500 mL 的 Ca2+通过加入25 mL的20X Ca，制备无钙PSS2+将无盐母液加入450 mL去离子水中，随后加入25 mL 20倍缓冲液母液于锥形瓶或烧杯中，操作参照上述步骤1.2。加入0.07 g NaH2PO4 在监测并调节溶液 pH 值的同时，向溶液中加入 Ca2+实验结束时，向PSS储液器和血管腔内加入无钙PSS，以避免细胞内Ca²⁺耗竭2+ 可能影响正常PSS中血管反应的储存库。由于Ca2+在实验结束时加入无钙溶液以实现动脉最大程度的舒张，因此无需在PSS中添加葡萄糖。
    注意：当完成时，Ca 的最终组成2+无钙PSS含有120.6 mM/L NaCl；4.7 mM/L KCl；1.17 mM/L Mg2SO4；1.18 mM/L NaH2PO4；24 mM/L NaHCO₃3；0 mM/L CaCl2；以及 0.03 mM/L EDTA。
    注意：对于需要最大程度扩张动脉的许多研究，除去除 Ca²⁺ 外，还可向溶液中添加钙离子进入阻滞剂（如维拉帕米，1 µM）和/或一氧化氮供体（如硝普钠，10 µM）2+ 来自PSS。
  4. 维持 PO2，PCO2，以及通过将PSS持续通入标准器官浴槽中的容器室来平衡PSS的pH值，该器官浴槽用于研究离体主动脉环、肠平滑肌或其他组织（图1）。使用四氟乙烯合成氟聚合物管将气瓶连接至器官浴槽，因为此类管道具有不透气体的特性，而许多其他类型的管道则不具备这一特性。 例如，乳胶。
  5. 将连接至平衡气体混合物的小型曝气石放入容器室中，以帮助维持PSS气体组成。
    注意：血管对PO变化的反应2 可通过将血管腔室和管腔灌注液与含有不同氧气浓度的混合气体平衡来检测2, 例如，21% O₂2，10% O₂2，5% O₂2，以及 0% O₂2，含5% CO2 并平衡 N233,34,35对于管壁较厚的大动脉，由于氧气向血管壁中心扩散可能受限，因此需要更高浓度的氧气， 例如，95% O₂2 可以使用。
  6. 密切监测腔室内的温度，因为不同腔室的热传导特性可能存在差异。
    注意：许多用于灌注阻力动脉研究的市售血管腔室采用蠕动泵，将经气体平衡的储存器中的含氧PSS输送至浴槽，可精确控制PSS的温度和氧合状态。
  7. 将PSS置于一个大型（2 L）马里奥特瓶中，瓶口配有塞子和中央玻璃管，作为储液装置，持续向器官浴槽中输送PSS，以加热并进行气体平衡，使PSS流入血管腔室图1A).
  8. 将马里奥特瓶的中央玻璃管开口置于与器官浴槽内生理盐溶液（PSS）液面相同的高度，以维持向器官浴槽输送PSS时恒定的静水压力。使用聚乙烯管连接J形玻璃或塑料管，将PSS从马里奥特瓶导入器官浴槽。
  9. 用于管腔灌注（图1A），使用聚乙烯管将流入端移液管连接至一个由60 mL塑料注射器构成的生理盐溶液（PSS）储液装置，将该注射器抬升至适当高度，以维持所需的流入压力（大鼠脑动脉研究通常为80 mmHg），压力值通过连接至系统三通阀的压力传感器测定。
  10. 将流出移液管连接至聚乙烯管，使PSS能够响应压力梯度流经血管，并将流出管路连接至与流入端类似的储液罐。使用相同的三通阀和压力传感器连接装置测量流出端压力。
    注意：设定跨壁压力和控制血管内流速的步骤详见下文第2节。
  11. 实验结束后，用蒸馏水彻底冲洗腔室、输送管路和储液系统。应定期更换管路和输送管线，清洗或更换系统中的旋塞阀，并定期对玻璃PSS储液器进行酸洗，以防止细菌和其他微生物滋生，避免污染并影响血管反应性。

2. 带套管动脉的制备

  1. 用5%异氟烷麻醉Sprague-Dawley大鼠，并以1.5–2.5%医用级氧气维持麻醉36或者，根据实验方案和/或研究者偏好，可采用以下任一经批准的麻醉方法：肌肉注射氯胺酮（75.0 mg/kg）、乙酰丙嗪（2.5 mg/kg）和赛拉嗪（10.0 mg/kg）的混合制剂；腹腔注射戊巴比妥钠（50–60 mg/kg）；或其他经批准的麻醉方式。
  2. 在深度麻醉下将大鼠断头，取出脑组织用于脑阻力动脉的研究。
  3. 脑组织取出后，仔细分离大脑中动脉（MCA）（或其他感兴趣血管）， 例如基底动脉或大脑后动脉37,38. 为分离脑膜中动脉（MCAs），将脑组织腹侧朝上置于盛有冰冻生理盐溶液（PSS）的玻璃培养皿中图2).
  4. 使用Vannas剪刀和Dumont #5精细尖头镊子从脑组织中切除大脑中动脉（MCA）。  使用镊子清除大脑中动脉（MCA）上残留的脑组织，并将动脉转移至含有PSS的温度可控的血管浴槽中，操作方法同前。33,34 .
  5. 用ACA或后交通动脉段轻轻夹住已切除的血管，小心地将其转移至血管腔室中。
    注意：除了大脑中动脉（MCA）外，套管灌流血管系统还适用于多种小血管制备，包括骨骼肌阻力动脉33,39,40肠系膜阻力动脉38,41,42，以及提睾肌的大（一级）微动脉43以及从臀部活检获取的皮下脂肪组织中分离的人冠状动脉小动脉和人小动脉44,45,46,47.
  6. 将动脉朝向进液微移液管的管底拉动，直至微移液管尖端插入大脑中动脉（MCA）管腔内。使用先前从10-0缝线中分离出的单股纤维制备的结环，围绕动脉打结，以将动脉固定在进液微移液管上（图1B）。通过在血管上收紧第二个缝合线圈，将MCA的另一端固定在流出端移液管上（图1B).
    注意：在安装血管之前，先将缝合线环放置在微移液管上，并将其位置调整至接近最终固定点，以便在血管就位后能轻松地将线环滑过动脉并迅速固定，从而最大限度地降低动脉从移液管上滑脱的风险。
    注意：使用垂直显微拉针仪，将硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 2 mm；内径 1 mm；长 10 cm）制备成显微移液管。在连接动脉之前，应尽可能匹配显微移液管尖端的直径，以防止灌注系统中流入和流出阻力不匹配。
  7. 动脉牢固地绑在微移液管上后，使用连接到流入端移液管支架的千分尺将动脉拉伸至其 原位 长度
  8. 使用10-0缝线拆分出的单股线结扎所有侧支，以维持动脉内的恒定压力。
  9. 通过暂时关闭灌注管路的进液端，确认管腔内（跨壁）压力保持恒定，以验证系统无泄漏。若压力下降，应结扎任何分支或检查血管是否存在破孔。在确认跨壁压力稳定后，恢复灌注。
    注意：分离阻力血管的插管操作需要熟练的手法和练习。主要注意事项包括避免损坏移液管，并确保血管不会从移液管上滑脱。在整个操作过程中必须轻柔对待分离的血管，因为机械损伤可能损害血管内皮和/或干扰血管平滑肌的正常功能。
  10. 使用视频显微镜装置测量动脉的内径（图1A）包括一台连接至体视显微镜的摄像机，并与视频测微计和电视监视器相连（图1B，1C这使得观察者可以通过在动脉内壁放置可移动的参考线，并根据需要同时在动脉外壁放置参考线，从而手动测量血管直径以及血管壁厚度。
    注意：某些视频测微计可自动追踪血管尺寸。
    注意：每次实验之间，需使用显微镜载物台测微尺校准视频测微计，并使用汞柱压力计（0 mmHg、50 mmHg、100 mmHg、150 mmHg 和 200 mmHg）校准流入和流出压力传感器，以确保血管直径和管腔内压力的测量准确。
    注意：大鼠大脑中动脉（MCA）实验的标准对照跨壁压为80 mmHg。对更高和更低压力水平进行校准，可确保在研究跨壁压变化引起的肌源性反应以及完全舒张动脉中的被动压力-直径曲线时的数据准确性。
  11. 调节进流和出流储液罐的高度，以维持所需的跨壁压力在恒定水平。将进流储液罐略微升高（< 5 mmHg）并使流出储液器降低相同高度，可维持平均跨壁压并产生血管腔内的灌注血流6.
    注意：通过等量升高流入储液罐和降低流出储液罐，可维持动脉相同的平均跨壁扩张压，同时产生静水压梯度，从而在血管内形成流动和剪切应力，使研究者能够评估不同实验组中内皮依赖性反应对管腔内剪切应力变化的响应48.
  12. 为评估血管的肌源性反应以及对血管扩张刺激的反应，在实验前需确保动脉具有适当的主动张力（约40%）。除某些特定血管外，静息状态下缺乏主动张力的动脉应予以弃用。 例如，通常不表现出主动静息张力的小肠系膜动脉。
    注意：对于通常不表现出自发张力的血管，可使用血管收缩激动剂（如去甲肾上腺素或苯肾上腺素）将其预收缩至相当程度。选择用于预收缩动脉的激动剂剂量时，建议采用其EC50 血管收缩剂的剂量， 例如去甲肾上腺素41,42然而，不应将药理性血管收缩剂应用于在静息条件下已表现出自发性活性张力的动脉。
  13. 通过在灌注的阻力动脉中逐步增加乙酰胆碱（ACh）浓度并测量血管直径，检测内皮依赖性反应性-10 M–10-5 M）加入到血管腔室中。通过在逐步增加浓度（10-10 M–10-5 向血管腔室中加入硝酸钠硝普盐（硝酸盐供体，M）。
    注意：通过向血管腔中逐步增加加压剂或其他血管扩张激动剂的浓度，可采用类似方法检测血管对这些物质的敏感性。
    注意：除了血管活性物质外，还可将多种药物、抑制剂及其他药理学试剂加入组织浴液和/或管腔灌注液中。PO的变化2 （以及 PCO2 可通过将管腔灌流液与连接至校准气体混合物的通气石分别平衡，从而将特定的气体环境（如氧分压和pH）选择性地施加于动脉的内皮侧或血管外侧，该气体混合物不同于用于平衡组织浴槽中PSS的气体混合物。33,34,49通过关闭流出端移液管，并升高（或降低）与流入端移液管相连的生理盐溶液（PSS）储液罐的高度，可研究血管对跨壁压力变化的肌源性反应。49,50,51 以增加或降低管腔内压力。
  14. 为了检测内皮在介导血管对特定刺激反应中的作用，可去除血管内皮，并比较内皮存在与缺失情况下血管对这些刺激的反应。去除内皮时，先小心地将动脉从流出端移液管上解下，随后用气泡（0.5–1.0 mL）缓慢灌注动脉腔。气泡灌注后，在将血管重新结扎至流出端移液管之前，恢复PSS灌注以清除细胞碎片。43.
    注意：在完成内皮剥脱操作后，必须通过检测血管对已知可引起该类型血管内皮依赖性舒张的激动剂（通常为乙酰胆碱，ACh）的反应，来验证内皮是否已被去除。然而，在某些病理条件下，内皮依赖性血管收缩因子会被释放，此时尤为重要的是验证在去除内皮后，血管收缩反应是否消失。
  15. 实验结束时，通过添加 Ca 确定动脉的最大直径2+-将无钙PSS加入灌流液和上灌液中。以((D最大- D休息)/D最大值) × 100，其中 D最大值 是在有 Ca 存在时的最大直径2+无溶液和D休息 为静息状态下的对照管径。
    注意：在不同实验组中测量最大程度松弛动脉的直径，对于比较主动静息张力、结构性重塑具有重要价值即，管壁厚度和管腔直径的变化），以及被动力学特性（根据不同跨壁压下的被动直径计算得到的应力-应变关系）。

3. 使用激光多普勒血流仪评估脑血流反应

  1. 使用 5% 异氟烷麻醉动物，并将大鼠固定在立体定位仪上9,10。
  2. 在持续麻醉状态下维持动物，同时监测呼吸频率、呼气末 CO2 浓度，并通过夹趾反应评估麻醉深度36。
  3. 使用低速牙科钻头和矿物油小心地将颅骨磨薄至半透明，以实现光学耦合10。操作时需格外谨慎，避免产生过多热量或穿透骨层。
    注意：颅骨磨薄可使激光穿透并到达下方组织，反射回探头以测量多普勒频移，其幅度取决于运动颗粒（即红细胞）的数量及其流速。
  4. 将激光多普勒血流仪（LDF）探头固定于显微操作器上，并将其准确定位于颅骨磨薄区域正上方。实验过程中，必须严格防止 LDF 探头或标本本身的任何移动，因为 LDF 的设计目的是测量组织中某一限定区域的血流，对运动伪影极为敏感。
    注意：探头一旦偏离初始位置，将导致对组织不同区域血流的测量，从而无法进行有效比较。尽管 LDF 不能提供绝对血流量数值，也不适用于个体间的直接比较，但它是一种无创评估个体受试者在实验干预下组织灌注变化的优良方法；不同实验组中 LDF 信号相对于对照值的相对变化可进行平均并相互比较。
    注意：LDF 是一种便捷的方法，可用于深入了解不同实验组中整个血管床水平血流调节因素8,9,10。利用 LDF 评估组织灌注，可将离体血管研究获得的知识整合到整体血管床的视角中。只要阻力动脉与微循环之间的血管调控机制无显著区域差异，LDF 所获得的测量结果即可良好反映组织血流调控情况，通常与灌注动脉实验所得结果具有一致性。

4. 使用GS1凝集素评估骨骼肌微血管密度

  1. 使用标准的精细手术剪切开雄性大鼠的阴囊，然后用Dumont #5镊子夹住提睾肌，将其取出。
    注意：薄肌组织（例如，提睾肌，以及雄性和雌性大鼠均存在的趾长伸肌和胫前肌）非常适合作为凝集素研究的完整组织铺片，尽管较厚的组织也可采用组织学切片进行分析。
  2. 通过一次切割将提睾肌从睾丸上分离下来，将其置于冰冻的PSS溶液中，并放置于底部内表面衬有硅橡胶弹性体的培养皿中固定。使用Dumont #5镊子轻轻剥离结缔组织。
  3. 用2 mL缓冲PSS溶液冲洗肌肉样本，然后将其浸入含罗丹明标记的GS1凝集素（20 µg/mL PSS）的12孔细胞培养板中，每孔加入2 mL溶液，并用铝箔包裹培养板以避光，孵育50分钟。
  4. 将组织从凝集素溶液中取出，用PSS溶液漂洗三次，每次5分钟"振荡洗涤"，置于摇床上进行孵育，随后将组织铺于显微镜载玻片上。务必在避光条件下孵育组织，并将载玻片保存在暗处，以防荧光淬灭。
    注意：若载玻片不能立即使用，可将其置于冰箱中保存，荧光不会明显减弱。如需长期保存，可将载玻片存于冷冻环境中以防止降解11。
  5. 通过计数标记的微血管与叠加在图像上的计算机生成网格线的交点数量来评估微血管密度52，也可使用透明网格覆盖在观察载玻片所用的显示器上来进行评估。
    注意：GS1凝集素方法已被用于证明以下现象：盐诱导的微血管稀疏化53；防止高盐饮食导致的血管紧张素II抑制对恢复动物微血管密度的保护作用17,53,54；NRF2介导低剂量血管紧张素II输注在高盐饮食大鼠中防止微血管稀疏化的保护作用17；以及评估血管紧张素II在高盐饮食大鼠中维持慢性肌肉刺激诱导的血管生成反应中的作用54,55。GS1凝集素技术的一个优势在于，它可用于在同一动物中评估微血管密度，这些动物同时也可用于阻力动脉插管或激光多普勒血流测定（LDF）研究。

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结果

体外 灌注式阻力血管的显微镜观察可用于研究在正常条件下影响小阻力血管（及较大微动脉）活性张力的因素 体内 跨壁压以及在无实质细胞影响条件下的血管反应性。除了评估血管在正常PSS中对各种血管舒张剂和收缩剂刺激以及跨壁压升高时的肌源性反应外，Ca2+在实验结束时，可将无钙PSS加入灌注液和 superfusate 中，以测定血管的最大直径和壁厚。后者对于评估血管重塑具有重要价值。 即，血管壁/管腔比率可能发生的变化，这些变化可能是对血压改变或药物干预的响应。在Ca2+-自由PSS可用于计算固有张力，公式为((D最大- D休息)/D最大) × 100，其中 D最大 和 D休息 最大（Ca2+-无钙PSS）和静息直径（PSS），分别在对照平衡压力下（通常为MCA的80 mmHg）测定。根据我们的经验，在跨壁压力为80 mmHg时，MCA的主动张力平均约为...

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讨论

如引言所述，本文介绍了利用电视显微镜和离体阻力血管技术来评估血管功能，不仅适用于标准的大鼠模型（如视频中所采用的），也适用于高度特化的基因工程大鼠品系，从而展示这些方法所能提供的新颖而强大的研究视角。利用这些强大技术评估小阻力血管的主动张力和被动力学特性，可为广泛的血管调控机制提供重要信息，包括阻力血管中内皮依赖性的主动张力调节、血管平滑肌在正常及病理生理条件下的功能，以及与血管重塑和血管壁力学变化相关的动脉被动特性。已有研究表明，内皮功能障碍是人类多种不良心血管事件（包括心血管相关死亡63）的强有力预后指标，而灌流阻力血管制备技术在检测内皮功能障碍、加深对其机制理解方面尤为宝贵。

为了说明其有效性 体外 采用离体阻力动脉的视频显微技术，我们展示了这些技术在Dahl盐敏感型（SS）大鼠以及新型同源染色体置换大鼠品系中的应用实例，后者相较于SS亲本品系表现出较低的血压盐敏感性24这些研究探讨了与两个染色体上基因相关的血管调控机制，这两个染色体在导致SS大鼠血压的盐敏感性及...

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披露

作者无竞争性财务利益。

致谢

作者对Katie Fink和Lynn Dondlinger在本文稿准备过程中提供的宝贵帮助表示诚挚感谢。

基金支持：NIH #R21-OD018309；#R56-HL065289；和 #R01-HL128242。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SS 大鼠威斯康星医学院SS/JHsd/Mcwi 品系联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu)
SS.5BN 同源染色体置换大鼠威斯康星医学院SS-Chr 5BN/Mcwi 品系联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu)
SS.13BN 同源染色体置换大鼠威斯康星医学院SS-Chr 13BN/Mcwi 品系联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu)
Ren1-BN 近交系大鼠威斯康星医学院SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi 品系联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSA 近交系大鼠威斯康星医学院SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi 品系联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSB 近交系大鼠威斯康星医学院SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi 品系联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu)
Nrf2(-/-) 基因敲除大鼠及其野生型同窝仔鼠威斯康星医学院SD-Nfe212em1Mcwi 品系联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu)
低盐大鼠饲料 (0.4% NaCl)-AIN-76ADyets, Inc.113755
高盐大鼠饲料 (4% NaCl)-AIN-76ADyets, Inc.113756
科罗拉多视频测径仪Colorado Video, Inc.型号 308
视频摄像机日立KPM1AN
显微镜奥林巴斯生命科学CKX41
电视监视器松下WVBM1410
压力传感器Stoelting56360
血压显示单元Stoelting50115
插管动脉腔室Living Systems InstrumentationCH-1通用单血管腔室
单腔室温度控制器Living Systems InstrumentationTC-09S
微型直型气体分散管Living Systems InstrumentationGD-MS为血管浴提供通气
微型气体交换氧合器Living Systems InstrumentationOX允许灌注液进行气体交换
激光多普勒血流仪PerimedPeriFlux 5000 LDPM
GS1 凝集素Vector LabsRL-1102
微移液管用玻璃毛细管Fredrich Haer Co.27-33-1外径 2 mm，内径 1 mm
垂直移液管拉制仪David Kopf Instruments型号 700C
尼龙缝合线材料 (10/0)-3 股Ashaway Line and Twine Manufacturing Co.114-ANM-10将 3 股尼龙缝合线拆分为单股用于血管操作
Dumont #5 镊子-不锈钢精细科学工具公司11254-20
Vannas 剪刀精细科学工具公司15003-08
ProtandimProtandimNRF2 诱导剂：联系 Joe McCord 博士 (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)
氯化钠Fisher BioreagentsBP358-212
碳酸氢钠Fisher ChemicalS233-3
无水右旋糖（D-葡萄糖）Fisher ChemicalD16-500
硫酸镁 (MgSO4-7H2O)Sigma AldrichM1880-500 G
氯化钙 (CaCl2-2 H2O)SigmaC5080-500G
磷酸二氢钠 (NaH2PO4)SigmaS0751-500G
氯化钾 (KCl)Fisher ChemicalP217-500G
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 (EDTA)SigmaED255-500G

参考文献

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