本文描述了 体外 用于评估大鼠脑小动脉血管功能的视频显微镜实验方案。本文还描述了利用荧光标记凝集素评估微血管密度以及采用激光多普勒血流仪检测组织灌注的技术。
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本文内容
摘要
摘要
本方案描述了以下方法的使用 体外 利用电视显微镜评估离体脑阻力动脉（及其他血管）的血管功能，并介绍采用激光多普勒血流仪（LDF）评估组织灌注以及利用荧光标记评估微血管密度的技术 香单叶豆 (GS1)凝集素。目前研究在跨壁压条件下分离出的阻力血管的方法 体内 且在无实质细胞影响的情况下，提供了介于 体内 来自分子还原论方法的研究及其所获得的信息，对于理解整体动物水平上的整合性反应具有局限性。激光多普勒血流仪（LDF）以及利用荧光标记的GS1凝集素选择性识别微动脉和毛细血管的技术，为研究者提供了切实可行的解决方案，使其能够将从离体阻力血管研究中获得的知识进一步拓展。本文描述了这些技术的应用，以获取关于大鼠这一通用实验模型以及多种特异性基因工程模型中血管生理学与病理学的基本知识 "设计者" 能够为特定基因对重要血管表型的影响提供深入见解的大鼠品系。利用通过选择性育种策略培育的大鼠品系，以及新近建立的在大鼠中构建基因敲除模型的技术，将拓展在基因敲除小鼠模型中所获得科学结论的严谨性，并将相关知识延伸至更具生理相关性的动物模型。由于大鼠体型较大，其生理背景明确，更适合开展各类生理学研究。
引言
早期对动脉血管功能的研究主要利用传导动脉，许多情况下使用主动脉。大动脉中的力量生成通常通过将动脉环形片段连接到组织浴槽中的力传感器上来进行研究；对于主动脉，则通过切割血管成螺旋条状，使平滑肌纤维在其附着点与力传感器之间呈纵向排列，以最准确地估算平滑肌沿其长轴收缩所产生的力量。切割主动脉螺旋条的标准技术是将一根玻璃棒插入血管腔内，在血管壁上以所需角度做一切口，并在延伸切口以形成完整的螺旋条时握住暴露的血管壁边缘。随后，通常用吸水纸轻拭血管的内皮面以去除碎屑，再将血管条连接至力传感器，并将整个装置浸入充氧且温度可控的组织浴槽中。这种方法最终促成了生理学历史上最著名且最重要的发现之一——Furchgott 和 Zawadski1发现内皮源性舒张因子（EDRF，后被确认为一氧化氮）在调控血管功能中的关键作用。这一发现的关键事件是研究人员在实验中避免动脉内皮面接触外来表面，从而保持内皮完整，此时他们注意到主动脉条段并未如预期般对乙酰胆碱（ACh）产生收缩反应，反而出现了舒张。基于这一观察，研究人员开发出一种"夹心"制备方法，即将一段内皮完整的主动脉（本身无法产生收缩力）与标准的主动脉螺旋条连接，从而使原本由ACh引发的收缩反应转变为舒张反应。
目前广泛应用的该领域两项主要进展是：用于测量小阻力动脉（如肠系膜动脉3）主动收缩力的制备方法2
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方案
本研究中所述的所有方案均经威斯康星医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，所有操作均符合美国国立卫生研究院（NIH）实验室动物福利办公室（OLAW）的法规要求。
1. 溶液与容器室的准备
- 在进行一系列实验之前，配制2 L 20倍浓缩盐储备液，其成分为：278 g/L NaCl；14 g/L KCl；11.52 g/L MgSO₄4 .7H2O；以及 9.4 g/L CaCl2 .2H2O. 同时配制2 L 20倍浓缩缓冲液母液，成分为80.8 g/L NaHCO₃3 和 0.4 g/L EDTA，以及 2 L 的 20 倍浓缩 Ca2+-无菌储备液，包含 281.6 g/L NaCl；14 g/L KCl 和 11.52 g/L MgSO₄4 .7H2O.
注意：20倍浓缩液可保存在冰箱中，待使用时取出。 - 实验当天，按以下步骤从20倍浓缩储备液配制2 L生理盐溶液（PSS）：将100 mL 20倍盐储备液加入盛有1,800 mL去离子水的2 L锥形瓶或烧杯中，置于磁力搅拌器上搅拌。在持续通入含21% O₂的混合气体进行平衡的同时，加入100 mL 20倍缓冲液储备液。
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结果
体外 灌注式阻力血管的显微镜观察可用于研究在正常条件下影响小阻力血管（及较大微动脉）活性张力的因素 体内 跨壁压以及在无实质细胞影响条件下的血管反应性。除了评估血管在正常PSS中对各种血管舒张剂和收缩剂刺激以及跨壁压升高时的肌源性反应外，Ca2+在实验结束时，可将无钙PSS加入灌注液和 superfusate 中，以测定血管的最大直径和壁厚。后者对于评估血管重塑具有重要价值。 即，血管壁/管腔比率可能发生的变化，这些变化可能是对血压改变或药物干预的响应。在Ca2+-自由PSS可用于计算固有张力，公式为((D最大- D休息)/D最大) × 100，其中 D最大 和 D休息 最大（Ca2+-无钙PSS）和静息直径（PSS），分别在对照平衡压力下（通常为MCA的80 mmHg）测定。根据我们的经验，在跨壁压力为80 mmHg时，MCA的主动张力平均约为.......
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讨论
如引言所述，本文介绍了利用电视显微镜和离体阻力血管技术来评估血管功能，不仅适用于标准的大鼠模型（如视频中所采用的），也适用于高度特化的基因工程大鼠品系，从而展示这些方法所能提供的新颖而强大的研究视角。利用这些强大技术评估小阻力血管的主动张力和被动力学特性，可为广泛的血管调控机制提供重要信息，包括阻力血管中内皮依赖性的主动张力调节、血管平滑肌在正常及病理生理条件下的功能，以及与血管重塑和血管壁力学变化相关的动脉被动特性。已有研究表明，内皮功能障碍是人类多种不良心血管事件（包括心血管相关死亡63）的强有力预后指标，而灌流阻力血管制备技术在检测内皮功能障碍、加深对其机制理解方面尤为宝贵。
为了说明其有效性 体外 采用离体阻力动脉的视频显微技术，我们展示了这些技术在Dahl盐敏感型（SS）大鼠以及新型同源染色体置换大鼠品系中的应用实例，后者相较于SS亲本品系表现出较低的血压盐敏感性24这些研究探讨了与两个染色体上基因相关的血管调控机制，这两个染色体在导致SS大鼠血压的盐敏感性及.......
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披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
作者对Katie Fink和Lynn Dondlinger在本文稿准备过程中提供的宝贵帮助表示诚挚感谢。
基金支持：NIH #R21-OD018309；#R56-HL065289；和 #R01-HL128242。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SS 大鼠 | 威斯康星医学院 | SS/JHsd/Mcwi 品系 | 联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu) |
| SS.5BN 同源染色体置换大鼠 | 威斯康星医学院 | SS-Chr 5BN/Mcwi 品系 | 联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu) |
| SS.13BN 同源染色体置换大鼠 | 威斯康星医学院 | SS-Chr 13BN/Mcwi 品系 | 联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-BN 近交系大鼠 | 威斯康星医学院 | SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi 品系 | 联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-SSA 近交系大鼠 | 威斯康星医学院 | SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi 品系 | 联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-SSB 近交系大鼠 | 威斯康星医学院 | SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi 品系 | 联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu) |
| Nrf2(-/-) 基因敲除大鼠及其野生型同窝仔鼠 | 威斯康星医学院 | SD-Nfe212em1Mcwi 品系 | 联系 Aron Geurts 博士 (ageurts@mcw.edu) |
| 低盐大鼠饲料 (0.4% NaCl)-AIN-76A | Dyets, Inc. | 113755 | |
| 高盐大鼠饲料 (4% NaCl)-AIN-76A | Dyets, Inc. | 113756 | |
| 科罗拉多视频测径仪 | Colorado Video, Inc. | 型号 308 | |
| 视频摄像机 | 日立 | KPM1AN | |
| 显微镜 | 奥林巴斯生命科学 | CKX41 | |
| 电视监视器 | 松下 | WVBM1410 | |
| 压力传感器 | Stoelting | 56360 | |
| 血压显示单元 | Stoelting | 50115 | |
| 插管动脉腔室 | Living Systems Instrumentation | CH-1 | 通用单血管腔室 |
| 单腔室温度控制器 | Living Systems Instrumentation | TC-09S | |
| 微型直型气体分散管 | Living Systems Instrumentation | GD-MS | 为血管浴提供通气 |
| 微型气体交换氧合器 | Living Systems Instrumentation | OX | 允许灌注液进行气体交换 |
| 激光多普勒血流仪 | Perimed | PeriFlux 5000 LDPM | |
| GS1 凝集素 | Vector Labs | RL-1102 | |
| 微移液管用玻璃毛细管 | Fredrich Haer Co. | 27-33-1 | 外径 2 mm，内径 1 mm |
| 垂直移液管拉制仪 | David Kopf Instruments | 型号 700C | |
| 尼龙缝合线材料 (10/0)-3 股 | Ashaway Line and Twine Manufacturing Co. | 114-ANM-10 | 将 3 股尼龙缝合线拆分为单股用于血管操作 |
| Dumont #5 镊子-不锈钢 | 精细科学工具公司 | 11254-20 | |
| Vannas 剪刀 | 精细科学工具公司 | 15003-08 | |
| Protandim | Protandim | NRF2 诱导剂：联系 Joe McCord 博士 (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU) | |
| 氯化钠 | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| 碳酸氢钠 | Fisher Chemical | S233-3 | |
| 无水右旋糖（D-葡萄糖） | Fisher Chemical | D16-500 | |
| 硫酸镁 (MgSO4-7H2O) | Sigma Aldrich | M1880-500 G | |
| 氯化钙 (CaCl2-2 H2O) | Sigma | C5080-500G | |
| 磷酸二氢钠 (NaH2PO4) | Sigma | S0751-500G | |
| 氯化钾 (KCl) | Fisher Chemical | P217-500G | |
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 (EDTA) | Sigma | ED255-500G |
参考文献
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
- Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension ....
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