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方法文章

小鼠胆碱缺乏、乙硫氨酸补充（CDE）饮食慢性肝损伤模型

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DOI：

10.3791/56138

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2017年10月21日

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1School of Biomedical Sciences & Curtin Health Innovation Research Institute, Curtin University, 2School of Public Health & Curtin Health Innovation Research Institute, Curtin University, 3Institute of Biochemistry, Christian-Albrechts-University, 4School of Veterinary and Life Sciences, Murdoch University, 5Centenary Institute of Cancer Medicine and Cell Biology, The University of Sydney, 6Royal Prince Alfred Hospital, 7A.W. Morrow Gastroenterology and Liver Centre, 8QIMR Berghofer Medical Research Institute, 9Faculty of Medicine and Biomedical Sciences, The University of Queensland, 10Fiona Stanley and Fremantle Hospitals, 11School of Medical and Health Sciences, Edith Cowan University, 12School of Medicine and Pharmacology, University of Western Australia

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过喂食胆碱缺乏且添加乙硫氨酸（CDE）的饮食来诱导小鼠慢性肝损伤的常用方法。我们展示了健康监测、肝脏灌注、分离与保存的操作过程。为期六周的时间进程可用于评估肝损伤、病理组织学、纤维化、炎症反应以及肝前体细胞的应答情况。

摘要

慢性肝病（如病毒性肝炎、酒精性肝病或非酒精性脂肪性肝病）的特征是持续性炎症、肝实质进行性破坏与再生、肝前体细胞增殖以及纤维化。所有慢性肝病的终末阶段均为肝硬化，而肝硬化是发生肝细胞癌的主要危险因素。为了研究疾病起始、建立及进展过程中的调控机制，实验室中常采用多种动物模型。本文描述了一种胆碱缺乏并补充乙硫氨酸（CDE）的小鼠模型，为期六周的实验流程：对六周龄雄性C57BL/6J小鼠喂饲胆碱缺乏饲料，并提供含0.15% DL-乙硫氨酸的饮用水。文中说明了动物健康状况的监测方法以及典型体重下降曲线的记录。该方案展示了CDE处理后肝脏的大体检查，以及通过心脏穿刺采集血液以进行后续血清学分析的操作。接着，展示了肝脏灌注技术及不同肝叶的采集方法，用于常规评估，包括苏木精-伊红染色或天狼星红染色进行肝组织病理学分析、肝细胞群体的免疫荧光检测，以及肝脏微环境的转录组分析。该小鼠模型适用于研究由慢性肝病诱导的炎症反应、纤维化形成及肝前体细胞动态变化，也可用于评估可能调节这些过程的潜在治疗药物。

引言

肝脏是人体最大的腺体代谢器官，具有多种复杂功能。肝脏的主要作用包括消化、代谢、解毒、储存必需营养素、合成血液血浆蛋白成分，以及通过定居的巨噬细胞（即库普弗细胞）介导的免疫功能。即使肝脏总质量损失达70-90%，其仍具有强大的再生能力。在急性肝损伤情况下（如部分肝切除术后或对乙酰氨基酚中毒），残存的健康肝细胞会以高度协调的方式增殖，以修复受损组织1。然而，当肝细胞因长期病毒感染、酒精性或非酒精性脂肪性肝病而遭受慢性损伤时，炎症微环境会激活促纤维化的肝星状细胞，并促使肝前体细胞（LPCs）增殖；这些前体细胞具有向胆管上皮细胞或肝细胞分化的潜能2,3,4,5。LPCs的确切来源、分化命运、其在肝脏再生中的贡献以及在肝癌发生中的作用一直是激烈争论的课题，且很可能取决于损伤的严重程度和具体病理背景2。与早期再生相关的事件顺序也存在争议：一些研究者认为，肝星状细胞的活化及细胞外基质重塑对于形成有利于LPCs存活的微环境至关重要6，而另一些研究则报道，LPCs的扩增以及所谓的导管样反应（Ductular Reaction）是触发纤维化发生的必要条件7。目前已有多种动物模型用于研究肝损伤与再生的特定方面，旨在全面理解调控疾病进展的各种潜在因素，最终为患者开发新的治疗策略8。

胆碱缺乏且添加乙硫氨酸（CDE）饮食模型最初为大鼠设计，后经改良用于小鼠慢性肝损伤的诱导9,10胆碱饮食缺乏会导致极低密度脂蛋白的组装和分泌受损。结合肝致癌物DL-乙硫氨酸，该处理可引起肝脏脂肪过度蓄积、持续性炎症、门周纤维化、肝前体细胞（LPC）反应以及长期 肝细胞癌的发生11,12然而，重要的是，不同小鼠品系在炎症、纤维化以及肝前体细胞（LPC）反应动态方面表现出独特而不同的模式13本方案描述了在最常用的近交系小鼠C57BL/6J中诱导慢性肝损伤的方法。

在慢性肝病研究中，常规分析包括通过苏木精-伊红染色以及天狼星红染色进行组织学评估以观察胶原沉积，免疫组织化学或免疫荧光检测肝细胞群体，以及对肝脏微环境的转录组学分析，后者通过复杂的生长因子和细胞因子网络协调诱导的细胞变化14,15,16,17,18。

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方案

1. 动物实验

本研究中描述的所有动物实验均在实验开始前获得科廷大学动物伦理委员会批准（批准编号：AEC_2014_28），并依照澳大利亚动物护理与使用规范进行。

  1. 动物
    1. 使用6周龄雄性C57BL/6J小鼠进行实验。
  2. 实验设计
    1. 动物抵达动物房后，需在开始任何实验前让小鼠适应环境四天。
    2. 使用去除可见谷粒和秸秆的小麦麸皮作为垫料饲养家鼠，并将小鼠饲养在独立通气笼具中，维持12小时昼夜循环。在第3天和第7天更换垫料，之后每周更换一次。
    3. 为小鼠提供 随意摄取 可获取缺乏胆碱的饮食，并饮用添加了0.15% DL-乙硫氨酸的水。将添加DL-乙硫氨酸的饮水保存于4°C，每两天更换一次，以确保新鲜并促进饮用。每两天补充一次缺乏胆碱的饲料，每周进行一次饲料的完全更换。
    4. 观察小鼠在静息状态及抓取时的行为。监测动物健康的常规指标，包括整体外观、姿势、社会互动、理毛行为、被毛状况和体重。
    5. 在实验的前两周内，每天称量小鼠体重，以确保对体重减轻超过20%的动物实施安乐死，从而避免不必要的痛苦。这种情况通常发生在不到5%的动物中。两周后，称重频率可降低至每周三次。例如星期一、星期三、星期五
  3. 肝脏灌注与分离
    1. 在指定时间点（本研究中为CDE饮食喂养1周、2周和6周时）通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。检测后肢回缩反射以确认麻醉效果充分。
    2. 用70%乙醇润湿毛发，使用梅奥剪刀沿腹壁正中线垂直切开至横膈膜。可移除肋骨以更方便地接触心脏。
    3. 使用25 G × 1/2针头通过缓慢心脏穿刺采集血液" 使用普通壁针以避免心脏塌陷。将血液置于室温下静置凝固，随后在2,000 × g离心10分钟，获取血清样本。之后，采用标准方法测定血清丙氨酸转氨酶水平。12.
    4. 将胃和小肠移至一侧，暴露门静脉。使用梅奥剪刀剪开心脏以使液体流出，并通过27 G × 1/2 针头插入门静脉，用无菌磷酸盐缓冲盐水（pH = 7.4）灌注肝脏。" 普通壁针。肝脏均匀变苍白表明所有肝叶均灌注成功。
    5. 使用镊子和梅奥剪刀小心分离肝脏，并将其置于培养皿中。去除多余的非肝组织和胆囊。
  4. 肝脏保存
    1. 在记录肝脏总重量后，取一个较小的肝叶切成数块数平方毫米大小的小片，转移至无菌管中，并在液氮中速冻，以备后续按照标准方案进行RNA和蛋白质提取。器官取出后应尽快对这些组织样本进行速冻，以避免任何组织降解。
    2. 按标准操作规程，取一叶组织置于10%中性缓冲甲醛溶液中固定，以备后续处理及石蜡包埋。
    3. 将一个叶瓣放入已填充最佳切割温度冷冻包埋剂的模具中 并在液氮中快速冷冻。

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结果

在CDE诱导的慢性肝损伤六周时间过程中，分别于第7天（诱导期）、第14天和第21天（建立期）以及第42天（维持期）评估各项参数。与对照组小鼠相比，CDE处理的小鼠在初始适应阶段体重最多下降了初始体重的20%，随后在建立期和维持期趋于恢复体重(图1)。体重变化与血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平呈负相关，后者是肝细胞损伤的指标(图2)。将4 µm厚、经甲醛固定和石蜡包埋的肝组织切片进行苏木精-伊红染色，以评估肝脏结构。健康肝脏显示正常的组织结构，肝细胞呈有序的条索状排列，从中央静脉向外辐射，构成肝实质。相比之下，CDE处理的肝脏在诱导期和建立期表现出明显的肝脏结构破坏以及大量嗜碱性细胞浸润肝实质，而在维持期结构趋于正常化(图3)。为评估纤维化形成，对4 µm厚、经甲醛固定和石蜡包埋的肝组织切片使用...

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讨论

慢性肝病通常是一种隐匿性疾病，大多数患者无明显症状，是全球范围内导致发病和死亡的主要原因之一。慢性酒精中毒和丙型肝炎病毒感染是其主要病因。慢性肝损伤的特征是肝脏炎症、纤维化，严重情况下可发展为肝硬化、肝癌，最终导致肝功能衰竭。目前尚无有效的治愈手段，尽管在肝病发病机制研究方面已取得重大进展，但仍迫切需要开发新的治疗途径。

CDE饮食是一种简单、省时且易于实施的模型，可用于诱导和研究脂肪变性或肝脂肪变性、炎症、纤维化、肝前体细胞（LPC）增殖，以及在长期实验中诱导肝细胞癌的发生6,11,12,13,16,17。该模型最初用于大鼠19,<...

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披露

作者无任何需要披露的内容。

致谢

本研究得到了澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）的资助（项目编号：APP1042370、APP1061332、APP1087125）。作者感谢科廷健康创新研究所工作人员提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6周龄雄性C57BL/6J小鼠 西澳大利亚动物资源中心，默多克，西澳大利亚州，  澳大利亚N/A
10公斤蒸汽切割小麦粗粉 Specialty Feeds，格伦福雷斯特，西澳大利亚州，澳大利亚 N/A
用于灌溉的1000毫升水瓶（Baxter） 外科之家，珀斯，西澳大利亚州，澳大利亚 AHF7114A
胆碱缺乏饮食，改良型（颗粒） MP Biomedicals Australasia Pty Limited，西澳大利亚州，澳大利亚，02960210
DL-乙硫氨酸 Sigma-Aldrich，城堡山，新南威尔士州，  澳大利亚 E5139-25G
Ketamil注射液 Troy Laboratories Pty Limited，格伦丁宁，新南威尔士州，澳大利亚 N/A
Ilum Xylazil-20注射液 Troy Laboratories Pty Limited，格伦丁宁，新南威尔士州，澳大利亚 N/A
27G x 1/2"，普通壁针头 Terumo Australia Pty Limited，新南威尔士州，澳大利亚 NN-2713R
Terumo 1毫升和10毫升注射器 Terumo Australia Pty Limited，麦考瑞公园，新南威尔士州，澳大利亚 1018242, 1018037
Tissue-Tek OCT包埋剂 VWR International Pty Limited，廷加尔帕，昆士兰州，澳大利亚 25608-930
中性缓冲福尔马林 Amber Scientific，米德韦尔，西澳大利亚州，澳大利亚 NBF-2.5L
无水乙醇 anaLaR normalpur VWR International Pty Limited，廷加尔帕，昆士兰州，澳大利亚 20821.33
Superfrost Plus载玻片 Grale Scientific Pty Limited，林伍德，维多利亚州，澳大利亚 SF41296SP
Dako蛋白封闭剂，无血清 Dako Australia Pty Limited，北悉尼，新南威尔士州，澳大利亚  X090930-2
Dako抗体稀释液 Dako Australia Pty Limited，北悉尼，新南威尔士州，澳大利亚  s0809
大鼠抗CD45抗体 eBioscience，加利福尼亚州圣地亚哥，美国 m0701 1/200稀释
兔抗panCK抗体 Dako Australia Pty Limited，北悉尼，新南威尔士州，澳大利亚  Z06221/300稀释
山羊抗兔IgG（Alexa Fluor 488）Life Technologies Australia Pty Limited，马尔格雷夫，维多利亚州，澳大利亚A-110081/500稀释
山羊抗大鼠IgG（Alexa Fluor 594） Life Technologies Australia Pty Limited，马尔格雷夫，维多利亚州，澳大利亚 A-110071/500稀释
含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂 Life Technologies Australia Pty Limited，马尔格雷夫，维多利亚州，澳大利亚 P36935  
苦味酸-天狼星红染色试剂盒Polysciences Inc.，沃灵顿，宾夕法尼亚州，美国 ab150681 

参考文献

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