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方法文章

荷瘤小鼠中纳米颗粒递送药物组合后阿霉素与丝裂霉素C的样品提取及同步色谱定量分析

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DOI：

10.3791/56159

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2017年10月5日

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1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Toronto, 2Departments of Medical Biophysics and Radiation Oncology, University of Toronto, Ontario Cancer Institute, University Health Network

本文内容

摘要

本方案描述了一种高效且便捷的分析流程，用于从经纳米颗粒制剂协同药物组合治疗的临床前乳腺肿瘤模型的生物样本中提取样品，并同时测定多种药物，包括阿霉素（DOX）、丝裂霉素C（MMC）以及一种具有心脏毒性的阿霉素代谢物——阿霉素醇（DOXol）。

摘要

联合化疗在临床上常用于癌症治疗；然而，其对正常组织的不良反应可能限制其治疗效果。基于纳米颗粒的药物联合已被证明可缓解游离药物联合治疗所面临的问题。我们先前的研究表明，两种抗癌药物阿霉素（DOX）和丝裂霉素C（MMC）联用对小鼠和人乳腺癌细胞在体外均表现出协同抗肿瘤效应。in vitro。DOX与MMC共载的聚合物-脂质杂化纳米颗粒（DMPLN）可绕过多药耐药相关的多种外排转运蛋白泵，在乳腺肿瘤模型中显示出增强的疗效。与传统的溶液剂型相比，DMPLN的优越疗效归因于DOX与MMC同步的药代动力学特性，以及纳米载体PLN所介导的肿瘤细胞内药物生物利用度的提高。

为评估游离溶液和纳米颗粒形式共同给药的阿霉素（DOX）和丝裂霉素C（MMC）的药代动力学及生物分布，建立了一种简单高效的多药物反相高效液相色谱（HPLC）分析方法。与以往仅分别检测血浆中DOX或MMC的方法不同，该新型HPLC方法可同时定量多种生物基质（例如，全血、乳腺肿瘤和心脏组织）中的DOX、MMC以及一种主要的心脏毒性DOX代谢产物——阿霉素醇（DOXol）。本方法采用兼具荧光和紫外吸收特性的探针4-甲基伞形酮（4-MU）作为内标物（I.S.），实现多种药物在不同检测波长下的一步化检测。该方法已成功应用于原位乳腺肿瘤小鼠模型中，测定纳米颗粒和溶液两种给药方式下DOX和MMC在全血及多种组织中的浓度。所介绍的分析方法是纳米颗粒载体联合用药临床前研究的有力工具。

引言

化疗是多种癌症的主要治疗方式，但由于药物耐药性及其他因素，常伴随严重不良反应且疗效有限1,2,3。为了提高化疗效果，临床上已采用药物联合治疗方案，其设计依据包括毒性不重叠、药物作用机制不同以及无交叉耐药性等原则4,5,6。在临床试验中，与序贯给药方案相比，同时给予多种药物的联合治疗通常可观察到更高的肿瘤应答率7,8。然而，由于游离药物形式的生物分布不理想，多种药物的同时注射可能导致显著的正常组织毒性，其危害甚至超过治疗获益9,10,11。基于纳米载体的药物递送系统已被证明能够改变包载药物的药代动力学和生物分布，增强药物在肿瘤部位的富集12,13,14。正如我们在近期文章中所综述的，共载协同作用药物的纳米颗粒能够实现多种药物向肿瘤组织的时序与空间可控共递送，从而在癌细胞中产生协同药效，有效缓解游离药物联合使用时所面临的问题4,15,16。因此，在临床前和临床研究中均已证实此类纳米药物具有更优的治疗效果和较低的毒性4,17,18。

我们之前的 体外 研究发现，两种抗癌药物阿霉素（DOX）和丝裂霉素C（MMC）联用对多种乳腺癌细胞系具有协同作用，且将DOX与MMC共同载入聚合物-脂质杂化纳米颗粒（DMPLN）可克服多种与多药耐药相关的外排泵例如， P-糖蛋白和乳腺癌耐药蛋白19,20,21. 在体DMPLN 实现了阿霉素（DOX）和丝裂霉素 C（MMC）在肿瘤部位的时空共递送，并提高了药物在癌细胞内的生物利用度，这一点通过 DOX 代谢产物阿霉素醇（DOXol）的生成受到抑制得以证实22因此，与游离的DOX和MMC联合用药或脂质体DOX制剂相比，DMPLN增强了肿瘤细胞凋亡，抑制了肿瘤生长，并延长了宿主的生存期。22,23,24,25.

分析纳米载体共递送药物的实际含量对于设计有效的纳米颗粒制剂至关重要。已有多种方法通过高效液相色谱法（HPLC）单独或联合质谱法（MS）来检测血浆中单药阿霉素（DOX）或丝裂霉素C（MMC）的浓度26,27,28,29,30,31,32,33,34。然而，这些方法通常耗时较长，且在联合治疗中应用不切实际，因为需要为多种药物（有时还包括药物代谢物）的分析分别制备大量生物样本。此外，DOX和MMC在血浆中与蛋白质结合能力强，红细胞也具有很强的结合和富集多种抗癌药物的能力35,36。因此，仅通过血浆分析可能无法准确反映DOX或MMC在血液中的真实药物浓度。本研究（图1）介绍了一种简便且可靠的多药物分析方法，采用反相HPLC技术，可同时从全血及多种组织（例如，肿瘤）中提取并定量DOX、MMC以及DOX的代谢产物阿霉素醇（DOXol）。该方法已成功应用于测定游离溶液或纳米颗粒形式（即，DMPLN和脂质体DOX）给药后，在原位移植的鼠源性乳腺肿瘤小鼠模型中经静脉（i.v.）注射后DOX和MMC的药代动力学及生物分布，以及DOXol的生成情况22。

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方案

所有动物实验均经安大略癌症研究所大学健康网络动物护理委员会批准，并依照加拿大动物护理委员会指南进行。

1. 生物样本制备

  1. 在静脉注射含药物制剂后预设的时间点，采集全血、主要器官及乳腺肿瘤例如，DMPLN，脂质体DOX）
    1. 经尾静脉向荷乳腺肿瘤小鼠注射含有药物的制剂。
    2. 在指定时间点对小鼠进行麻醉（例如在密闭容器中给予可吸入的2%异氟烷，麻醉小鼠（约15分钟）。
    3. 将麻醉后的小鼠仰卧放置，使其鼻部穿过持续供给2%异氟烷的鼻罩。
      注意：为确保小鼠处于深度麻醉状态，可轻轻捏压小鼠前肢，观察是否出现抽动反应。
    4. 使用70%乙醇彻底清洁小鼠胸部和腹部区域，然后对深度麻醉的小鼠进行心脏穿刺终末操作，采用肝素化1 mL注射器和23 G针头。
    5. 将全血收集至已标记的喷有肝素钠的塑料管中，轻轻旋转混匀管体，确保所采集的全血与管壁涂层肝素充分接触。至少采集 50 µL 全血样本。始终将样品置于冰上。
    6. 将小鼠四肢用胶带固定，使用剪刀和镊子打开小鼠的腹腔和胸腔。将肠道移至一侧，向上推起肝脏以充分暴露门静脉。剪开门静脉以引流血液。
    7. 通过心脏灌注50 mL冰冻的0.9%生理盐水，使用带有25 G针头的10 mL注射器对整只小鼠进行灌注。
      注意：将针头弯曲于 90° 用于引导注射器进入门静脉。
    8. 依次切除以下器官：心脏、肺、肝、脾、肾。然后，使用剪刀在小鼠右侧乳腺脂肪垫处将乳腺肿瘤与周围结缔组织分离。将所有器官分别收集至1.5 mL聚丙烯管中，并迅速置于液氮中冷冻。
      注意：将胆囊从肝脏上分离。
    9. 将全血储存于 4 °C 以及 -80 °C 冰箱中保存的切除组织80 °C 冷冻保存，待后续进行高效液相色谱分析。
  2. 从生物基质中提取多柔比星、丝裂霉素C和多柔比星醇
    1. 迅速称量所有冷冻解剖组织，并转移至13 mL圆底锥形管中。为避免药物可能发生代谢或降解，需将样品置于冰上保存。
    2. 加入1-5 mL预冷的细胞裂解缓冲液至离心管中。
      注意：缓冲液体积的使用量需根据组织重量，按照组织与缓冲液质量体积比1 g : 5 mL（w/v）进行计算；对于心脏、脾脏等较小器官，比例为1 g : 2 mL。
    3. 使用电动手持匀浆器，在冰上以18,000 rpm的速度通过上下 strokes 动作匀浆组织样本。
      注意：完成匀浆需要进行约3至5次短时匀浆操作，每次短时匀浆时间少于15秒，每次之间需将组织置于冰上冷却。
    4. 用去离子蒸馏水（DDI H₂O）清洗匀浆器的10 mm锯齿形发生器探头2O、70% 乙醇，然后 DDI H2在每份组织样本之间留出 O，以避免交叉污染。
    5. 转移 50 µL 将组织匀浆或全血加入至1.5 mL聚丙烯微量离心管中，并加入标准品 5 µL 加入内标物（I.S.）4-甲基伞形酮（4-MU）（2000 ng/mL）至试管中。
      注意：4-MU 溶液在此用甲醇配制。
    6. 添加 250 µL 将冰冷的提取溶剂加入含有全血或组织匀浆的试管中。
      注意：提取溶剂由60%乙腈（ACN）和40%乙酸铵（5 mM）组成，使用0.05%甲酸将pH调节至3.5。样品与提取溶剂的体积比为1:5（v/v）。
    7. 剧烈涡旋振荡混合物2分钟，4 ℃下以3,000 × g离心 oC 下 10 分钟，用移液器吸取 200 µL 将上清液转移至另一预冷的干净微量离心管中。
    8. 蒸发上清液 60 °C 在避光条件下，用氮气缓慢吹扫。
    9. 用适当溶剂重悬干燥残留物 100 µL 冰冷甲醇，剧烈涡旋振荡30秒，然后在3000 × g离心 4 °C 再持续 5 分钟。
    10. 将上清液转移至HPLC小瓶插件中，并将样品瓶放入自动进样器样品盘中以备进样。

2. 高效液相色谱仪器及操作参数

  1. 以一致且可重复的方式制备高效液相色谱流动相
    1. 量取 500 mL HPLC 级 H2使用量筒量取 O。
    2. 使用单独的量筒量取500 mL色谱纯乙腈（ACN）。
    3. 小心地将 0.5 mL 三氟乙酸（TFA）（注意）加入每份 500 mL 的 H2O 和 ACN 以制备 H 的流动相2O 和含 0.1% TFA 的 ACN。
      注意：三氟乙酸（TFA）具有腐蚀性和毒性，应在实验室通风橱中操作。所有溶剂混合物均在室温下配制。
    4. 通过尼龙膜滤器过滤流动相 0.45 µm 孔径大小，并转移至洁净的HPLC储液瓶中。
  2. 设置高效液相色谱仪，用于同时检测阿霉素（DOX）、丝裂霉素C（MMC）、阿霉素醇（DOXol）及内标物4-甲基伞形酮（4-MU）。
    1. 打开梯度泵、脱气机、自动进样器、光电二极管阵列检测器和多波长荧光检测器。
    2. 输入流动相组成的初始条件为16.5% H2O（0.1% TFA）和 83.5% 乙腈（0.1% TFA）（v/v）
    3. 将紫外检测器设置为两个通道，一个在310 nm用于4-MU（内标），另一个在360 nm用于MMC。
    4. 将荧光检测器设置为两个通道，其中一个设为 λex/λem =365/445 nm，用于4-MU，另一个在λex/ λem分别为 DOX 和 DOXol 的 480 nm/560 nm。
    5. 设定等度流动相流速为1.0 mL/min。
    6. 平衡预装的反相C18 色谱柱（4.6 mm × 250 mm， 5 µm室温孵育10分钟以建立基线。
  3. 使用梯度流动相条件分离药物（DOX、MMC、DOXol 和 4-MU）。
    1. 注射 15 µL 使用自动进样器对提取并重新浓缩的样品进行分析。
    2. 在18分钟内使用自动梯度泵将初始流动相条件（参见方案步骤2.2.2）逐渐转变为100%乙腈（0.1%三氟乙酸）。
      注意：在分离过程中，同时出现四个通道（两个紫外吸收通道和两个荧光通道），每个通道显示一种药物化合物（参见实验步骤 2.2.3 和 2.2.4）。
    3. 保持100%乙腈（含0.1%三氟乙酸）1分钟，然后在1分钟内恢复至初始流动相条件。
    4. 以初始流动相在1.5 mL/min流速下重新平衡色谱柱4分钟，然后进行下一个样品进样。

3. HPLC 验证

  1. 制备多柔比星、丝裂霉素C、多柔比星醇和4-甲基伞形酮（内标）的工作标准品。
    1. 分别称取 1 mg DOX 和 MMC 药物粉末（注意）以及 4-MU，置于新的小张称量纸（3 英寸 x 3 英寸）上2).
      注意 所有抗癌药物均被视为健康危害物，吸入或摄入后可引起急性毒性及生殖细胞致突变性。操作时应谨慎，佩戴手套和口罩。
    2. 将称量好的DOX、MMC和4-MU分别转移至新的1.5 mL聚丙烯微量离心管中。
    3. 加入1 mL甲醇，短暂涡旋，以获得1 mg/mL浓度的DOX和MMC。
    4. 向含有预先称重的1 mg DOXol（注意）的样品瓶中加入1 mL甲醇，短暂涡旋振荡，以获得1 mg/mL浓度的DOXol溶液。
      注意：DOXol 是一种具有心脏毒性的代谢产物，应谨慎操作。
    5. 移液器 20 µL 将制备好的DOX、MMC、DOXol和4-MU储备液分别加入新的1.5 mL聚丙烯微量离心管中，并加入 980 µL 甲醇以获得工作标准品 20 µg/mL 每种药物
    6. 稀释 20 µg/mL DOX、MMC 和 DOXol 的甲醇工作标准品，浓度为 50 ng - 20 µg /mL（DOX、MMC 和 DOXol）以及 2000 ng/mL（内标物 4-MU）。
    7. 用一小片石蜡膜覆盖工作液管盖，以防止甲醇挥发，再用铝箔包裹整个管子以避免直接光照，于 -20 °C.
  2. 确定多柔比星（DOX）、丝裂霉素（MMC）和多柔比星醇（DOXol）在生物基质中的线性范围、精密度和准确度即， 全血和肿瘤匀浆。
    1. 同时加标 5 µL 50 ng/mL DOX 和 DOXol 工作标准品 20 µg/mL），丝裂霉素C（1,000 ng/mL - 16 µg/mL）和 4-MU（2 µg/mL) 进入 50 µL 在聚丙烯微量离心管中，使用空白全血或组织匀浆制备标准浓度曲线，药物化合物的浓度范围为 5 - 2000 ng/mL，内标物 4-MU 的浓度为 200 ng/mL。
    2. 执行方案1.2中所述的药物提取实验。
    3. 使用低、中、高浓度的多柔比星和多柔比醇（50、500 和 2,000 ng/mL）以及丝裂霉素C（100、1,000、2,000 ng/mL）进行日内和日间精密度与准确度测定。
      注意：在分析当天制备新鲜的标准品浓度。
  3. 样品分析
    1. 注射 15 µL 使用自动进样器对样品进行处理。
    2. 在0至18分钟内逐步改变流动相，逐渐增加乙腈（ACN）的比例。
    3. 18分钟后，保持流动相条件1分钟。
    4. 在接下来的2分钟内恢复至初始状态，然后在下一次注射前再平衡4分钟。
    5. 每次样品运行后，注意药物化合物的色谱峰及其保留时间显示如下：MMC、DOXol、4-MU（内标）和 DOX。
    6. 使用高效液相色谱（HPLC）软件对药物化合物的曲线下峰面积（AUC）进行积分。
    7. 计算各药物化合物与内标物（I.S.）的AUC比值（公式1），并利用在相同提取条件下制备的标准曲线测定DMPLN制剂中DOX、MMC和DOXol的药物浓度。
      峰面积比计算公式 AUC_药物/AUC_内标；用于数据分析的分析化学公式。
    8. 通过比较使用甲醇从加标生物样品提取物中重建的药物浓度与甲醇中的标准（“纯”）药物溶液浓度，计算药物回收率百分比（公式2）。
      药物回收率计算公式，\( \text{公式：药物回收率 \%} = \frac{\text{提取样品峰面积比}}{\text{纯净样品峰面积比}} \times 100 \)。

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结果

使用4-MU作为荧光检测器和紫外检测器的内标物，在相同的梯度高效液相色谱条件下，同时检测了两种抗癌药物DOX和MMC以及DOX的代谢物DOXol，且未受到任何生物干扰。MMC、DOXol、4-MU和DOX彼此之间实现了良好分离，保留时间分别为：MMC 5.7 min，DOXol 10.4 min，4-MU 10.9 min，DOX 11.1 min。图2）。全血及各种组织中的每种药物浓度均呈现线性关系，其相关系数（R2) 范围在 0.98 到 1.00 之间（图3 和 表1）。阿霉素（DOX）、阿霉素醇（DOXol）和丝裂霉素C（MMC）在全血中的定量下限（LLOQ）分别为10 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL，在各种组织中的定量下限分别为25 ng/mL、25 ng/mL和200 ng/mL（表1）。所建立的HPLC方法在...

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讨论

与仅能逐个检测单一药物成分的其他色谱方法相比，本高效液相色谱（HPLC）方案可在同一生物基质中同时定量三种药物化合物（DOX、MMC 和 DOXol），且无需更换流动相。该样品制备与分析方法已成功应用于两种基于纳米粒子的药物递送系统的药代动力学和生物分布研究。即， 脂质体阿霉素和DMPLN22. 由于 聚乙二醇化 纳米颗粒可延长所载药物的系统循环时间，从而在较长时间内维持较高的血液药物浓度（>24 h），该色谱方法在临床前研究中对纳米颗粒共载药物组合的大规模样品分析具有成本效益22游离阿霉素溶液和脂质体阿霉素的药代动力学如图所示 图4A 与已报道的啮齿类动物文献数据一致38,39，进一步支持了当前方法的有效性。尽管紫外光电二极管阵列检测器可利用不同波长通过多通道同时检测和显示药物（即...

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披露

作者无任何竞争性财务利益和利益冲突。

致谢

作者衷心感谢加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）为高效液相色谱仪（HPLC）提供的设备资助，感谢加拿大卫生研究院（CIHR）和加拿大乳腺癌研究联盟（CBCR）向X.Y. Wu提供的运行经费，以及多伦多大学向R.X. Zhang和T. Zhang提供的奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
阿霉素 聚合物治疗学111023抗癌药物
丝裂霉素C多聚医学治疗060814抗癌药物
阿霉素醇（DOXol）多伦多研究化学品公司D558020阿霉素的代谢产物
4-甲基伞形酮钠盐 Sigma-AldrichM1508内标物
十四烷酸Sigma-Aldrich544-63-8  用于聚合物-脂质杂化纳米颗粒的材料
聚氧乙烯（100）硬脂酸酯光谱M1402用于聚合-脂质杂化纳米颗粒的材料
聚氧乙烯（40）硬脂酸酯Sigma-AldrichP3440用于聚合物-脂质杂化纳米颗粒的材料
泊洛沙姆 F68 (PF68)BASF 公司9003-11-6用于聚合物-脂质杂化纳米颗粒的材料
超声处理（UP100H）Hielscher，超声技术NA纳米颗粒制备
水浴锅（ISOTEMP 3016HS）Fisher ScientificNA纳米颗粒制备
脂质体阿霉素  （Caelyx）Janssen购自玛格丽特公主医院药房临床批准的纳米颗粒制剂 
HPLC级甲醇Caledon Chemicals6701-7-40HPLC流动相组成
HPLC级H2OCaledon Chemicals8801-7-40HPLC 流动相组成
HPLC级乙腈 Caledon Chemicals1401-7-40HPLC 流动相组成
三氟乙酸Sigma-Aldrich302031HPLC流动相组成
0.45 μm 尼龙膜滤纸沃特曼WHA7404004高效液相色谱流动相的配制
1 cc 塑料注射器Becton, Dickinson and Company2606-309659治疗注射
5cc 塑料注射器Becton, Dickinson and Company2608-309646组织采集
30G 1/2 针头Becton, Dickinson and Company305106治疗注射
25G 5/8 针头Becton, Dickinson and Company305122组织采集
无菌0.9%氯化钠溶液多伦多大学自有品牌1011组织灌注
13 ml 圆底锥形管 SARSTEDT62.515.006脯氨酰脯氨酸，组织匀浆
α-最低必需培养基（MEM） Gibco12571063细胞培养基
1 × 磷酸盐缓冲液Gibco10010023组织匀浆
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100 mL组织匀浆
甲酸Caledon Chemicals1/5/3840调节萃取溶剂的 pH 值
肝素钠喷涂塑料管Becton, Dickinson and Company367878血液采集
分析天平 Sartorius CPA225DNA
pH计 Fisher Scientific13-637-671accumet BASIC
涡旋混合器Fisher Scientific02-215-365以所需速度涡旋混匀样品
1.5 ml  微量离心管Fisherbrand2043-05408129脯氨酸
Model 1000 匀浆器Fisher Scientific08-451-672组织匀浆
Centrifuge 5702REppendorf5702R提取样品制备
加热蒸发系统格拉斯-科尔NA样品重悬
HPLC 螺口小瓶DIKMA5320HPLC 样品进样
带白色硅胶/聚四氟乙烯隔垫的HPLC螺口盖DIKMA5325HPLC 样品进样
HPLC 聚丙烯插管  Agilent Technologies5182-0549最大体积 250 μl，HPLC 样品进样
Xbridge C18 色谱柱沃特世公司186003117药物分析
梯度泵 沃特世公司W600药物分析
自动进样器Waters CorporationW2707药物分析
光电二极管阵列检测器 沃特世公司W2998药物分析
多 λ 荧光检测器 Waters CorporationW2475药物分析
EMPOWER 2Waters CorporationNA数据分析软件
科学家MicromathNA药代动力学分析
雌性 Balb/c 小鼠杰克逊实验室001026体内
EMT6/WT 乳腺癌细胞由 Ian Tannock 博士提供；安大略癌症研究所NA体内

参考文献

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