方法文章

荷瘤小鼠中纳米颗粒递送药物组合后阿霉素与丝裂霉素C的样品提取及同步色谱定量分析

DOI：

10.3791/56159

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2017年10月5日

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1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Toronto, 2Departments of Medical Biophysics and Radiation Oncology, University of Toronto, Ontario Cancer Institute, University Health Network

本文内容

摘要

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本方案描述了一种高效且便捷的分析流程，用于从经纳米颗粒制剂协同药物组合治疗的临床前乳腺肿瘤模型的生物样本中提取样品，并同时测定多种药物，包括阿霉素（DOX）、丝裂霉素C（MMC）以及一种具有心脏毒性的阿霉素代谢物——阿霉素醇（DOXol）。

摘要

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联合化疗在临床上常用于癌症治疗；然而，其对正常组织的不良反应可能限制其治疗效果。基于纳米颗粒的药物联合已被证明可缓解游离药物联合治疗所面临的问题。我们先前的研究表明，两种抗癌药物阿霉素（DOX）和丝裂霉素C（MMC）联用对小鼠和人乳腺癌细胞在体外均表现出协同抗肿瘤效应。in vitro。DOX与MMC共载的聚合物-脂质杂化纳米颗粒（DMPLN）可绕过多药耐药相关的多种外排转运蛋白泵，在乳腺肿瘤模型中显示出增强的疗效。与传统的溶液剂型相比，DMPLN的优越疗效归因于DOX与MMC同步的药代动力学特性，以及纳米载体PLN所介导的肿瘤细胞内药物生物利用度的提高。

为评估游离溶液和纳米颗粒形式共同给药的阿霉素（DOX）和丝裂霉素C（MMC）的药代动力学及生物分布，建立了一种简单高效的多药物反相高效液相色谱（HPLC）分析方法。与以往仅分别检测血浆中DOX或MMC的方法不同，该新型HPLC方法可同时定量多种生物基质（例如，全血、乳腺肿瘤和心脏组织）中的DOX、MMC以及一种主要的心脏毒性DOX代谢产物——阿霉素醇（DOXol）。本方法采用兼具荧光和紫外吸收特性的探针4-甲基伞形酮（4-MU）作为内标物（I.S.），实现多种药物在不同检测波长下的一步化检测。该方法已成功应用于原位乳腺肿瘤小鼠模型中，测定纳米颗粒和溶液两种给药方式下DOX和MMC在全血及多种组织中的浓度。所介绍的分析方法是纳米颗粒载体联合用药临床前研究的有力工具。

引言

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化疗是多种癌症的主要治疗方式，但由于药物耐药性及其他因素，常伴随严重不良反应且疗效有限1,2,3。为了提高化疗效果，临床上已采用药物联合治疗方案，其设计依据包括毒性不重叠、药物作用机制不同以及无交叉耐药性等原则4,5,6。在临床试验中，与序贯给药方案相比，同时给予多种药物的联合治疗通常可观察到更高的肿瘤应答率7,8。然而，由于游离药物形式的生物分布不理想，多种药物的同时注射可能导致显著的正常组织毒性，其危害甚至超过治疗获益9,10,11。基于纳米载体的药物递送系统已被证明能够改变包载药物的药代动力学和生物分布，增强药物在肿瘤部位的富集12,13<....

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方案

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所有动物实验均经安大略癌症研究所大学健康网络动物护理委员会批准，并依照加拿大动物护理委员会指南进行。

1. 生物样本制备

  1. 在静脉注射（i.v.）给予含药物制剂后的预定时间点，采集全血、主要器官和乳腺肿瘤例如，DMPLN，脂质体DOX）
    1. 经尾静脉向荷乳腺肿瘤小鼠注射含有药物的制剂。
    2. 在指定时间点对小鼠进行麻醉（例如在密闭舱内给予可吸入的2%异氟烷（15分钟）。
    3. 将麻醉后的小鼠仰卧放置，使其鼻部穿过持续供给2%异氟烷的鼻罩。
      注意：为确保小鼠处于深度麻醉状态，可轻轻捏压小鼠前肢，观察是否出现抽动反应。
    4. 使用70%乙醇彻底清洁小鼠胸部和腹部区域，然后对深度麻醉的小鼠进行心脏穿刺终末操作，采用肝素化1 mL注射器和23 G针头。
    5. 将全血收集至已标记的喷有肝素钠的塑料管中，轻轻旋转混匀管体，确保所采集的全血与管壁涂层肝素充分接触。全血采集量不少于50 µL。样本始终置于冰上保存。
    6. 将小鼠四肢用胶带固定，使用剪刀和镊子打开小鼠的腹腔和胸腔。将肠道移至一侧，向上推起肝脏以充分暴露门静脉。剪开门静脉以引流血液。
    7. 通过心脏使用装有25 G针头的10 mL注射器，向整只小鼠体内灌注50 mL冰冻的0.9%生理盐水。
      注意：将针....

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结果

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在相同的梯度HPLC条件下，使用4-MU作为荧光检测器和紫外检测器的内标物（I.S.），可同时检测两种抗癌药物DOX和MMC以及DOX的代谢产物DOXol，且无任何生物干扰。DOX、MMC、DOXol和4-MU彼此之间实现了良好分离，保留时间分别为：MMC 5.7分钟，DOXol 10.4分钟，4-MU 10.9分钟，DOX 11.1分钟（图2）。DOX、DOXol和MMC在全血及多种组织中的浓度均呈现良好的线性关系，相关系数（R2）介于0.98至1.00之间（图3和表1）。DOX、DOXol和MMC在全血中的定量下限（LLOQ）分别为10 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL，在各种组织中的LLOQ分别为25 ng/mL、25 ng/mL和200 ng/mL（表1）。所建立的HPLC方法在全血及多种生物基质（例如

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讨论

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与仅能逐个检测单一药物成分的其他色谱方法相比，本高效液相色谱（HPLC）方案可在同一生物基质中同时定量三种药物化合物（DOX、MMC 和 DOXol），且无需更换流动相。该样品制备与分析方法已成功应用于两种基于纳米粒子的药物递送系统的药代动力学和生物分布研究。即， 脂质体阿霉素和DMPLN22. 由于 聚乙二醇化 纳米颗粒可延长所载药物的系统循环时间，从而在较长时间内维持较高的血液药物浓度（>24 h），该色谱方法在临床前研究中对纳米颗粒共载药物组合的大规模样品分析具有成本效益22游离阿霉素溶液和脂质体阿霉素的药代动力学如图所示 图4A 与已报道的啮齿类动物文献数据一致38,39，进一步支持了当前方法的有效性。尽管紫外光电二极管阵列检测器可利用不同波长通过多通道同时检测和显示药物（即.......

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披露

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作者无任何竞争性财务利益和利益冲突。

致谢

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作者衷心感谢加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）为高效液相色谱仪（HPLC）提供的设备资助，感谢加拿大卫生研究院（CIHR）和加拿大乳腺癌研究联盟（CBCR）向X.Y. Wu提供的运行经费，以及多伦多大学向R.X. Zhang和T. Zhang提供的奖学金。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
阿霉素 聚合物治疗学111023抗癌药物
丝裂霉素C多聚医学治疗060814抗癌药物
阿霉素醇（DOXol）多伦多研究化学品公司D558020阿霉素的代谢产物
4-甲基伞形酮钠盐 Sigma-AldrichM1508内标物
十四烷酸Sigma-Aldrich544-63-8  用于聚合物-脂质杂化纳米颗粒的材料
聚氧乙烯（100）硬脂酸酯光谱M1402用于聚合-脂质杂化纳米颗粒的材料
聚氧乙烯（40）硬脂酸酯Sigma-AldrichP3440用于聚合物-脂质杂化纳米颗粒的材料
泊洛沙姆 F68 (PF68)BASF 公司9003-11-6用于聚合物-脂质杂化纳米颗粒的材料
超声处理（UP100H）Hielscher，超声技术NA纳米颗粒制备
水浴锅（ISOTEMP 3016HS）Fisher ScientificNA纳米颗粒制备
脂质体阿霉素  （Caelyx）Janssen购自玛格丽特公主医院药房临床批准的纳米颗粒制剂 
HPLC级甲醇Caledon Chemicals6701-7-40HPLC流动相组成
HPLC级H2OCaledon Chemicals8801-7-40HPLC 流动相组成
HPLC级乙腈 Caledon Chemicals1401-7-40HPLC 流动相组成
三氟乙酸Sigma-Aldrich302031HPLC流动相组成
0.45 μm 尼龙膜滤纸沃特曼WHA7404004高效液相色谱流动相的配制
1 cc 塑料注射器Becton, Dickinson and Company2606-309659治疗注射
5cc 塑料注射器Becton, Dickinson and Company2608-309646组织采集
30G 1/2 针头Becton, Dickinson and Company305106治疗注射
25G 5/8 针头Becton, Dickinson and Company305122组织采集
无菌0.9%氯化钠溶液多伦多大学自有品牌1011组织灌注
13 ml 圆底锥形管 SARSTEDT62.515.006脯氨酰脯氨酸，组织匀浆
α-最低必需培养基（MEM） Gibco12571063细胞培养基
1 × 磷酸盐缓冲液Gibco10010023组织匀浆
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100 mL组织匀浆
甲酸Caledon Chemicals1/5/3840调节萃取溶剂的 pH 值
肝素钠喷涂塑料管Becton, Dickinson and Company367878血液采集
分析天平 Sartorius CPA225DNA
pH计 Fisher Scientific13-637-671accumet BASIC
涡旋混合器Fisher Scientific02-215-365以所需速度涡旋混匀样品
1.5 ml  微量离心管Fisherbrand2043-05408129脯氨酸
Model 1000 匀浆器Fisher Scientific08-451-672组织匀浆
Centrifuge 5702REppendorf5702R提取样品制备
加热蒸发系统格拉斯-科尔NA样品重悬
HPLC 螺口小瓶DIKMA5320HPLC 样品进样
带白色硅胶/聚四氟乙烯隔垫的HPLC螺口盖DIKMA5325HPLC 样品进样
HPLC 聚丙烯插管  Agilent Technologies5182-0549最大体积 250 μl，HPLC 样品进样
Xbridge C18 色谱柱沃特世公司186003117药物分析
梯度泵 沃特世公司W600药物分析
自动进样器Waters CorporationW2707药物分析
光电二极管阵列检测器 沃特世公司W2998药物分析
多 λ 荧光检测器 Waters CorporationW2475药物分析
EMPOWER 2Waters CorporationNA数据分析软件
科学家MicromathNA药代动力学分析
雌性 Balb/c 小鼠杰克逊实验室001026体内
EMT6/WT 乳腺癌细胞由 Ian Tannock 博士提供；安大略癌症研究所NA体内

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D. B., Johnston, P. G. Cancer Drug Resistance: An Evolving Paradigm. Nat. Rev. Cancer. 13 (10), 714-726 (2013).
  2. Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Booth-Genthe, C., Gottesman, M. M. Targeting Multidrug Resistance in Cancer. Nat Rev Drug Discov. ....

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