利用自动化微型生物反应器技术优化异源蛋白生产的通用方案

摘要

本文描述了一种针对微生物培养基进行定制化设计的通用方法。该方法通过结合基于克里金法（Kriging）的实验设计与微生物反应器技术，实现足够的培养通量，并借助实验室自动化机器人技术提高液体处理和培养基制备的可靠性与速度，从而实现迭代式工作流程。

摘要

在利用微生物生产细胞工厂的工业生物技术领域中，一个核心业务是菌株工程与生物工艺条件优化的迭代过程。其中一个重要的方面是培养基的改进，以为目标产物的微生物合成提供最佳环境。众所周知，培养基的组成会显著影响整个生物工艺的性能。营养培养基的优化已被证实可提高微生物系统中重组蛋白的产量，因此这一步骤在生物工艺开发中具有重要价值。然而，由于定制化设计培养基是一项繁琐的工作，通常需要微型生物反应器技术以实现足够的培养通量、快速的产品分析，以及实验室自动化设备的支持以确保液体操作步骤的可靠性，因此人们往往直接采用文献中的标准培养基配方。此外，还需要先进的数学方法来合理分析测量数据，并高效设计平行实验，以获得最优的信息含量。

本方案的通用性使其能够轻松适配不同的实验室设备、其他表达宿主、目标蛋白以及进一步的生物工艺参数。此外，还可根据其他优化研究的范围，选择蛋白质生产速率、比产量或产品质量等其他优化目标。所采用的克里金工具箱（KriKit）是一种用于实验设计（DOE）的通用工具，有助于实现更全面的生物工艺优化。该工具箱还支持多目标优化，这对于上游和下游工艺的同时优化具有重要意义。

引言

现代重组基因技术使得工业酶能够广泛应用于制药工业、动物饲料、有机化学和食品加工等领域^1,2,3。大量生产工业酶是工业生物技术及优化重组蛋白生产的重要课题，需要菌株工程和生物工艺工程的共同支持。为了构建高效工程化生产菌株，目前已开发出多种遗传文库，e.g.，用于实现基因表达平衡⁴或提高分泌效率⁵。

谷氨酸棒状杆菌 是工业规模氨基酸的主要生产商^6,7 并且是用于分泌型生产重组蛋白的一种具有吸引力的非常规表达宿主^8,9分泌（Sec）途径和双精氨酸转运（Tat）途径均存在于 C. glutamicum 并成功应用于重组蛋白的分泌¹⁰在工业规模氨基酸生产方面的生物过程工程领域拥有丰富经验，以及能够将蛋白质分泌至克/升级别。¹¹ 以及对大规模培养中常见的生物过程非均一性具有高度稳健性^12,13，制备 C. glutamicum 一种有前景的工业规模外源蛋白分泌生产的平台生物。

营养培养基优化已知可提高微生物系统中重组蛋白的产量^14,15,16,17 因此，在生物工艺开发中，调整培养基成分是提高最佳生产率的有效步骤^18,19,20,21对微量滴定板（MTPs）在微生物培养中应用的深入研究^22,23,24 为微生物培养用多通道平板（MTPs）的开发与设计奠定了基础^25,26 基于MTP的微生物反应器（MBR）系统及其在线监测与环境控制的开发^27,28膜生物反应器（MBR）可显著提高实验培养的通量。此外，MBR系统还可衍生自其他类型的生物反应器。 例如，可用于微生物生物过程优化的鼓泡柱或搅拌槽反应器^29,30,31,32.

通常情况下，优化研究受益于提高实验通量，当与实验设计（DOE）方法相结合时，这种优势更为显著，例如可用于评估设计变量之间的相互作用或降低高维搜索空间的复杂性。因此，微孔板反应器（MBR）系统、实验室自动化与实验设计（DOE）的联合应用已被证明是生物技术领域中一种强大的方法^{8,16,33,34,35}。

本文介绍了一种结合了先进实验室自动化、带在线过程监测的膜生物反应器（MBR）技术以及基于克里金法（Kriging）的数据分析与实验设计的培养基优化方案。该克里金方法已集成于一个MATLAB工具箱（“KriKit”）中，可免费下载并使用³⁶。作为应用示例，通过优化CgXII最小培养基的组分，实现了谷氨酸棒状杆菌（C. glutamicum）分泌型绿色荧光蛋白（GFP）产量的最大化。选择GFP滴度作为优化目标，是因为其易于定量检测，并且在MBR系统研究中被广泛用作模型蛋白^37,38,39。

所示框架分为四个步骤，如图1所示。这些步骤以方框标出，对应于方案的各个部分。第一步（图1A）是明确项目目标并确定所需方法。将实验设计（DOE）方法、膜生物反应器（MBR）技术与实验室自动化相结合，可提高实验通量，但同时也要求强大的数据处理能力。第二步（图1B）旨在识别对优化目标具有显著影响的敏感设计变量（即，培养基组分），从而减少需要关注的设计变量数量。第三步（图1C）包括一个迭代优化过程，用于更详细地研究剩余设计变量与目标之间的函数关系。利用逐步扩展的数据集，采用克里金（Kriging）方法预测未测量点的实验结果。当克里金模型能够以足够精度预测出最优值或平台期时，迭代循环即告终止。第四步（图1D）用于验证结果，首先在已识别的最优区域周围进行进一步的敏感性分析。如果最初被判定为不敏感的组分在最优区域内仍表现为不敏感，则可以合理推断在第三步的迭代优化过程中该结论同样成立。随后，建议通过正交方法（如活性测定或SDS-PAGE）验证优化结果。

本方案的通用性使其能够轻松适配不同的实验室设备、其他表达宿主和目标蛋白，以及进一步的生物工艺变量，如pH值或培养温度。此外，还可根据其他优化研究的范围，选择蛋白质生产速率、比产率或产品质量等其他优化目标。

图 1：优化研究的工作流程。 四个方框分别对应本方案的四个部分：“研究构思与方法定义”（第1节）、“敏感性分析”（第2节）、“迭代优化”（第3节）和“验证”（第4节）。请点击此处查看此图的放大版本。

方案

1. 研究构思与方法定义（图1：A部分）

注意：优化目标的定义：是否需要产物生成的时间过程数据，还是仅需有限的时间区间甚至固定时间点的数据？同时需考虑潜在问题，如产物稳定性、分析定量所需工作量或培养时间。除最终蛋白滴度外，也可选择其他优化目标，例如生物量或培养时间。生物量可通过单位生物量的产物得率来反映，而培养时间则可通过时空产率来体现。最低限度的产物质量也可能成为目标之一。在某些情况下可能需要进行多目标优化，相关内容在其他文献中已有讨论⁴⁰。本研究中选择培养17小时后的GFP滴度作为优化目标。利用本研究中可用的设备可在线监测GFP荧光，从而极大简化模型蛋白浓度的测定。
注意：待优化参数的定义：CgXII培养基包含16种单独组分⁴¹，若对所有组分采用全因子实验设计，将需要进行2¹⁶ ≈ 65,000次实验。因此，必须基于合理性和经验依据缩小搜索空间。可用于优化的培养基组分的选择可由现有专家知识或文献数据支持。

1. 确定哪些培养基组分浓度不应被改变。在CgXII培养基的优化过程中，以下组分被选定为固定成分：
   1. 葡萄糖浓度固定为10 g/L。该优化过程较为简单，因为较高的葡萄糖含量可产生更多的分泌GFP的生物量。研究目的是揭示非直观的培养基效应。
   2. 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）的浓度固定为42 g/L。该浓度在批次培养过程中可提供足够的缓冲能力，且不会被代谢。
      注意：以该终浓度添加MOPS可确保起始pH值为7，即使所加入的其他储备溶液因pH值不为7而带来体积差异。然而，为排除起始pH值的任何偏差，应在所有储备溶液分别加入最大和最小体积的培养基组成条件下检测pH值。
   3. KH₂PO₄ 和 K₂HPO₄ 均固定为1 g/L。这些成分还提供缓冲能力，并作为磷酸盐来源。
   4. 尿素浓度固定为 5 g/L。该成分作为基础氮源和 pH 稳定剂，足以防止氮限制。
   5. 生物素固定在 0.2 mg/L。 C. glutamicum ATCC13032 菌株为生物素营养缺陷型。
   6. 原儿茶酸（PCA）固定为30 mg/L，用作铁螯合剂。
   7. 异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）固定为 100 µM。它可诱导表达 gfp 基因
2. 为初步敏感性筛选选择培养基成分的高浓度和低浓度。本实验选取了三类典型培养基成分中的组分。各组分所考察的低浓度与高浓度如下：
   1. 标准氮源：(NH₄)₂SO₄ （8–32 g/L）；据报道，氮源的改变对优化单位生物量特异性GFP信号具有潜力⁸.
   2. 微量元素：FeSO₄ ∙ 7 H₂O（4-16 mg/L），MnSO₄₄ ∙ H₂O（4-16 mg/L），ZnSO₄₄ · 7 H₂O（0.4–1.6 mg/L），CuSO₄₄ ∙ 5 H₂O（125-501 µg/L），NiCl₂ · 6 H₂O（8-32 µg/L）和 CoCl₂ · 6 H₂O（52–208 µg/L）。微量元素的组成沿自CgXII培养基的首次发表文献。⁴¹。此外，Na₂MoO₄ · H₂O（26-104 µg/L）和 H₃BO₃ （20–80 µg/L）作为微量元素加入，因为其被用于已发表的CgXII培养基变体中⁴².
   3. 宏量元素：MgSO₄₄ ∙ 7 H₂O（0.2–0.4 g/L），CaCl₂ ∙ 2 H₂O（5.3–21.2 mg/L）。在另一项研究中，这些物质被发现可在其他二价阳离子中增强分泌型GFP的产生。¹⁴，其中 C. glutamicum 使用菌株R，并采用不同的培养基背景和CgR0949 Tat信号肽。
3. 材料准备与定义步骤
   注意：建议在详细层面确定并固定实验方法。这种标准化可确保不同结果能够追溯至内在的生物学变异或不同的培养基成分。
   注意：培养基储备液：为所有被研究的培养基组分分别配制单独的储备液。储备液应配制成高浓度，以便在稀释时可使用不同体积的储备液。这意味着，按照实验设计将所有储备液以其最大体积混合后，总体积不得超过最终培养体积。 参见 配制培养基母液加样列表的第1.3.3步。如果加入高浓度溶液会导致加样体积过小， 例如 < 1/100^th 根据最终培养体积，相应稀释储备液。例如，本研究中规定低于10 µL的移液体积不可行。通常，微量元素溶液的浓度相对于培养基中的标准终浓度可浓缩至1,000倍。将培养基组分相对于参考配方中的浓度浓缩为若干倍（X倍）更为有利，如此可避免出现难以操作的微量小数移液体积。CgXII培养基所有储备液的详细配方见补充文件。
   1. 工作细胞库（WCB）
      注意：每次生长实验使用一份WCB等分试样。若需要更多等分试样，可使用1,000 mL带挡板的摇瓶装100 mL脑心浸液（BHI）培养基，或接种多个摇瓶，然后在加入甘油溶液前将培养物混合。
      1. 制备重组表达菌株的单菌落 C. glutamicum pCGPhoD^Bs-GFP⁴³ 在琼脂平板上培养（37 g/L BHI 粉末，20 g/L 琼脂，25 mg/L 卡那霉素）。接种材料可来自新鲜的转化产物，也可来自冻存的分装样品。在 30 °C 下培养，直至单菌落出现；通常需要一至两天。
      2. 将菌落材料接种于摇瓶培养物中（50 mL BHI培养基含25 mg/L卡那霉素，500 mL挡板摇瓶，250 rpm，25 mm振荡直径，30 °C），过夜培养（约16 h）。
      3. 将一份体积的细胞悬液与一份体积的500 g/L无菌甘油溶液混合，分装至无菌冻存管中，每管2 mL。于-80 °C保存。
   2. 膜生物反应器培养方案
      注意：本研究中所用的 BioLector MBR 系统中，散射光（生物量）和 GFP 荧光均为强度测量，需设定相应的增益值。增益越高，光学信号的放大程度越高；这也是散射光和荧光以任意单位（a.u.）表示的原因。应在预实验中确定生物量和 GFP 检测的合适增益值，同时确定合适的振荡频率和装液量，以避免在后续工艺阶段高生物量浓度时出现氧限制。所采用的培养条件（“Flowerplates”） 即，花形48孔微孔板，振荡频率1,200 rpm，装液量1,000 µL，以10 g/L葡萄糖为主要碳源）可确保培养过程中的氧气供应不受限制。关于花形48孔微孔板在不同装液量与振荡频率组合下所产生的最大氧传递速率，供应商可提供相应的数据表。此外，个别培养物可能出现生长缺陷，原因可能是次要底物含量较低（例如氮、微量元素）。因此，需在培养结束时检测生物量浓度。本研究中未观察到此类生长效应。
      1. 定义膜生物反应器系统（“BioLector”）的培养方案如下：
      2. 滤光片组1：生物量，增益14。滤光片组2：pH，增益预设。滤光片组3：pO2，增益预设。4：GFP，增益80。
      3. 振荡频率：1,200 rpm。
      4. 温度：30 °C。
      5. 循环时间：15 分钟。
      6. 实验时间：手动控制（培养不会自动停止）。
   3. 中等储备溶液配制移液清单
      注意：几乎所有液体处理机器人系统都能够从外部文件读取移液操作。基本上，所需最少信息包括试剂来源的转移体积及其位置，以及目标位置，这些位置由机器人平台上的耗材位置及耗材内的特定孔位表示。然而，必须考虑不同液体处理系统所采用的不同语法格式。 图2 展示了本研究中所用移液系统的示例文件结构。
      1. 将四种类型的储备溶液移液至每个培养孔中：
         1. 培养基成分的储备溶液（其含量可变）("变异品系").
         2. 用于补偿上述储备液不同累计体积的水。
         3. 储备溶液（“备用库存）包含所有固定组分。该储存液可由含有不同组分的储备液配制而成，这些组分是， 例如，于不同温度下储存或经不同方法灭菌。
         4. 接种物应作为最后组分加入，且在即将加入前再放置于工作台，以避免细胞沉降。
      2. 每个培养孔，根据以下公式计算所有培养基组分需转移的体积：
         
         需添加的体积 变异品系 可能为零， 即，当省略该特定组分时。
      3. 修订所有计算出的体积 V_i 合适的数量。分步移液时的体积增量不应过小。必要时，调整溶液的浓度以 变异品系例如，此处定义的最小移液体积为10 µL，最小增量为5 µL。通常，这些体积参数应根据所用液体处理工作站经实验测定的精密度和准确度来确定。^15,44.
      4. 计算体积 剩余库存 包含所有孔的固定组分，如下所示：
         
         最大累积体积 变异株库存 被使用。因此，计算固定组分所需的浓度 储备液 如下所示：
         
         准备 剩余库存 相应地。
      5. 每个培养孔中需添加的水体积按如下方法计算：
         
      6. 每孔培养中，按以下添加顺序列出所有需加入的体积： V_H2O，V_RestStock，V_i，V_Inok根据液体处理工作站的规格设置移液列表，示例格式如图所示 图2.
4. 种子培养、自动化培养基制备及主培养启动
   1. 创建液体处理机器人的操作流程。参见 图3 和 图4 以“Janus”系统为例的实验方案，该方案在相应的“WinPREP”软件中实现。该方案应考虑以下方面：
      1. 在培养基制备前，应预留足够的无菌环境运行时间。
      2. 包括对所有移液吸头和管路进行初步的彻底清洁和冲洗。
      3. 选择合适的储存容器来配制储备液。此处，具有12列的深孔板适用于储存 变异品系，因为所有八个移液吸头可以平行地浸入孔列中，这大大加快了培养基的制备速度。如果使用15 mL或50 mL试剂管作为储液槽，则每次只能有一个移液吸头浸入其中。对于水等其他储备液 剩余库存，使用100 mL槽，因为这些储备溶液总体需要较大的体积。
      4. 为每种储备液提供足够的总体积，以补偿损耗体积和移液高度偏差， 等等。
      5. 在接种步骤之前插入用户提示，确保该步骤在种子培养操作前立即执行。
   2. 以无菌方式配制所有储备液，并将其储存于适当的容器中，直至使用。 例如无菌的15 mL和50 mL试管。
   3. 在工作台上对用于储存储备溶液的深孔板进行灭菌， 例如用70%乙醇擦拭，并在超净工作台中干燥。
   4. 通过将一份WCB接种到含有25 mg/L卡那霉素的50 mL BHI培养基中，启动种子培养。在MBR培养前，从处于对数生长期的种子培养物中制备足量的新鲜且具有活性的接种物。
   5. 将所有必要的实验器材放置于机器人工作台，并将储备溶液倒入相应的实验器材中。
   6. 启动用于培养基制备的机器人工作流程，确保在种子培养开始时同步完成最后一步（接种）。需预先评估机器人工作流程的总运行时间，此处总运行时间约为1.5 h。
   7. 在约2小时后取种子培养物样品，之后每小时取样一次，通过光密度（OD）监测生长情况₆₀₀）。培养约5小时后，菌液浓度达到3-4 OD₆₀₀ 用于接种主培养物。
   8. 将种子培养物置于液体处理工作站台面上，并继续进行培养基制备程序。接种后密封培养用MTP。
   9. 将密封的培养MTP放入BioLector设备中，并启动预设的培养程序。
   10. 根据生物安全规定，必要时处理剩余的储备溶液，并从机器人工作台接种培养物。清洗可重复使用的实验器具，并启动液体处理设备的去污程序。
5. 产物定量及原始数据的分析前处理
   1. 在培养17小时后终止主培养。
   2. 使用 BioLection 软件包，按照制造商用户手册中的说明，将测量数据从 BioLector MBR 设备传输至连接的计算机。
   3. 使用随 MBR 系统提供的“BioLection”软件包中的“数据管理 → 转换数据”功能，将原始数据文件转换为便于访问的电子表格格式。从最接近 17 h 的时间戳列中复制所有培养孔的 GFP 信号数据。识别参考培养孔的 GFP 信号并计算其平均值。以参考信号的平均值为基准，对所有其余的 GFP 信号进行归一化处理。
   4. 使用其他方法定量测定GFP滴度（如有需要）
      1. 将所有培养孔中的细胞悬液转移至预先标记的反应管中，使用台式离心机在最大转速下离心10分钟，获得无细胞上清液。
      2. 将每种无细胞上清液各200 µL转移至底部透明的黑色96孔微孔板中，使用适当的酶标仪在488/520 nm处检测GFP特异性荧光。参照步骤1.5.3，以参比培养孔的平均信号值对所有孔的GFP信号进行归一化处理。
         注意：不同测量设备之间的绝对GFP荧光信号无法进行比较。因此，所有主培养中的5种参考菌株作为内部标准。GFP滴度的提升可通过与内部标准相对比来表示。这使得不同实验及不同GFP定量方法（见接下来的两个步骤）的结果之间具有可比性。
      3. 采用标准方案测定无细胞上清液中的蛋白质含量， 例如，Bradford 或 BCA 法。结合步骤 2 的结果，可测定蛋白质特异性的 GFP 滴度。
         注意：荧光测定后，直接使用该微孔板中的样品。使用多通道移液器可显著简化必要的液体操作步骤。
      4. 按照标准方案对无细胞上清液进行SDS-PAGE可视化，以验证蛋白质含量的增加主要是由于GFP分泌量增加所致。
         注意：与前述方法相比，SDS-Page 检测更为耗时，尤其是在样本量较大时。出于验证目的，通常只需对参照培养基和最终优化培养基培养所得的无细胞上清液进行 SDS-Page 电泳即可。¹⁵.

2. 敏感性分析（图1：B部分）

注意：此部分的目标是确定对目标具有显著影响的重要因素。

1. 选择培养基组分的初始浓度范围。参考培养基的组成应位于所选浓度范围内。
2. 选择合适的实验设计（DOE）。此类设计可在文献中找到，例如，NIST/SEMATECH 统计方法电子手册（网址：www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm）。所选设计取决于感兴趣的培养基组分数（此处为11个）以及执行的实验次数（此处为32次）。在本示例中，选择了“2_IV^11-6”设计，该设计产生32个实验，可用于估计将11个组分中任意一个的浓度升高对目标变量的影响。更具体地说，主效应不会与两两因子交互作用混杂，但可能与高阶交互作用混杂，然而高阶交互作用通常极不可能显著。
3. 利用剩余的孔（此处为16个）对参考培养基进行多次重复实验，以评估过程的可重复性。重复实验应均匀分布在整块板上，以便发现位置效应。参考实验测得输出值的平均值用于归一化处理，即敏感性分析中每个测得的输出值均除以参考输出值的平均值。
4. 使用适当的统计软件计算主效应及可能的组合效应。经典的实验设计基于多项式近似⁴⁵。例如，可使用 MATLAB 中的 mvregress 函数来估计多项式系数。mvregress 函数属于统计与机器学习工具箱。
5. 通过 t 检验识别不同培养基组分对目标变量的显著效应。在本示例中，NH₄⁺ 具有显著的负效应，而 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 表现出最强的正效应（图5）。由于GFP信号已归一化，这些系数表示当特定组分的浓度从其中心值 增加至其最大值时，GFP信号的平均相对变化。
6. 在优化过程中，对无显著效应的固定组分保持其参考值不变。

3. 迭代优化（图1：C部分）

注意：使用 MATLAB 工具 KriKit 进行数据解释和统计分析³⁶。KriKit 允许用户构建数据驱动的克里金模型。该克里金模型可预测培养基组分与目标之间的函数关系，并提供关于预测不确定性的信息。高不确定性表明数据噪声较大和/或数据密度不足。

1. 美国能源部
   注意：新实验将根据上一轮实验的结果进行迭代设计。
   1. 在第一轮迭代中，设计新的实验以深入研究已确定的关键培养基组分。第2部分的实验结果不能用于迭代优化（第3部分），因为无显著影响的组分浓度现已固定为相应的参考值。因此，敏感性分析实验与迭代优化实验之间不具备可比性。
   2. 否则，遵循图示方案 图1，框架“迭代优化”。如果潜在最优值位于定义的浓度范围内，则使用期望改进来设计新的实验^40,46基于预期改进的实验设计已整合到 KriKit 工具箱中。若最优值位于边界处，则扩展浓度范围。
2. 按照第2节中定义的实验方法，在设计的采样点进行实验。
3. 统计分析
   1. 使用包含当前迭代在内的所有迭代的合并数据构建克里金模型。
   2. 利用 KriKit 的综合工具（2/3D 插值、视频分析、筛选图）通过可视化方法探究模型输出 等等。).
4. 如果已以足够的精度估算了最佳区域，则停止优化；否则，继续执行步骤 3.1。
   注意： 图6 展示了测试研究的迭代优化过程。浓度范围逐步扩大，直至发现平台期（迭代1-6）。第七次迭代用于更详细地探索边界条件。

4. 结果验证（图1：D部分）

注意：完成迭代优化后，需要验证初始假设的有效性。

1. 重新进行最优培养基成分的敏感性分析（第2节），即对所研究组分的浓度进行敏感性分析。 图1 （C 部分）被固定在其最优值上，其他组分的浓度则根据适当的实验设计（DOE）进行变化。
   注意：两次筛选结果相似表明，所研究组分的浓度水平不会改变其他组分的作用效果。如果筛选结果与B部分结果存在显著差异，则应将作用发生变化的组分添加至待研究组分池中，并重复C部分实验。
2. 在间接测量的情况下（例如，以荧光作为产物浓度的指示），采用正交测量方法（例如，活性测定，Bradford 或 BCA 蛋白定量，SDS-PAGE）通过比较参考培养基和优化培养基的实验结果，验证目标指标的变化¹⁵.

结果

本研究采用所述方案以最大化分泌型绿色荧光蛋白（GFP）的滴度。具体而言，选择培养17小时后的GFP滴度作为优化目标。通过在线荧光检测可实现对产物的简便定量。然而，必须将GFP信号与参照培养实验的数据进行归一化处理，以确保结果的可重复性和可比性。培养基组分的初步筛选是基于理性分析进行的，如第1节所述。实验操作严格按照第1节中的说明进行：整个研究中湿实验流程的参数均保持一致，以确保结果的一致性和可重复性。

如第2节所述，首先进行初步筛选，以鉴定出对后续更详细研究中的优化目标具有显著影响的相关组分。基于MTP的MBR系统可实现48个实验的平行进行。考虑到单个MTP上可进行的最大平行实验数（48）以及培养基组分的总数（11），选择2_IV^11-6部分因子设计是合适的。该实验设计包含32个实验，可估计所考察的每种培养基组分的主效应。剩余的16个培养孔则用于参考培养基实验的多次重复，以评估实验的可重复性及位置效应。即，除参考实验设置5次重复外，其余每个实验均仅进行一次（无重复）。

表1总结了筛选分析的结果。在所考察的浓度范围内，改变大多数培养基组分对目标未表现出明显影响。其中，NH₄⁺表现出强烈的负效应，而Ca²⁺和Mg²⁺则表现出最强的正向趋势。Mg²⁺在当前浓度范围内的效应不显著，但在更宽的浓度范围内可能具有影响。因此，决定从培养基中去除NH₄⁺，并在后续实验中进一步研究Ca²⁺和Mg²⁺的作用。

第3节描述了在改变Ca²⁺和Mg²⁺浓度的同时，用于最大化GFP荧光信号的迭代优化过程。在第一次迭代中，验证了NH₄⁺可被省略的假设。Ca²⁺和Mg²⁺的浓度范围取自初筛分析结果。NH₄⁺的最低浓度设为零，最高浓度沿用初筛实验中的数值。在后续实验中，各组分浓度在定义的浓度范围内以3 × 3 × 3的网格分布，共进行27组实验。所有培养过程中均包含5份参考培养基的重复样本，作为内部标准，以确保微孔板（MTP）上无位置效应影响。其余16个孔中，NH₄⁺、Ca²⁺和Mg²⁺的浓度在给定范围内随机分布。

图5A展示了前几次迭代的结果。坐标轴标签表示原始参考培养基中各组分的浓度，以x Ref表示。蓝色曲面代表使用KriKit软件计算得到的克里金插值结果。每个曲面对应于NH₄⁺的不同相对浓度水平（深蓝色：0倍参考浓度，格纹状：1倍参考浓度，浅蓝色：2倍参考浓度）。该可视化结果表明，省略NH₄⁺更为有利。插值曲面还显示出Mg²⁺和Ca²⁺的积极作用，因为所有曲面均随其浓度增加而上升。

根据第一轮迭代的结果，决定将 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的浓度范围扩大，即将最大浓度加倍，并将实验设计窗口移至右上角，见图 5B。在此范围内，浓度以 6 × 6 网格分布，从而确保在整个浓度范围内均匀分布，以获得最优的克里金插值结果。图 5B 显示了基于两轮迭代合并数据所得的克里金插值图（红点和黄方块）。对于 Ca²⁺ 和 Mg²⁺，增加其浓度的正向效应持续存在。因此，重复该过程，再次将最大浓度加倍，从而进一步移动实验设计窗口，以探索右上角区域的边界。

图6A 概述了剩余的优化过程。对迭代3之前收集的数据集进行分析，揭示了Mg对正效应的限制²⁺, 即，Mg的最适浓度范围²⁺ 被鉴定出来。因此决定仅对Ca进一步扩大浓度范围²⁺ （第4轮）。该步骤重复进行两次（第5轮和第6轮），直至观察到GFP信号达到饱和。此饱和现象可归因于所用钙浓度下Ca盐的沉淀。²⁺，细胞无法获得这些物质。

由于实验结果总会受到噪声干扰，所得到的克里金插值结果会显得不规则，仅通过视觉检查可能会导致错误结论。然而，利用统计学中的z检验可可靠地确定培养基组分达到饱和GFP信号的最优浓度范围，该方法也已集成于KriKit工具包中。z检验直接利用克里金方法提供的内在统计信息，即预测值和预测不确定性。图6B展示了使用KriKit工具包确定并可视化呈现的平台区。KriKit工具包可免费获取³⁶，并附有详细教程，说明如何使用其各项功能。

如果发现超过两个相关组分，三维可视化将达到其极限。KriKit 提供了其他多种可能的可视化方法，例如动画或“筛选图”。如果潜在最优值位于定义的浓度范围内，系统将基于预期改进自动设计新的实验^40,46。基于预期改进的实验设计已集成在 KriKit 工具箱中。更详细的信息可参见软件文档。

经过迭代过程后，按照D部分所述对结果进行了验证。通过使用最优培养基组成进行额外的敏感性分析，检验了初始假设的有效性。即，所有初始培养基中关注的组分均被改变，但Ca²⁺和Mg²⁺被设定为其最优浓度水平。在本研究中，选择的最优浓度为 = 32 × Ref 和 = 6.8 × Ref。表2展示了验证筛选的结果。与初始敏感性筛选（参见表1）类似，NH₄⁺仍具有显著的负面影响，其余效应仍然可忽略不计。

由于易于获取，所有实验中均采用培养悬浮液中的GFP荧光信号来定量胞外GFP滴度。为验证结果，将GFP荧光信号与其他检测方法进行了比对。由于GFP通过Tat途径分泌，荧光信号无法区分胞内与胞外GFP。因此，使用基础培养基和优化培养基重复进行了培养实验。除对无细胞培养上清液进行荧光测定外，还通过Bradford法测定蛋白质含量，并通过SDS-PAGE对GFP表达水平的（半）定性改善情况进行可视化分析。¹⁵所有测量信号在优化培养基中的培养条件下相较于参考培养基均大约增加了一倍，验证了优化培养基使分泌性能提升了约100%。因此，培养液中GFP的特异性荧光可被视为评估优化目标的一个合适指标。 即细胞外GFP滴度。

图 2：用于灵敏度分析的移液体积列表截图。 第一列中的条目为每一行的所有体积分配唯一的标识符；该标识符是液体处理工作站工作台面上目标培养MTP的MTP孔编号，参见图 4C。其余各列编码了需移取的不同溶液（“Sln-01”至“Sln-15”）的体积。每一行的累计体积对应于相应孔的最终培养体积。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：液体处理控制软件“WinPREP”的截图。 左侧：按行排列的指令，包括针对每种需移取的储备溶液的转移指令。在接种液添加的最后一条指令之前，插入了一个用户提示，以确保种子培养物能够及时放置于操作台上。右侧：工作台的示意图，包括变异储备液的来源耗材（两个深孔板，每板含12列式孔）、用于剩余储备液、水和接种液的试剂槽，以及用于培养基制备的目标微孔板（MTP）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：配制储备液移液操作设置的详细截图汇总。（A）Fe 储备液移液的未展开指令。工作台上的源实验耗材及其源孔位由读取框和相应深孔板的红色列标记。目标耗材及目标孔位由目标培养MTP上的蓝色框及蓝色孔标记。（B）此步骤中移液体积分配的详细示例视图（Fe 储备液）。目标孔数量从移液列表中读取，该列表共48行。所有目标孔的Fe储备液分配体积位于移液列表的第4列。注意，移液列表中的第一列为标识符，而非待转移的体积值，参见图 2。（C）目标孔编号的详细说明。移液列表中第#1行所填写的体积将被移液至标记为#1的孔，依此类推。孔#01、#08、#41和#48分别对应于字母数字编码的A01、A08、F01和F08，该编码也直接印制在培养MTP上。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：第一轮迭代的详细结果。（A）基于第一轮迭代实验数据的克里金插值。红点表示数据集。为便于比较，三种插值曲面叠加显示于同一图表中（深蓝色：0 倍参考值，格纹：1 倍参考值，浅蓝色：2 倍参考值）。该结果的另一种表示方式可参见其他文献¹⁵。（B）基于第一轮（红点）和第二轮（黄色方块）实验数据的克里金插值。本图所示部分数据此前已发表¹⁵。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：迭代收集的优化结果示意图。（A）最终Kriging模型预测结果。（B）基于KriKit提供的统计z检验，对最优区域（红色）进行统计识别。方框表示实验的迭代设计与执行的连续步骤。本图所示部分数据此前已发表¹⁵。请点击此处查看该图的放大版本。

组分	标准化系数平均值
Fe2+	-0.08
Mn2+	-0.05
Zn2+	-0.21
Cu2+	-0.21
NH4+	-2.04
Ni2+	-0.11
Co2+	-0.10
MoO42-	0.03
BO33-	0.06
Ca2+	1.00
Mg2+	0.45

表1：敏感性分析结果。 系数值表示当各培养基组分浓度从中心值增加到最大值时的平均效应。对于最优实验设计（如标准文献中所述并在此使用），标准差直接代表由于重复参考实验而产生的实验变异。系数值通过最大值（Ca²⁺组分的0.0422）进行了归一化处理。归一化和绝对系数标准差分别为0.54和0.0226。

组分	标准化系数平均值
Fe2+	-1.00
Mn2+	1.00
Zn2+	-3.48
Cu2+	-0.52
NH4+	-15.95
Ni2+	0.69
Co2+	-0.51
MoO42-	-0.45
BO33-	-1.11

表2：最终敏感性分析结果。 系数值表示当各培养基组分浓度从其中心值增加到最大值时的平均效应。由于采用了最优实验设计，标准偏差仅依赖于使用优化培养基组成时的实验变异。与使用参考培养基相比，实验变异略有增加。系数值通过最大值（组分Mn²⁺的0.0106）进行归一化处理。归一化系数和绝对系数的标准偏差分别为3.63和0.0385。

讨论

该方案的通用性使其可进行多种调整， 例如，用于研究其他微生物表达宿主^{9,47,48,49,50,51}，或优化目标蛋白的其他特性，如糖基化模式或二硫键。该方案可能还需根据实验室现有设备进行调整。采用微孔板反应器（MBR）系统可提高实验通量，从而显著节省时间。然而，在以MBR系统替代完全自动化且可控的生物反应器时，必须考虑实验结果的可放大性。^8,37,52,53采用 DOE 方法和数学建模有助于针对研究目标最大化测量数据的信息含量⁵⁴ 通过高效的实验设计和基于模型的数据解释¹⁵.

对方法的修改
除了本研究中使用的多功能且可扩展的机器人液体处理系统外，还应指出，目前市面上有多种体积较小的液体处理系统，能够执行此类任务，并可放置于层流工作台内。若无自动化移液系统，也可使用单通道和/或多通道移液器通过手动移液的方式实现根据实验设计（DOE）方案配置的不同培养基组合。由于手动操作更容易出错，且需要长时间高度集中注意力，因此建议减少所配置的不同培养基组合的数量。

根据所采用的MBR系统的功能，相应的培养方案会有所不同。例如，若无法在线监测生物量的形成，则可在生长实验结束后测定生物量浓度。结合MBR系统中常见的pH值和溶解氧的在线监测，可准确判断生长饱和状态。原则上，生长实验也可仅在摇床培养箱中的MTP板上进行，无需使用MBR系统。在此情况下，必须确保适当的培养条件：（1）通过采用具有合适几何形状的MTP板，并结合适当的摇床频率和摇动直径，可避免氧限制性培养， 例如，使用96孔或24孔深孔板，分别在3 mm振幅下以1,000 rpm或25 mm振幅下以250 rpm操作。重要的是，可达到的最大氧传质速率越低，主要碳源的浓度应越低。如上所述，在本研究中，采用10 g/L葡萄糖浓度适用于防止所用培养条件下出现氧限制；（2）为进行生物量和产物定量，对MTP培养物的取样应尽量减少。每次将MTP从摇床培养箱中取出时，氧传质会立即中断，可能导致不利的培养条件；（3）作者认为，不建议将MTP读板仪用作培养装置，因为这些设备并非为此目的而设计。例如，其振荡机构仅用于在添加试剂后偶尔混匀微孔板，因此通常缺乏长时间连续振荡（持续数天）所需的耐用性。此外，此类读板仪无法提供微生物培养所需的足够功率输入。在短时间内进行光密度检测需要停止振荡，导致反复出现氧限制阶段。此外，长期培养过程中此类系统中的蒸发作用将扭曲实验结果。关于将MTP用于微生物培养这一出人意料复杂的课题，更多细节请参见所引文献。^{22,23,24,25,26} 以及其中引用的参考文献。

进一步考虑
为了加快迭代优化步骤，建议仔细选择用于产物定量的分析方法。应优先选择快速且简单的方法，即使以牺牲精确性和准确性为代价，因为迭代实验设计策略能够容忍实验中的不准确性。然而，最终结果必须通过足够精确和准确但可能更复杂的产物定量方法进行验证。通常情况下，在研究初期对研究流程进行仔细评估和决策需要投入精力，但在建立常规方法后，长期来看将获得回报。

强烈建议定义一个参考实验，用于在优化过程中与所有其他实验进行比较。即，通过将所用培养基组分浓度以及测量的输出值除以参考值来进行归一化处理。这样，每个施加的和测量的数值均可被解释为参考值的 x 倍。为考虑不同培养板之间的差异，在每块板上均进行五次参考实验，归一化时采用其测量结果的平均值。

通常无法保证所开发的培养基对其他菌株也是最优的。然而，改良后的培养基很可能也适用于遗传差异较小的表达菌株的培养，例如，在通过诱变研究获得的单个氨基酸替换的酶变体生产中（尽管已有报道指出，即使是单点突变也可能影响细胞代谢和异源表达性能^55,56）。在这种情况下，本文所述方案可作为第一步，随后可结合高通量表达筛选方案⁵⁷。若该方案用于培养基开发并进一步放大至补料分批培养，则应在相应的生物工艺条件下验证优化后的培养基，因为在微尺度下进行的克隆筛选实验表明，不同的补料策略和培养基条件下，表现最优的克隆可能不同^52,58。此外，所引入的KriKit³⁶总体上可促进整体生物工艺的优化。最近，该工具的功能已扩展至支持多目标优化⁴⁰，这对于同时优化上游和下游工艺具有重要意义^59,60。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BioLector	m2p-labs	G-BL-100
花板	m2p-labs	MTP-48-BOH	用于在 BioLector 设备中培养
密封箔	m2p-labs	F-GP-10	花板无菌密封
MATLAB	Mathworks	2016b
KriKit	Forschungszentrum Jülich	n/a	免费提供，需要安装
MATLAB Janus 移液工作站	Perkin Elmer	n/a	包括"WinPrep"软件安装
12 柱深孔微孔板	E&K Scientific	EK-2034	中等储备溶液
96 孔微孔板，透明，F 底	Greiner	655101	用于 Bradford 蛋白测定
&微量;透明 96 孔微孔板，黑色主体，透明 F 底	Greiner	655087	用于无细胞上清液中的荧光测量
移液器研究 plus 多通道移液器	Eppendorf	n/a	便于使用微孔板
TruPAG 手动处理液体 预制凝胶	Sigma	PCG2002	用于无细胞上清体的 SDS-Page 分析
Bradford 试剂	Sigma	B6916
C. 谷氨酸pCGPhoDBs-GFP	n/a	/a	携带 pEKEx2 质粒，融合 GFP 基因和来自枯草芽孢杆菌的 PhoD 信号肽作为表达插入片段。质粒提供卡那霉素抗性。由 Meissner 等人描述和发布 Appl Microbiol Biotechnol 76 （3）， 633–42 （2007）