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方法文章

通过CRISPR/Cas9复合物原核显微注射制备基因工程金黄地鼠 基因编辑，CRISPR/Cas9，原核注射，金黄地鼠，转基因动物，基因敲入，基因敲除，模式生物，生殖技术，胚胎操作

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DOI：

10.3791/56263

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2018年1月9日

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1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah State University, 2National Centre for International Research in Cell and Gene Therapy, Sino-British Research Centre, School of Basic Medical Sciences, Zhengzhou University, 3Department of Animal Science Division of Applied Life Science (BK21 Plus), Gyeongsang National University, 4Institute of Agriculture and Life Science, Gyeongsang National University, 5Centre for Molecular Oncology, Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

将成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白9核酸酶（CRISPR/Cas9）系统通过原核显微注射导入，是制备基因工程改造的金黄地鼠的一种高效方法。本文中，我们详细描述了利用CRISPR/Cas9系统制备基因敲除地鼠的原核显微注射技术流程。

摘要

原核（PN）显微注射技术最初在小鼠中建立，用于将外源遗传物质导入单细胞期胚胎的原核中。所导入的遗传物质可能整合至胚胎基因组中，经将注射后的胚胎移植至代孕母体后，可产生携带外源遗传信息的转基因动物。继在小鼠中取得成功后，PN注射技术已成功应用于多种其他动物物种。近年来，PN注射还被成功用于递送具有基因编辑功能的试剂，例如CRISPR/Cas9系统，以在多种实验动物和家畜物种中实现位点特异性的遗传修饰。除了需掌握通过PN注射制备基因修饰动物所需的特殊显微注射技术外，研究人员还必须了解目标物种的生殖生理学特征与行为习性，因为不同物种均存在各自独特的技术挑战。例如，金黄地鼠胚胎具有特殊的操作要求 体外 因此，直到我们课题组近期取得突破之前，该物种尚无法实现原核显微注射技术。通过我们针对该物种优化改良的原核注射方案，已成功制备出多种基因敲除（KO）和基因敲入（KI）的叙利亚仓鼠模型，并已成功用于模拟人类疾病。本文详细描述了将CRISPR/Cas9复合物递送至仓鼠受精卵的原核注射操作流程、胚胎处理条件、胚胎移植步骤以及培育基因编辑仓鼠所需的饲养管理措施。

引言

金黄地鼠（Mesocricetus auratus）是生物医学研究中最常用的啮齿类动物之一。根据美国农业部的数据，2015年美国共使用了约10万只地鼠，占《动物福利法》所涵盖物种实验动物使用总量的13%（http://www.aphis.usda.gov；访问于2017年3月10日）。

在多种人类疾病的研究中，仓鼠相较于其他啮齿类动物具有若干优势。例如，N-亚硝基双(2-氧代丙基)胺（BOP）诱导的仓鼠胰腺导管腺癌的组织病理学特征与人类胰腺肿瘤相似，而BOP处理主要在大鼠中诱导甲状腺肿瘤，在小鼠中诱导肺和肝肿瘤1。由于仓鼠是唯一被发现能够支持腺病毒复制的小型啮齿类动物，因此它们也是测试基于腺病毒的溶瘤载体和抗腺病毒药物的首选模型2,3,4。另一个仓鼠模型优于小鼠和大鼠的例子是高脂血症的研究。人类和仓鼠在脂质代谢通路方面表现出高度相似性，且两个物种均携带编码胆固醇酯转移蛋白（CETP）的基因，该蛋白在脂质代谢中起核心作用，而小鼠和大鼠则缺乏CETP5。此外，仓鼠在感染埃博拉病毒后所表现出的出血性疾病更接近于人类的临床表现6。仓鼠也是研究动脉粥样硬化7、口腔癌8和炎症性肌病9的首选模型。最近的研究还表明，仓鼠对安第斯病毒（Andes virus）感染高度易感，并可发展为类似汉坦病毒肺综合征的疾病，从而成为目前唯一的安第斯病毒感染啮齿类动物模型10。

为解决在缺乏可靠小型啮齿类动物模型的人类疾病研究中对新型遗传学动物模型的迫切需求，我们近期成功将CRISPR/Cas9系统应用于仓鼠，并建立了多个基因工程改造的仓鼠品系11仓鼠合子对环境条件极为敏感，因此在其他物种中开发的原核显微注射方案并不适用。为此，我们建立了一种适用于仓鼠的原核注射方案，以满足仓鼠胚胎操作的特殊需求 体外在此，我们描述了使用CRISPR/Cas9系统进行原核显微注射的详细步骤，以及从单链引导RNA（sgRNA）的制备到将注射后的胚胎移植至受体雌性小鼠体内的完整操作流程。

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方案

本方案中所述操作程序已获得犹他州立大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准（IACUC方案编号：2484）。本方案所使用的仓鼠为成年LVG品系金黄地鼠（6至10周龄）。所有仓鼠均饲养于犹他州立大学生物创新中心的动物实验设施内。饲养环境温度设定为23 °C，湿度设定为40 - 50%，光照周期为14小时光照：10小时黑暗（14L:10D）。在可能的情况下，胚胎操作和手术程序均应采用无菌技术进行。

1. sgRNA 和 Cas9/sgRNA 核糖核蛋白（RNP）的制备

  1. 按照以下步骤合成sgRNA 体外 转录程序参见合成试剂盒说明书材料表，补充文件1).
  2. 组装核糖核蛋白时，将2 µg Cas9与1 µg sgRNA混合，室温孵育10–15分钟。用于原核显微注射时，用10 mM TE缓冲液（无RNase）配制工作液，其中Cas9浓度为100 ng/µL，sgRNA浓度为50 ng/µL。 材料表).

2. 输精管结扎术准备

注意：雄性仓鼠应在6至8周龄时进行输精管结扎术。手术应于首次交配前10至14天完成。通过与生育力正常的雌性交配后未产生妊娠来确认不育。输精管结扎后的雄性通常可使用一年，之后其性活动能力会逐渐下降。

  1. 通过腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮/赛拉嗪进行麻醉，剂量为氯胺酮 40 mg/kg 和赛拉嗪 10 mg/kg。通过脚掌反射（脚趾夹捏）消失确认麻醉效果。
  2. 将已镇静的仓鼠仰卧置于干燥的纸巾上。使用70%酒精和聚维酮碘溶液交替进行三轮消毒处理，清洗腹部区域。
  3. 用手术剪在包皮前1.5 cm处沿中线做一垂直切口，并向两侧各延伸1 cm（图1a）。切开皮肤、皮下组织及白线，以进入腹膜腔（图1b）。
  4. 轻压阴囊尾侧部位，使睾丸和脂肪组织挤出。用镊子轻轻夹住输精管，并用另一把镊子小心分离输精管周围的血管（图1c）。
  5. 用镊子夹住输精管形成一个环状结构。将另一把镊子的尖端在火焰上加热至发红，然后用其切除输精管环。将脂肪组织和睾丸推回腹腔内。用相同方法切除对侧输精管。
  6. 先缝合肌肉层，再缝合皮肤。将动物置于笼中温暖垫上30分钟，直至其恢复意识。观察动物直至其恢复正常活动。

3. 供体/受体仓鼠准备时间表

  1. 监测并记录动情周期。
    注意：雌性仓鼠具有稳定的4天动情周期，产后立即恢复。动情周期第1天的雌性可通过其不透明、淡黄色且黏稠的阴道分泌物进行识别（图2a）。动情周期第4天的雌性则可通过透明且黏稠的黏液进行识别（图2b）。
  2. 对供体仓鼠进行超数排卵：在性成熟雌性（>6周龄）动情周期的第1天，于上午9至12点期间，通过腹腔注射孕马血清促性腺激素（PMSG；用PBS溶解配制成50 IU/mL）进行超排处理（表1）。
    注意：PMSG用于诱导超数排卵，但不能用于动情周期的同步化。
  3. 注射PMSG后80至84小时（第4天，下午6至8点），将雌鼠与雄鼠合笼交配。由于仓鼠交配后不会形成阴栓，因此需通过直接观察交配行为来确认交配是否成功。
  4. 通过将性成熟雌性在动情周期第4天与输精管结扎的雄鼠交配，制备假孕雌鼠。供体与受体雌鼠的处理时间安排见表2。
    注意：真正怀孕的雌鼠也可用作受体，i.e.，毛色与金黄色不同的雌鼠与同色可育雄鼠交配。通过胚胎移植获得的仔鼠可根据毛色加以区分。使用真正怀孕雌鼠作为受体的潜在优势在于，其体内自然产生的胚胎有助于维持妊娠，并促进原核显微注射胚胎的着床；但潜在缺点是，原核显微注射的胚胎需与体内自然产生的胚胎竞争着床位置。

4. 合子分离

  1. 按照 McKiernan 和 Bavister 之前所述的方法12准备培养基（HECM-9；配方见补充材料2）。
  2. 在原核显微注射前一天，用 HECM-9 在 35 mm 培养皿的盖子中制备受精卵操作培养液滴（每滴 25 µL）和原核注射液滴（100 µL），然后用矿物油覆盖液滴。将培养皿置于培养箱中平衡过夜，条件为：37.5 °C、10% CO2、5% O2、85% N2 和 100% 湿度。
  3. 在计划进行原核显微注射的当天，用 HECM-9 制备胚胎冲洗培养皿（每只供体仓鼠使用一个培养皿），并将所有培养皿存放于培养箱中直至使用。
  4. 使用 CO2 对超排卵的仓鼠实施安乐死。
  5. 输卵管分离
    1. 将已安乐死的雌性仓鼠仰卧放置于手术巾或纸巾上，用 70% 乙醇喷雾处理腹部区域。
    2. 牢固夹住腹中线处的皮肤和腹肌层并做切口，切开腹膜以暴露腹腔器官。
    3. 用精细镊子夹住一侧子宫角，将组织从腹腔中拉出。分离子宫与子宫系膜及脂肪组织。在输卵管与卵巢之间做一剪切，并在输卵管与子宫连接处附近做第二处剪切（包含一小段子宫）。将两条输卵管置于同一个冲洗培养皿中。
  6. 冲洗并收集受精卵
    1. 在解剖显微镜下，用 #5 Dumont 镊子夹住子宫角一侧，从漏斗端将自制针头（图3）插入输卵管管腔，并用 300–400 µL 的 HECM-9 培养基冲洗输卵管。
    2. 立即收集受精卵，并在操作培养皿中用 HECM-9 培养基清洗两次。在此发育阶段，所有受精卵应已完全去除卵丘细胞。
    3. 收集后立即将受精卵放入培养箱（37.5 °C、10% CO2、5% O2、85% N2 和 100% 湿度）中，以尽量减少光照暴露。

5. PN 注射

  1. 将Cas9/sgRNA核糖核蛋白复合物（RNP）置于冰上解冻，并在整个原核显微注射过程中保持该复合物处于冰上。
  2. 在注射实验开始前立即向注射针中装载Cas9/sgRNA RNP溶液。将注射针后端插入含有Cas9/sgRNA RNP溶液的离心管中，利用毛细作用使溶液充满注射针。
  3. 准备注射培养皿和注射针。向持卵针的储液管中加入矿物油，加至距离持卵针弯曲处约3 mm的位置。将持卵针安装到显微操作仪上，使其针尖与培养皿底部保持水平，然后通过负压吸取使针尖充满培养液。将注射针设置为与持卵针方向相反、呈10–15°夹角。
  4. 原核显微注射
    1. 选取一个受精卵，并使用持卵针施加轻微负压固定。理想情况下，雄性和雌性原核应位于同一焦平面，并与持卵针平行排列。
    2. 用注射针穿透透明带并刺入雄性原核（通常位于3点钟方向）。
    3. 一旦原核出现膨胀，应迅速撤出注射针，以防止原核黏附于针尖并避免对原核造成损伤。

6. 将受精卵移植到假孕仓鼠体内

  1. 将一只假孕仓鼠（麻醉方法同上文输精管切除术部分所述）进行麻醉，并使其仰卧于手术巾或干燥的纸巾上。
  2. 在动物眼睛上涂抹眼用润滑剂以防止角膜干燥，并用布或纸巾覆盖头部以保护眼睛免受光线刺激。剃除身体两侧各约4 cm × 4 cm的皮肤区域，进行术区准备，随后依次使用聚维酮碘溶液擦洗3次，再用70%乙醇擦洗3次 。在动物背部两侧，于最后肋骨后方2 cm处做一条2 cm长的垂直切口（如图4a、4b所示）。
  3. 用镊子夹住脂肪垫并轻轻牵拉，直至可见输卵管和子宫。用止血钳夹住脂肪垫，并将其向背侧翻转至脊柱上方（图4c）。调整生殖道位置，使子宫管能够用30号针头穿刺，以便进行胚胎移植（图4d）。
  4. 在新的培养皿中用HECM-9洗涤已注射的受精卵。使用新的玻璃移液管（直径：约150–200 µm）吸取10–15个受精卵，将受精卵排列成串珠状，后接数个气泡。将移液管插入第6.3步中已穿刺打开的输卵管，轻轻吹入移液管，将受精卵转移至输卵管内。持续吹入，直至第一个气泡进入输卵管管腔（图4e）。
  5. 松开脂肪垫，将其复位回腹腔。采用相同操作，将大致相同数量（10–15个）的已注射胚胎移植至另一侧输卵管管腔。
  6. 分两层缝合肌肉层和皮肤。皮下注射布托啡诺盐酸盐（0.5 mg/kg）作为术后镇痛。将仓鼠放回笼中，并将笼子置于加热垫上以助恢复。待动物完全从麻醉中恢复后，将笼子移回动物房。术后6小时再次给予镇痛药。

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结果

所述方案在制备基因编辑仓鼠时的效率取决于以下两个关键步骤的结果：受体雌鼠的活产率以及具有预期基因修饰的活产仔鼠数量。活产率直接取决于胚胎质量以及执行原核显微注射和胚胎移植操作人员的技术水平。为确保操作后胚胎的发育潜能不受影响，在操作过程中必须格外谨慎 体外 对仓鼠胚胎的操作。使用假孕受体雌鼠，我们通常可达到60–80%的活产率。 表3 说明活产率来自 RAG1 基因敲除实验（使用假孕雌性小鼠）以及 STAT2 敲除实验（使用真正怀孕的黑色雌性小鼠；此种情况下的活产率计算为产下金色仔鼠的窝数所占的百分比）。

通过原核显微注射胚胎获得的基因编辑仔鼠比例取决于sgRNA诱导插入缺失（indel）的效率以及Cas9/sgRNA核糖核蛋白成功注射入原核的情况。我们发现，不同基因靶点的sgRNA效率存在差异（未发表观察结果）。如表3所示，针对<...

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讨论

为了更好地利用金黄地鼠作为人类疾病模型的潜力，我们开发了一种原核显微注射（PN注射）方案，用于递送CRISPR/Cas9复合物以靶向地鼠基因组。该PN注射方案优化了多个关键变量，包括胚胎培养基、温度以及光照波长。13此外，进行仓鼠基因靶向研究时，还需遵循若干针对仓鼠特有的动物操作规程。例如，性成熟的雌性仓鼠具有稳定的4天动情周期，无法通过外源性激素进行同步化例如 PMSG）。因此，准确追踪每只雌性动物的动情周期对于超数排卵和假孕准备都至关重要。如果超数排卵成功，每只雌性可产生30至60枚受精卵。为实现成功的超数排卵，必须考虑物种特异性的脂肪分布情况。雌性仓鼠，尤其是12周龄以上的个体，往往具有较多的腹部脂肪，因此在进行激素注射时，必须正确放置注射针头，以充分穿透脂肪层。我们发现，将针头刺入腹腔深度约一半时，可达到适宜的激素递送距离。我们总结了PN注射、仓鼠操作及饲养管理中的特殊要求 表 4.

进行原核注射时，每轮注射转移至注射皿中的胚胎数量需通过实验确定，以避免注射时间过长。胚胎在皿...

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披露

ZW 在 Auratus Bio, LLC. 拥有财务权益，这是一家专注于为生物医学研究和农业应用开发基因工程动物的生物技术公司。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID）的资助，项目编号为1R41OD021979（资助对象：ZW），以及韩国下一代BioGreen 21计划的研究资助，项目编号PJ01107704（资助对象：ZW）和PJ01107703（资助对象：IK）。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院或BioGreen 21计划的官方观点。我们感谢Nikolas Robl博士对稿件的编辑工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Cas9InvitrogenB256401 μg/μL (~6.1 μM)
GeneArtTM Precision Synthesis KitInvitrogenA29377用于sgRNA合成
人血清白蛋白SigmaA1653用于培养基配制
IlluminatorNikonNI-150用于胚胎移植
培养箱New BrunswickGalaxy 14S用于胚胎培养
显微操作仪NarishigePB-7用于制备注射针
显微镜NikonECLIPSE Ti-S用于显微注射
显微镜invitrogenSMZ745T用于胚胎移植
矿物油SigmaM1840避光保存
PMSGSigmaG4877-2000IU用于超数排卵

参考文献

  1. Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
  2. Wold, W. S., Toth, K. Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds. Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).
  3. Thomas, M. A., et al. Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors. Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).
  4. Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors. Methods Mol Med. , 169-183 (2007).
  5. Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).
  6. Ebihara, H., et al. A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever. J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).
  7. Jove, M., et al. Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters. Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).
  8. Vairaktaris, E., et al. The hamster model of sequential oral oncogenesis. Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).
  9. Paciello, O., et al. Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies. Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).
  10. Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome. Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).
  11. Fan, Z., et al. Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 9 (10), e109755(2014).
  12. McKiernan, S. H., Bavister, B. D. Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).
  13. Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).

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