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方法文章

改进的建立方法 体外 基于猪脑内皮细胞的血脑屏障模型

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DOI：

10.3791/56277

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2017年9月24日

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1Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Institute of Pharmaceutical Science, King's College London, 3HICoE Centre for Drug Research, Universiti Sains Malaysia

本文内容

摘要

本方案的目的是提供一种优化的流程，用于建立一个 体外 基于原代猪脑微血管内皮细胞（pBECs）的血脑屏障（BBB）模型。该模型具有高度可重复性和紧密性，适用于药物发现中的转运及细胞内 trafficking 研究。

摘要

本方案旨在提供一种优化的纯化与培养原代脑微血管内皮细胞（pBECs）的方法，并建立 体外 基于猪脑微血管内皮细胞（pBECs）的单层培养（MC）、添加星形胶质细胞条件培养基（ACM）的单层培养，以及与猪或大鼠来源星形胶质细胞非接触共培养（NCC）的血脑屏障（BBB）模型。pBECs 从 5–6 个月龄家猪脑皮层毛细血管片段中分离并培养获得。通过仔细去除脑膜、分离并匀浆灰质、过滤、酶消化和离心等步骤对这些片段进行纯化。为进一步去除污染细胞，毛细血管片段在含嘌呤霉素的培养基中进行培养。当 pBECs 从毛细血管片段生长至 60–95% 汇合时，将其传代至可透膜滤插件中，并建立上述模型。为增强 pBECs 的屏障紧密性和 BBB 特征性表型，细胞接受以下分化因子处理：膜通透性 8-CPT-cAMP（简称为 cAMP）、氢化可的松以及磷酸二酯酶抑制剂 RO-20-1724（RO）。该过程持续 9–11 天；建立 NCC 模型时，星形胶质细胞需提前培养 2–8 周。遵循本方案所述操作步骤，可成功构建具有高度限制性旁细胞通透性的内皮细胞层，其中 NCC 模型的平均跨内皮电阻（TEER）为 1249 ± 80 Ω cm2，以及细胞旁通透性（P应用程序) 对于荧光黄的 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 cm sec-1 （均值 ± 标准误，n=55）。对该 pBEC 表型的进一步评估显示，紧密连接蛋白 claudin 5、ZO-1、occludin 以及黏附连接蛋白 p120 catenin 表达良好。该模型可用于多种健康与疾病状态下血脑屏障的研究，且由于其细胞旁通透性高度受限，适用于转运及细胞内 trafficking 研究。

引言

血脑屏障的细胞结构与功能

在循环系统与中枢神经系统（CNS）的交界处，血脑屏障（BBB）作为调控CNS微环境稳态的关键部位，对神经系统的正常功能和保护至关重要。BBB的作用部位是衬于血管管腔的内皮细胞。在脑毛细血管中，内皮细胞形成复杂的细胞间紧密连接，并高度极性地表达特定的流入和流出转运蛋白，从而确保血液与大脑之间分子转运的高度特异性1。紧密连接复合体的结构成分包括occludin和claudin家族蛋白、zonula occludens（ZO）蛋白、cingulin以及相关的连接黏附分子（JAMs）。其中，claudin 5在细胞旁路连接限制中尤为重要。这种特征性BBB内皮细胞表型的诱导和维持涉及与周围细胞（包括周细胞、星形胶质细胞、神经元以及基底膜）的动态相互作用，这些细胞与脑内皮细胞共同构成神经血管单元（NVU）2,3。这些相互作用所涉及的机制尚未完全阐明，但包括细胞间化学信号的交换，可在短期内调节BBB通透性，并诱导长期的BBB特性4。尤其是星形胶质细胞，已知其有助于脑内皮细胞表型的形成，并可产生多种调节因子，如胶质源性神经营养因子（影响细胞内cAMP水平）5、碱性成纤维细胞生长因子6、氢化可的松7和转化生长因子β（TGF-β）8。然而，TGF-β的作用仍存在争议9。

从 在体实验 至 体外 血脑屏障

体内研究持续为血脑屏障（BBB）生物学提供重要信息。然而，细胞培养模型能够提供进一步的见解，并作为理解健康与疾病状态下血脑屏障分子和功能细节的有力工具。尽管在体外模型中完全重现血脑屏障中各类细胞及其组分之间的复杂相互作用仍具挑战性，但自首次纯化脑微血管内皮细胞并将其用于单层培养以来10,11,12，血脑屏障细胞培养模型的纯化方法和培养条件已得到广泛优化，使其更接近于体内屏障的真实状态。目前常用的体外血脑屏障模型主要包括来源于啮齿类、猪和牛的原代细胞，以及永生化细胞系。每种模型各有优缺点。在模型比较与选择时，通常采用一系列验证标志物，如血脑屏障相关酶、转运蛋白、受体及结构蛋白的表达情况，以系统评估当前已建立的各类模型1。

实验方案的目的

血脑屏障（BBB）的一个重要特征是屏障的紧密性以及高跨内皮电阻（TEER），然而目前许多可用的模型并不能很好地反映体内（in vivo）的实际水平。本实验方案综合了多个实验室在模型开发与优化方面的贡献，旨在介绍一种基于原代脑微血管内皮细胞（pBECs）在微孔培养小室（MC）中、无论是否使用星形胶质细胞条件培养基（ACM），或在与大鼠或猪源性原代星形胶质细胞共培养（NCC）条件下，建立高TEER体外（in vitro）血脑屏障模型的方法。该方法所采用的操作步骤及模型建立过程包括清除污染细胞、促进pBECs向血脑屏障表型分化的优化措施。本研究成功建立了可靠性高、TEER值高、旁细胞通透性低，并能良好功能性表达关键紧密连接蛋白、转运蛋白和受体的体外模型。然而，由于星形胶质细胞是影响脑内皮细胞表型的重要因素，三种不同的培养条件实际上代表了三种不同表型的脑内皮细胞。其中，NCC模型特别适用于药物发现、转运研究和细胞内运输机制等特定专一性机制的研究，也适用于在需要最大限度表达血脑屏障特征的细胞间相互作用研究。

方案的起源与历史

此处描述的pBEC模型主要基于由Dr. Louise Morgan及其同事在卫材实验室（伦敦）开发的猪模型，该模型又源于一种早期成功的牛脑微血管内皮细胞模型。13最初的细胞制备方法采用尼龙滤网进行两步过滤以捕获微血管，随后通过传代培养步骤提高纯度。在该方法早期开发阶段，通过在添加了ACM等补充成分的培养基中培养，可获得最佳的血脑屏障表型和屏障紧密性。此后，该方法由英国曼彻斯特R. Skinner在N. Rothwell教授的实验室中进一步改进。14,15该方法由伦敦国王学院（KCL）的Abbott实验室采用，Patabendige通过避免使用星形胶质细胞或星形胶质细胞条件培养基（ACM），并利用嘌呤霉素清除周细胞等污染细胞，显著简化了该模型的制备过程。早期论文证实，MC模型保留了多种重要的 体内 血脑屏障（BBB），包括有效的紧密连接、膜转运系统和受体介导的转胞吞作用16,17,18,19,20随后，S. Yusof 再次测试了星形胶质细胞共培养，发现其显著提高了跨上皮电阻（TEER），因此该方案目前是艾伯特实验室的首选变体21该模型现已成功转移至丹麦奥胡斯的M. Nielsen实验室，并进行了进一步改进（本方案），包括简化了灰质提取步骤，仅使用一次网格过滤步骤，以及将胶原蛋白和纤连蛋白结合用于单一滤膜包被步骤。所采用的猪星形胶质细胞分离方法（本方案）基于奥尔堡T. Moos实验室开发的方案，由Thomsen等人描述 等22伦敦和奥胡斯构建的模型在TEER及其他特性方面相似，这表明该模型可在不同实验室之间轻松转移，并对实验步骤的仔细观察与合理优化具有良好的响应性。事实上，S. Yusof目前已在热带国家（马来西亚）成功建立了MC模型。23，该步骤涉及根据当地条件和组织来源进行进一步调整。

相较于替代方法和现有模型的优势

与牛源和啮齿类来源的脑微血管内皮细胞相比，pBECs 具有更低的丢失率优势 体内 分离后血脑屏障表型24此外，即使在MC中培养（800 Ω·cm²），pBECs也能形成相对紧密的内皮屏障。2)16 与bEND.5和bEND.3等细胞系单层细胞通常报道的水平相比（50 Ω·cm²）2)25,26,27，cEND（300-800 Ω cm2)28,29,30，以及 cerebEND（500 Ω cm2)29,31,32，以及小鼠原代脑微血管内皮细胞（100-300 Ω·cm）2)33,34,35,36 和大鼠（100-300 Ω cm）2)37,38然而，跨内皮电阻（TEER）的数值已被证明依赖于细胞纯化和培养的操作流程。在大多数情况下，添加星形胶质细胞条件培养基（ACM）或与星形胶质细胞共培养，均可对内皮细胞产生促分化作用，并增强内皮层的紧密性1然而，尽管在优化培养条件方面做出了努力，只有基于牛源的模型显示出与基于猪源的模型相当的TEER值（平均值为800 Ω·cm²）2 在MC中，高达2500 Ω·cm2 在星形胶质细胞共培养中13,39,40,41,42,43,44,45由于基于原代牛脑微血管内皮细胞的模型在不同实验室之间及同一实验室内部均表现出较大差异14,45,46,47,48，可重复性可能是一个问题。在本研究报道的pBEC模型中，参与实验室在实验室内部及实验室之间均获得了高度相似且变异度低的TEER值和细胞旁通透性数据。因此，其他实验室应能够利用本文所述方法建立一个变异度低且可靠的模型。除了形成紧密的内皮层外，既往研究已通过紧密连接蛋白、功能性血脑屏障转运体、受体和酶的表达，对pBEC模型进行了验证，并证实其适用于多种研究15,16,17,19,20,22,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59此外，pBECs共培养的未发表转录组数据显示出预期的血脑屏障转运蛋白和受体表达谱（未发表结果，Nielsen） 等).

基于猪的血脑屏障模型具有另一优势，即猪的基因组、解剖结构、生理特征及疾病进展与人类生物学的相似程度高于其他已建立的模型60，这些特性对制药行业具有重要意义。由于猪脑是肉类工业的常见副产品，因此可作为脑微血管内皮细胞的易得来源，既能减少实验所需动物数量，又能从单个猪脑中获得较高的细胞纯化得率。尽管原代细胞的分离与培养过程较为耗时，且在模型建立过程中需要专业技术以实现标准化，但原代细胞能够构建最可靠的血脑屏障模型。永生化细胞系则无法替代原代细胞，因其在屏障紧密性、转运蛋白表达谱以及微环境调控等关键特性上无法真实反映体内实验结果。 体内61,62. 体外 模型具有活细胞成像分辨率更高的优势，可通过高倍率、光学质量更优的物镜近距离接近待检测或观察的细胞，从而实现对细胞内过程的可视化观察63对于在活体动物中使用双光子显微镜的情况则并非如此。此外， 体外 模型能够转染细胞，从而实现对标记蛋白的可视化及其转运过程的研究。

模型的应用

血脑屏障的功能并非固定不变，而是在生理和病理条件下均可发生动态调节。在许多神经系统疾病中，包括神经退行性疾病、炎症性和感染性疾病，均可观察到血脑屏障的破坏及其通透性增加。64,65,66,67为了减轻和防止疾病进展及其后续损伤，识别和表征调控血脑屏障的分子机制具有重要意义。在此背景下，可靠的 体外 模型在制药行业中需求量大，此外还在预测药物对中枢神经系统的血脑屏障通透性方面发挥着重要作用。任何 体外 作为通透性筛选模型，应具备限制性的细胞旁通路、符合生理现实的细胞结构，以及转运体机制的功能性表达68在先前的研究中已得到证实16,17,57，并通过此处的细胞旁通透性以及紧密连接和粘附连接蛋白的表达，本研究所提出模型满足上述所有标准，适用于正常生理和病理条件下的多种血脑屏障研究。本研究所提出纯化与培养方法的优势在于兼具简便性和可重复性，同时能够纳入星形胶质细胞的影响，从而获得稳定且可靠的高跨内皮电阻（TEER） 体外 血脑屏障模型。为此，已有研究表明，猪源性和大鼠源性星形胶质细胞在增强pBECs的血脑屏障表型方面具有相似的作用22.

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方案

猪脑取自丹麦食品工业的副产品。丹麦屠宰场受到丹麦环境与食品部的严格监督和监管。

用于星形胶质细胞分离的大鼠在当地动物饲养设施中繁殖并群体饲养，环境温度为 22 °C–23 °C，光照周期为 12 小时明/12 小时暗，在兽医监督下进行，并遵循丹麦实验动物管理法规。大鼠在牺牲前被实施安乐死，操作过程符合国际实验动物伦理使用指南（1986 年 11 月 24 日欧洲共同体理事会指令 86/609/EEC）以及丹麦相关指南。本实验未开展任何涉及动物或人体组织的 in vivo 实验。

注意：以下是描述 pBEC 主要实验方案的步骤：（步骤 1）纯化，（步骤 2）培养，以及（步骤 3）TEER 测量。对于与星形胶质细胞共培养体系（NCC）的建立，另提供一个替代方案（步骤 4），描述大鼠和猪星形胶质细胞的纯化与培养。

1. 猪脑毛细血管的纯化

  1. 采集8-10个5-6月龄家猪的脑组织（例如 从附近屠宰场获取组织样本，并在冰上运输至实验室。我们建议在动物处死后的2-3小时内开始以下纯化操作。
  2. 将脑组织置于无菌超净工作台中，放入盛有1 L PBS并置于冰上的烧杯中，轻轻冲洗。
  3. 使用精细镊子一次小心地去除一个脑组织的脑膜，并将去脑膜的脑组织转移至另一个装有置于冰上的PBS的1 L烧杯中。操作时间延长会增加去除难度。每个脑组织的处理时间应约为10–15分钟。
  4. 使用解剖刀，逐个刮取脑组织的灰质，并将分离的组织转移至培养皿（8.8 cm）中2) 中加入20 mL置于冰上的DMEM/F-12培养基。尽可能分离灰质，避免带入白质组织。初始破碎时，将灰质组织通过一支50 mL无针头注射器推挤。对所有脑组织重复此操作，并汇集收集的灰质材料。操作时间过长会增加组织去除难度。每只脑组织处理时间应控制在10–15分钟。
  5. 将分离的灰质材料与DMEM/F-12培养基按1:1比例转移至手持式组织匀浆器的研磨管中。先用松配合的研杵上下研磨8次，随后用紧配合的研杵再上下研磨8次。重复上述操作，直至所有分离的组织材料完全匀浆。将匀浆液转移至500 mL瓶中，并用DMEM/F-12培养基稀释至总体积约450 mL。
  6. 使用带滤器支架和140 µm滤网的500 mL蓝盖瓶过滤匀浆液，并通过滤器过滤组织以分离毛细血管。每50 mL匀浆液使用一个滤器，过滤后用DMEM/F-12洗涤每个滤器。
  7. 将含有毛细血管的滤膜置于培养皿中，加入含有胰蛋白酶/EDTA（2.5% 胰蛋白酶，0.1 nM EDTA 溶于 PBS）、胶原酶 CLS2（2,000 U/mL）和 DNase 1（3,400 U/mL）的消化液（DMEM/F-12 培养基）。每培养皿（8.8 cm）使用 1 个2，每3个滤网使用20 mL溶液。
  8. 将培养皿置于37 °C、180 rpm的摇床上孵育1小时，或每10分钟轻轻搅拌一次。孵育1小时后，用1 mL移液器吸取培养皿中的悬浮液，冲洗滤膜上的毛细血管。
  9. 将3个培养皿中的悬浮液分装至2个50 mL离心管中，每管加入10 mL DMEM/F-12以终止消化。
  10. 将细胞悬液在250 x g条件下离心 克， 4 °C 离心 5 分钟。吸除上清液，将每份沉淀重悬于 10 mL DMEM/F-12 中。向每管中再加入 20 mL DMEM/F-12。重复此离心步骤两次。
  11. 将离心管置于冰上冷却5分钟，然后将溶液转移至2个新的50 mL离心管中。
  12. 将细胞悬液在250 x 克， 4 °C 下离心 5 分钟，将每份沉淀重悬于 8–10 mL 冷冻液中（约每使用一个脑组织加 1 mL），冷冻液成分为含 10% DMSO 的 FBS。
  13. 将细胞悬液转移至冻存管中，每管加入1 mL。通常情况下，每只使用的大脑平均可获得1管细胞，可为12–16个插入式培养小室提供内皮细胞。将冻存管置于-80 °C冷冻盒中，冷冻至少4小时至过夜。随后，将冻存管转移至液氮罐中长期保存。
    注意：液氮温度极低，请穿戴适当的防护装备。

2. 原代pBECs的培养（8-10天）

  1. 初始培养（3-5 天）
    第 1 天
    1. 为优化 pBECs 的贴壁条件，向 T75 培养瓶中加入含有胶原蛋白 IV（终浓度 150 µg/mL）和纤连蛋白（终浓度 50 µg/mL）的 ddH2O 溶液进行包被，确保溶液覆盖整个培养表面。每个 T75 培养瓶使用 10 mL。37 °C 下孵育 2 小时。
      注意：包被可在使用前立即进行，也可提前一周完成，并在 4 °C 下用 PBS 储存。包被液不得干燥，否则将无法形成适宜的细胞贴附与生长表面。
    2. 准备 16 mL pBEC 生长培养基，其成分为 DMEM/F-12，添加 10% 血浆来源血清（PDS）、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 µg/mL）和肝素（15 U/mL）。向培养基中添加嘌呤霉素（4 µg/mL）以筛选内皮细胞。请注意，嘌呤霉素处理最多只能使用 5 天。
    3. 将配制好的培养基分装至两个 15 mL 离心管中，分别为 6 mL 和 10 mL。
    4. 从液氮中取出一个含有毛细血管的冻存管（步骤 1.13），通过 37 °C 水浴或加入 6 mL 分装液中的 750 µL 培养基进行解冻。若通过添加培养基解冻，需小心反复吹打以完成解冻并使悬液均匀。解冻后，将细胞悬液转移至 6 mL 分装培养基中。
    5. 为去除冻存液，以 250 x g、4 °C 离心 7 分钟，沉淀毛细血管片段。
    6. 小心吸除上清液，将沉淀重悬于 1–2 mL 的 10 mL 分装培养基中。重悬后，将溶液转移至 10 mL 培养基分装液中。
    7. 将毛细血管悬液转移至已包被的 T75 培养瓶中，轻轻倾斜培养瓶以确保细胞在表面均匀分布。将 T75 培养瓶置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。
      第 2 天
    8. 过夜培养后，为一个 T75 培养瓶准备含嘌呤霉素（4 µg/mL）的 10 mL pBEC 生长培养基，并更换培养基。请注意，所有施加于细胞的培养基溶液在使用前均应预热至 37 °C。
      注意：也可在接种后 4–6 小时进行换液，此时毛细血管应已贴附于培养表面。继续培养细胞直至达到 60–95% 汇合度，通常在解冻后 3–5 天内完成。切勿让细胞达到 100% 汇合度，以免发生接触抑制而阻碍细胞进一步生长。
      第 4–6 天
    9. 当达到所需汇合度时，将内皮细胞传代至可渗透膜小室（见第 2.2 节）。若第 4 天未达到所需汇合度，则进行换液。最迟在第 6 天，必须将细胞传代至可渗透膜小室。若至第 6 天仍未达到所需汇合度，则该批细胞不适合用于实验。
      注意：NCC 中星形胶质细胞的准备：建立共培养模型时，应提前一天为内皮细胞传代至小室做好准备，即对培养中的 2–8 周龄星形胶质细胞（见第 4 节）进行换液。每孔星形胶质细胞准备 1500 µL 星形胶质细胞生长培养基，其成分为低糖 DMEM，添加 10% FBS、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL），然后进行换液。
  2. 在可渗透膜小室上培养 pBECs（5 天）
    第 4–6 天
    1. 准备可渗透膜小室（12 孔板，小室表面积 1.12 cm2，孔径 0.4 µm），用 ddH2O 中的胶原蛋白 IV（500 µg/mL）和纤连蛋白（100 µg/mL）进行包被，用于接种 pBEC。每个小室使用约 300 µL，确保溶液覆盖整个生长表面。37 °C、5% CO2 条件下孵育至少 2 小时。
    2. 准备 30 mL 不含嘌呤霉素的 pBEC 生长培养基（培养基成分参见第 2.1.2 节）。
    3. 吸除 T75 培养瓶中 pBEC 培养物的培养基，用 5 mL 室温无菌 PBS 轻柔洗涤两次。
    4. 向 T75 培养瓶中加入 2 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液（PBS 中含 2.5% 胰蛋白酶和 0.1 nM EDTA），进行消化，并将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 5–7 分钟。
    5. 为使脑微血管内皮细胞脱离，用指尖轻敲 T75 培养瓶侧面，使周细胞（贴附力较强且存活下来的）保留在瓶壁表面。在显微镜下观察细胞脱落情况。当观察到约 80% 细胞脱落时，加入 5 mL 培养基终止消化。
    6. 使用 10 mL 移液器将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，以 250 x g、4 °C 离心 7 分钟，沉淀脑微血管内皮细胞。
    7. 小心吸除上清液，将沉淀重悬于 1 mL 培养基中。重悬后，再加入 2 mL 培养基，使总体积达到 3 mL。
    8. 使用细胞计数板或自动细胞计数系统手动计数细胞数量。配制细胞悬液浓度为 2.2 x 105 个细胞/mL 培养基，最终接种密度为每小室 1.1 x 105 个细胞。
    9. 移除可渗透膜小室中的包被液，向每个小室加入 500 µL 细胞悬液。其中一个小室仅加入培养基，作为跨上皮电阻（TEER）测量的“仅滤膜”对照。
    10. 以下列方式建立内皮细胞单层培养（MC）、MC 加星形胶质细胞条件培养基（ACM）或与星形胶质细胞共培养（NCC）：
      1. 对于 MC：在 12 孔板每个孔的可渗透膜小室下方加入 1500 µL pBEC 生长培养基或 ACM。将可渗透膜小室置于 37 °C、5% CO2 条件下培养 2 天。
      2. 对于 NCC：将小室转移至前一天已更换星形胶质细胞生长培养基的星形胶质细胞孔中。将可渗透膜小室置于 37 °C、5% CO2 条件下培养 2 天。
        注意：请注意三种模型底部孔中使用的培养基类型不同。
        第 6–8 天
    11. 第 2 天，更换含 pBECs 的可渗透膜小室中的培养基。每小室准备 500 µL pBEC 生长培养基，小心更换以尽量减少对细胞层的扰动。继续培养细胞两天。请注意，换液仅针对小室进行，不涉及底部孔。
  3. 使用分化因子刺激（1–2 天）
    第 8–10 天
    1. 针对不同模型，分别配制刺激培养基如下：
      1. 对于 MC：为每个小室和孔准备 500 µL 含 cAMP（250 µM）、氢化可的松（550 nM）和 RO（17.5 µM）的 pBEC 生长培养基。
        MC：额外为每个孔准备 1500 µL 含 cAMP（250 µM）、氢化可的松（550 nM）和 RO（17.5 µM）的 pBEC 生长培养基。
        MC 加 ACM：解冻 1500 µL ACM，并添加 cAMP（250 µM）、氢化可的松（550 nM）和 RO（17.5 µM）。
      2. 对于 NCC：为每个小室准备 500 µL 含 cAMP（250 µM）、氢化可的松（550 nM）和 RO（17.5 µM）的 pBEC 生长培养基。为每个星形胶质细胞孔准备 1500 µL DMEM/F-12，添加青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 µg/mL）、肝素（15 U/mL）、cAMP（250 µM）、氢化可的松（550 nM）和 RO（17.5 µM）。
    2. 针对不同模型，进行如下培养基更换：
      1. 对于 MC：小心吸除孔和小室中的培养基，向两个隔室均加入分化培养基，每小室 500 µL，每孔 1500 µL。请注意，小室任一侧的扰动均可能影响并破坏细胞层。
      2. 对于 NCC：小心吸除孔中的培养基，每孔加入 750 µL 分化培养基。小心吸除小室中的培养基，每小室加入 500 µL 分化培养基。然后向每个星形胶质细胞孔中再加入剩余的 750 µL 分化培养基。
    3. 所有模型：将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下，用分化培养基继续培养至次日。
      注意：请注意，在星形胶质细胞参与的 NCC 模型中，星形胶质细胞自此开始维持在无血清培养基中。

3. TEER 测量

  1. 在使用分化培养基刺激细胞后的第二天，通过用ddH2O冲洗测量室两次，再用70% EtOH处理5分钟，最后再用ddH2O冲洗两次，来准备用于TEER测量的组织电阻测量室系统。
  2. 向组织电阻测量室中加入4 mL DMEM/F-12，将其连接至系统，并按照以下设置校准约30分钟：R = 0，Test R = 1000，Mode = R。
  3. 通过小心地将插入式培养小室放入组织电阻测量室中进行TEER测量。对每个插入式培养小室进行三次重复测量，并计算平均Ω cm2。
    注意：在共培养模型中，预期TEER值应达到>500 Ω cm2。如果在首次测量TEER的第一天未达到合适的TEER水平，则添加新的分化因子（cAMP（250 µM）、氢化可的松（550 nM）和RO（17.5 µM）），并在次日再次测量TEER。当达到合适水平后，该模型即可用于计划中的实验。请注意，在进行实验前，细胞应至少静置3小时，以从TEER测量中恢复。刺激后，TEER值通常在刺激后24–48小时内仍保持在可接受范围内。
    注意：使用刚性STX-100C电极对的替代且更快速的方法也可在此模型中记录到较高的TEER值81。而柔性STX2电极对则提供较不可靠的读数。

4. 星形胶质细胞非接触共培养的制备：替代方法

  1. 星形胶质细胞的纯化
    1. 每使用一只大鼠脑组织，用10 mL溶于ddH2O的聚-L-赖氨酸（5 µg/mL）包被2个T75培养瓶。将培养瓶在37 °C孵育30分钟。
    2. 星形胶质细胞的分离可按如下步骤进行：
      1. 大鼠星形胶质细胞：
        1. 采用经批准的方法处死2只出生1–2天的大鼠。
        2. 从颈部向鼻部方向切开头皮，沿矢状面切开颅骨。
        3. 用弯头镊子打开颅骨，取出脑组织并放入含11 mL低糖DMEM培养基（补充10%胎牛血清和125 µg/mL硫酸庆大霉素）的15 mL离心管（管1）中。
        4. 用细头镊子小心去除脑膜，并用1 mL移液器悬浮脑组织。
      2. 猪星形胶质细胞：
        1. 取一只5–6月龄家猪的脑组织。
        2. 用细头镊子和/或手小心去除脑组织表面的脑膜。
        3. 从脑组织中收集4 g灰质，将组织块置于含1–2 mL低糖DMEM培养基（补充10%胎牛血清和125 µg/mL硫酸庆大霉素）的培养皿中。若组织块较大，可用手术刀片或镊子剪碎。
        4. 用1 mL移液器悬浮分离的组织，转移至15 mL离心管（管1），并加入低糖DMEM培养基（补充10%胎牛血清和125 µg/mL硫酸庆大霉素）至总体积为11 mL。
        5. 使用连接10 mL注射器的长针头继续匀浆组织，上下吹打3次。待大块组织沉降至管底后，从管1上层吸取7 mL液体。
        6. 将7 mL细胞悬液通过40 µm尼龙滤膜过滤至新的50 mL离心管（管2）中。
        7. 向管1中残留的脑组织加入7 mL培养基，重复步骤4.1.2.2.5–6的匀浆和过滤过程，直至管2中滤过的细胞悬液总体积约为35 mL。
    3. 移除T75培养瓶中的包被液[步骤4.1.1]。在聚-L-赖氨酸孵育后，可用5 mL PBS快速洗涤一次，以确保包被液的潜在毒性不会损伤细胞。
    4. 将分离得到的星形胶质细胞悬液等量分配并接种至T75培养瓶中。将培养瓶置于37 °C、5% CO2条件下孵育3–5天。
  2. 星形胶质细胞培养及与内皮细胞共培养的神经血管单元构建（3周）
    1. 初始培养
      1. 孵育3–5天后，小心吸除旧培养基，加入10 mL低糖DMEM培养基（补充10%胎牛血清和125 µg/mL硫酸庆大霉素）进行换液。
        注意：首次换液后，应每5天更换一次培养基。在前两周内，每次换液时需轻轻摇动培养瓶，并用PBS充分洗涤细胞，以帮助去除污染的微胶质细胞。
      2. 培养3周后，向每个T75培养瓶底部加入2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C、5% CO2条件下孵育5–7分钟进行消化。
      3. 加入5 mL培养基终止消化反应，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在250 × g、4 °C条件下离心7分钟，收集星形胶质细胞。
      4. 小心吸除上清液，用含10% DMSO的FBS冷冻液重悬细胞。
      5. 计数细胞数量，制备浓度为4.0 × 106个细胞/mL的细胞悬液。每支冻存管加入1 mL细胞悬液，进行程序降温冻存。
    2. 在可渗透膜插入式培养系统底部孔板中的生长（2–12周）
      1. 向每个12孔板的孔中加入1 mL溶于ddH2O的聚-L-赖氨酸（5 µg/mL），用于星形胶质细胞的培养准备。将板置于37 °C孵育2小时。
      2. 为每块12孔板配制25 mL星形胶质细胞生长培养基（低糖DMEM培养基补充10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）。
      3. 从液氮中取出星形胶质细胞冻存管，加入750 µL低糖DMEM培养基解冻。轻柔吹打以促进解冻和混匀。解冻完成后，将细胞悬液转移至15 mL离心管，并补加培养基至总体积7 mL。
        注意：液氮温度极低，操作时应佩戴手套等个人防护装备。
      4. 为去除冷冻保护剂，将细胞悬液在250 × g、4 °C条件下离心7分钟。
      5. 小心吸除上清液，用新鲜培养基重悬细胞。
      6. 移除12孔板各孔中的包被液，每孔加入1 mL细胞悬液接种。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下孵育。
      7. 每隔三天更换一次培养基，至少培养2周后方可用于与内皮细胞的共培养。细胞解冻后最长可在12周内用于共培养，最佳使用时间为2–8周。

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结果

血脑屏障的建立 体外 模型

在本研究所展示的优化方法中，pBECs的培养以及含星形胶质细胞的可渗透膜插件系统（含MC或不含ACM或NCC）的建立（图1）持续进行9–11天（图2）。为筛选内皮细胞，初始培养采用纯化的毛细血管片段，并联合最大5天的嘌呤霉素处理，以清除大部分污染细胞，并促进毛细血管片段中纺锤形内皮细胞的生长（图3A–C）。在第4–6天，pBECs增殖至60–95%融合度，呈非重叠、接触抑制、纵向排列的生长状态。当细胞达到所需融合度后，将pBECs以1.1 × 105 个细胞/插件的密度接种于IV型胶原和纤连蛋白包被的可渗透膜插件滤膜上（表面积1.12 cm2，孔径0.4 µm...

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讨论

原代支气管上皮细胞的纯化与扩增

在纯化过程中，关键步骤包括快速有效地去除软脑膜以及分离白质和灰质，这对纯化得率、纯度以及模型的正确建立至关重要。对于所展示的 体外 使用原代脑微血管内皮细胞（pBECs）构建血脑屏障模型，我们改进并简化了一种基于分离灰质组织的机械匀浆、利用孔径筛选过滤法分离微血管、经胶原酶、DNase 和胰蛋白酶消化，并以微血管片段进行初始培养的纯化流程。通常情况下，原代细胞纯化与培养过程中的主要挑战之一是去除污染细胞。在原代脑微血管内皮细胞纯化经验表明，彻底清除软脑膜和白质组织可显著提高毛细血管的纯度和得率，同时促进内皮细胞生长并增强血脑屏障特征性标志物的表达。因此，本方案中特别强调仔细去除软脑膜（包括脑沟内的膜结构），以确保清除具有成纤维细胞样特性的软脑膜细胞，以及生长速度较内皮细胞更快的动脉和微动脉平滑肌细胞。同样地，尽量减少白质组织的残留也有助于获得更纯净的内皮细胞培养物，减少从分离的毛细血管片段中生长出的污染细胞。然而，本研究所采用的这种简化且快速的分离方法会降低毛细血管的收获量，若能进一步优化灰质组织的分离步骤，则有望显著提高每份脑组织的毛细...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者谨此感谢Elisabeth Helena Bruun、Sarah Christine Christensen和Niels M. Kristiansen提供的技术协助，以及Lundbeck基金会资助项目（编号R155-2013-14113）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
纤连蛋白Sigma-AldrichF1141
IV型胶原蛋白Sigma-AldrichC5533
聚-L-赖氨酸Sigma-AldrichP1524
DMEM/F-12LonzaBE12-719F
DMEM/低葡萄糖Sigma-AldrichD6046
青霉素/链霉素Gibco Invitrogen15140
血浆来源血清（PDS）First Link UK Ltd.60-00-89
胎牛血清（FBS）Gibco Invitrogen10-270-106
胰蛋白酶/EDTAGibco Invitrogen15090-046
肝素Sigma-AldrichH3393
嘌呤霉素Sigma-AldrichP8833
氢化可的松Sigma-AldrichH4001
8-CPT-cAMPBiologC010
RO 20-1724Sigma-AldrichB8279
硫酸庆大霉素Lonza17-518Z
DMSOSigma-Aldrich34896
PBSSigma-AldrichD8537
EtOHVWR20,824,296用96%乙醇配制70%溶液
DNase 1Sigma-AldrichD4513
胶原酶CLS2Sigma-AldrichC6885
ddH2O使用Elga系统制备
T75培养瓶Thermo Scientific156499
Costar Transwell小室（细胞通透性膜小室）CostarCLS340112孔板，12 mm直径，0.4 μm聚碳酸酯膜
15 ml离心管Cellstar188271
50 ml离心管Cellstar227261
培养皿Thermo Scientific150350
冻存管Thermo Scientific377224
500 ml瓶Thermo Scientific159910/159920
手术刀Swann-MortenREF021124型
组织匀浆器SigmaD9188
140 μm滤器MERCKNY4H04700
40 μm滤器Corning431750
EndOhm腔室系统World Precision InstrumentsENDOHM-12适用于12 mm培养杯的EndOhm腔室
EVOM2电极系统World Precision Instruments300523+STX100C配备刚性STX-100C电极对的TEER测量系统
长针头Sigma连接至注射器使用
细尖弯镊KLS Martin12-409-12-07
宽头镊VWR82027-390
滤器支架MERCK MiliporeSwinnex-47
50 ml注射器Braun4617509F
10 ml注射器TerumoSSt20ESI
抗Occludin抗体Abcamab317211:100
抗p120 Catenin抗体BD Transduction laboratories6101331:200
抗ZO-1抗体Invitrogen61-73001:200
抗Claudin 5抗体Sigma-AldrichSAB45029811:100
与Alexa Fluor 568偶联的驴抗兔IgGThermo ScientificA100421:500
与Alexa Fluor 488偶联的驴抗小鼠IgGThermo ScientificA212021:500
蔗糖Perkin ElmerNEC100X250UC终工作浓度为0.15µl/ml
荧光黄SigmaL0144终工作浓度为10 µg/ml

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