方法文章

改进的建立方法 体外 基于猪脑内皮细胞的血脑屏障模型

DOI：

10.3791/56277

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2017年9月24日

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1Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Institute of Pharmaceutical Science, King's College London, 3HICoE Centre for Drug Research, Universiti Sains Malaysia

本文内容

摘要

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本方案的目的是提供一种优化的流程，用于建立一个 体外 基于原代猪脑微血管内皮细胞（pBECs）的血脑屏障（BBB）模型。该模型具有高度可重复性和紧密性，适用于药物发现中的转运及细胞内 trafficking 研究。

摘要

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本方案旨在提供一种优化的纯化与培养原代脑微血管内皮细胞（pBECs）的方法，并建立 体外 基于猪脑微血管内皮细胞（pBECs）的单层培养（MC）、添加星形胶质细胞条件培养基（ACM）的单层培养，以及与猪或大鼠来源星形胶质细胞非接触共培养（NCC）的血脑屏障（BBB）模型。pBECs 从 5–6 个月龄家猪脑皮层毛细血管片段中分离并培养获得。通过仔细去除脑膜、分离并匀浆灰质、过滤、酶消化和离心等步骤对这些片段进行纯化。为进一步去除污染细胞，毛细血管片段在含嘌呤霉素的培养基中进行培养。当 pBECs 从毛细血管片段生长至 60–95% 汇合时，将其传代至可透膜滤插件中，并建立上述模型。为增强 pBECs 的屏障紧密性和 BBB 特征性表型，细胞接受以下分化因子处理：膜通透性 8-CPT-cAMP（简称为 cAMP）、氢化可的松以及磷酸二酯酶抑制剂 RO-20-1724（RO）。该过程持续 9–11 天；建立 NCC 模型时，星形胶质细胞需提前培养 2–8 周。遵循本方案所述操作步骤，可成功构建具有高度限制性旁细胞通透性的内皮细胞层，其中 NCC 模型的平均跨内皮电阻（TEER）为 1249 ± 80 Ω cm2，以及细胞旁通透性（P应用程序) 对于荧光黄的 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 cm sec-1 （均值 ± 标准误，n=55）。对该 pBEC 表型的进一步评估显示，紧密连接蛋白 claudin 5、ZO-1、occludin 以及黏附连接蛋白 p120 catenin 表达良好。该模型可用于多种健康与疾病状态下血脑屏障的研究，且由于其细胞旁通透性高度受限，适用于转运及细胞内 trafficking 研究。

引言

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血脑屏障的细胞结构与功能

在循环系统与中枢神经系统（CNS）的交界处，血脑屏障（BBB）作为调控CNS微环境稳态的关键部位，对神经系统的正常功能和保护至关重要。BBB的作用部位是衬于血管管腔的内皮细胞。在脑毛细血管中，内皮细胞形成复杂的细胞间紧密连接，并高度极性地表达特定的流入和流出转运蛋白，从而确保血液与大脑之间分子转运的高度特异性1。紧密连接复合体的结构成分包括occludin和claudin家族蛋白、zonula occludens（ZO）蛋白、cingulin以及相关的连接黏附分子（JAMs）。其中，claudin 5在细胞旁路连接限制中尤为重要。这种特征性BBB内皮细胞表型的诱导和维持涉及与周围细胞（包括周细胞、星形胶质细胞、神经元以及基底膜）的动态相互作用，这些细胞与脑内皮细胞共同构成神经血管单元（NVU）2,3。这些相互作用所涉及的机制尚未完全阐明，但包括细胞间化学信号的交换，可在短期内调节BBB通透性，并诱导长期的BBB特性4。尤其是星形胶质细胞，已知其有助于脑内皮细胞表型的形成，并可产生多种调节因子，如胶质源性神经营养因子（影响细胞内cAMP水平）5、碱性成纤维细胞生长因子

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方案

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猪脑取自丹麦食品工业的副产品。丹麦屠宰场受到丹麦环境与食品部的严格监督和监管。

用于星形胶质细胞分离的大鼠在当地动物饲养设施中繁殖并群体饲养，环境温度为 22 °C–23 °C，光照周期为 12 小时明/12 小时暗，在兽医监督下进行，并遵循丹麦实验动物管理法规。大鼠在牺牲前被实施安乐死，操作过程符合国际实验动物伦理使用指南（1986 年 11 月 24 日欧洲共同体理事会指令 86/609/EEC）以及丹麦相关指南。本实验未开展任何涉及动物或人体组织的 in vivo 实验。

注意：以下是描述 pBEC 主要实验方案的步骤：（步骤 1）纯化，（步骤 2）培养，以及（步骤 3）TEER 测量。对于与星形胶质细胞共培养体系（NCC）的建立，另提供一个替代方案（步骤 4），描述大鼠和猪星形胶质细胞的纯化与培养。

1. 猪脑毛细血管的纯化

  1. 采集8-10个5-6月龄家猪的脑组织（例如 从附近屠宰场获取组织样本，并在冰上运输至实验室。我们建议在动物处死后的2-3小时内开始以下纯化操作。
  2. 将脑组织置于无菌超净工作台中，放入盛有1 L PBS并置于冰上的烧杯中，轻轻冲....

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结果

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血脑屏障的建立 体外 模型

在本研究所展示的优化方法中，pBECs的培养以及含星形胶质细胞的可渗透膜插件系统（含MC或不含ACM或NCC）的建立（图1）持续进行9–11天（图2）。为筛选内皮细胞，初始培养采用纯化的毛细血管片段，并联合嘌呤霉素处理最多5天，该过程可清除大部分污染细胞，并促进毛细血管片段中纺锤形内皮细胞的生长（图3A–C）。在第4–6天，pBECs增殖至60–95%融合度，呈非重叠、接触抑制、纵向排列的生长状态。当细胞达到所需融合度后，将pBECs以1.1 × 105 个细胞/插件的密度接种于IV型胶原和纤连蛋白包被的可渗透膜插件滤膜上（表面积1.12 cm2，孔径0.4 .......

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讨论

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原代支气管上皮细胞的纯化与扩增

在纯化过程中，关键步骤包括快速有效地去除软脑膜以及分离白质和灰质，这对纯化得率、纯度以及模型的正确建立至关重要。对于所展示的 体外 使用原代脑微血管内皮细胞（pBECs）构建血脑屏障模型，我们改进并简化了一种基于分离灰质组织的机械匀浆、利用孔径筛选过滤法分离微血管、经胶原酶、DNase 和胰蛋白酶消化，并以微血管片段进行初始培养的纯化流程。通常情况下，原代细胞纯化与培养过程中的主要挑战之一是去除污染细胞。在原代脑微血管内皮细胞纯化经验表明，彻底清除软脑膜和白质组织可显著提高毛细血管的纯度和得率，同时促进内皮细胞生长并增强血脑屏障特征性标志物的表达。因此，本方案中特别强调仔细去除软脑膜（包括脑沟内的膜结构），以确保清除具有成纤维细胞样特性的软脑膜细胞，以及生长速度较内皮细胞更快的动脉和微动脉平滑肌细胞。同样地，尽量减少白质组织的残留也有助于获得更纯净的内皮细胞培养物，减少从分离的毛细血管片段中生长出的污染细胞。然而，本研究所采用的这种简化且快速的分离方法会降低毛细血管的收获量，若能进一步优化灰质组织的分离步骤，则有望显著提高每份脑组织的毛细.......

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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作者谨此感谢Elisabeth Helena Bruun、Sarah Christine Christensen和Niels M. Kristiansen提供的技术协助，以及Lundbeck基金会资助项目（编号R155-2013-14113）的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
纤连蛋白Sigma-AldrichF1141
IV型胶原蛋白Sigma-AldrichC5533
聚-L-赖氨酸Sigma-AldrichP1524
DMEM/F-12LonzaBE12-719F
DMEM/低葡萄糖Sigma-AldrichD6046
青霉素/链霉素Gibco Invitrogen15140
血浆来源血清（PDS）First Link UK Ltd.60-00-89
胎牛血清（FBS）Gibco Invitrogen10-270-106
胰蛋白酶/EDTAGibco Invitrogen15090-046
肝素Sigma-AldrichH3393
嘌呤霉素Sigma-AldrichP8833
氢化可的松Sigma-AldrichH4001
8-CPT-cAMPBiologC010
RO 20-1724Sigma-AldrichB8279
硫酸庆大霉素Lonza17-518Z
DMSOSigma-Aldrich34896
PBSSigma-AldrichD8537
EtOHVWR20,824,296用96%乙醇配制70%溶液
DNase 1Sigma-AldrichD4513
胶原酶CLS2Sigma-AldrichC6885
ddH2O使用Elga系统制备
T75培养瓶Thermo Scientific156499
Costar Transwell小室（细胞通透性膜小室）CostarCLS340112孔板，12 mm直径，0.4 μm聚碳酸酯膜
15 ml离心管Cellstar188271
50 ml离心管Cellstar227261
培养皿Thermo Scientific150350
冻存管Thermo Scientific377224
500 ml瓶Thermo Scientific159910/159920
手术刀Swann-MortenREF021124型
组织匀浆器SigmaD9188
140 μm滤器MERCKNY4H04700
40 μm滤器Corning431750
EndOhm腔室系统World Precision InstrumentsENDOHM-12适用于12 mm培养杯的EndOhm腔室
EVOM2电极系统World Precision Instruments300523+STX100C配备刚性STX-100C电极对的TEER测量系统
长针头Sigma连接至注射器使用
细尖弯镊KLS Martin12-409-12-07
宽头镊VWR82027-390
滤器支架MERCK MiliporeSwinnex-47
50 ml注射器Braun4617509F
10 ml注射器TerumoSSt20ESI
抗Occludin抗体Abcamab317211:100
抗p120 Catenin抗体BD Transduction laboratories6101331:200
抗ZO-1抗体Invitrogen61-73001:200
抗Claudin 5抗体Sigma-AldrichSAB45029811:100
与Alexa Fluor 568偶联的驴抗兔IgGThermo ScientificA100421:500
与Alexa Fluor 488偶联的驴抗小鼠IgGThermo ScientificA212021:500
蔗糖Perkin ElmerNEC100X250UC终工作浓度为0.15µl/ml
荧光黄SigmaL0144终工作浓度为10 µg/ml

参考文献

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  1. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 0 (0), 1-29 (2016).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.

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