鹰嘴豆罐头废水中提取物——水相物（Aquafaba）的组成与特性

摘要

水性豆汁（aquafaba）是罐装鹰嘴豆中的一种黏性液体，经剧烈搅拌后可产生相对稳定的白色泡沫。本研究的主要目标是利用核磁共振（NMR）、超滤、电泳和肽质量指纹图谱技术，鉴定水性豆汁中具有增稠/黏性作用的成分。

摘要

鹰嘴豆及其他豆类通常以罐头形式出售，包装在浓稠的溶液或盐水中。最近研究表明，这种溶液可形成稳定的泡沫和乳液，并具有增稠作用。随着互联网上的推广，人们提出该溶液（现被越来越多的群体称为“鹰嘴豆水”（aquafaba））可作为蛋类和乳蛋白的替代品，从而进一步提升了对该产品的关注。由于aquafaba是一个新兴产品，且主要由网络社群推动发展，目前对其成分和性质了解甚少。本研究从10种市售罐装鹰嘴豆产品中回收aquafaba，并分析了其成分、密度、黏度与起泡性之间的相关性。采用质子核磁共振（NMR）技术对aquafaba的组成进行表征，样品经不同分子量截留值（MWCO分别为3、10或50 kDa）的超滤膜过滤前后均进行了检测。同时提供了电泳及肽质量指纹图谱分析的实验方案。这些方法为揭示aquafaba功能特性相关的关键组分提供了重要信息。该研究结果将有助于建立标准化商业aquafaba产品的生产方法，并帮助消费者选择性能更优或品质稳定的产品。

引言

越来越多的植物基产品被开发出来，以模拟肉类、乳制品和鸡蛋的特性。豆类的功能特性在其当前的食品应用中至关重要，同时这些特性也在动物蛋白替代品的研发中得到广泛探索。例如，2015年乳制品替代品的销售额达到88亿美元，且该市场正在迅速增长，预计到2024年将增长至350.6亿美元。此外，植物基牛奶替代品需求的上升趋势，部分源于消费者对乳品生产中常见的胆固醇、抗生素和生长激素等健康问题的关注¹。同样，植物蛋白和胶体类蛋品替代物市场也在快速扩张，预计未来8年这些材料的复合年增长率将达到5.8%，到2026年销售额预计达15亿美元²。越来越多的消费者倾向于选择纯素蛋白来源、低致敏原饮食以及碳足迹更低的食品。由于豆类富含蛋白质、膳食纤维且饱和脂肪含量低，以扁豆、鹰嘴豆和蚕豆为基础的产品需求持续增长³。此外，豆类还含有具有潜在有益生物活性的植物化学物质⁴。

商业实体、科学家以及个人在传达鹰嘴豆基蛋类和乳制品替代品的质量特性方面采取了不同的方法。Gugger 等.⁵ 利用高淀粉谷物（包括小豆和鹰嘴豆）制备出一种类似牛奶的产品。在其所述方法中，研究者试图证明其产品与"aquafaba"⁶具有显著区别。Tetrick 等.⁷阐述了另一种商业方法，开发出一种植物基蛋类替代品。其专利申请描述了将豆类粉与已知增稠剂结合的方法，以模拟蛋清在烘焙材料中的功能。典型配方包含80-90%的豆类粉和10-20%的增稠添加剂。

同行评审的文献还表明鹰嘴豆具有多种功能特性，并已证明从卡布里和德西鹰嘴豆粉中提取的清蛋白组分具有良好的乳化性能。研究还发现鹰嘴豆来源对清蛋白的得率和性能具有显著影响⁸。

在法国厨师 Joël Roessel 首次于互联网发布关于"aquafaba"的报告后，一场开源运动正在展示 aquafaba 在多种食品应用中替代蛋清和乳蛋白的实用性。许多浏览量极高的网页和 YouTube 视频展示了将 aquafaba 应用于模拟冰淇淋、蛋白酥、奶酪、蛋黄酱、炒蛋和打发奶油等食品中的方法。大多数提供开源 aquafaba 应用（食谱）的先行者，都是通过过滤罐装鹰嘴豆并使用其液体来获取原料。这些实践者大多并非受过专业训练的科学家。视频评论区的反馈表明，许多观众尝试复制这些食谱，但部分人未能成功复现 aquafaba 倡导者所展示的效果。

在开发蛋类和乳制品替代品的三种方法（企业化、科学化和开源）中，每种方法都有其优势，但都缺少一个重要维度。应用科学家、基础科学家以及推广基于豆类产品的个人，对其原料的表征和标准化均不充分。针对特定用途对产品进行标准化是工业界的常规做法。目前，鹰嘴豆品种尚未针对“豆汁”（aquafaba）的质量进行标准化，而工业化罐装工艺的标准化目标也是为了生产一致的鹰嘴豆，而非“豆汁”。

根据对其他商品作物的研究，可以预测基因型和环境因素均会影响脉冲类豆汁（aquafaba）的质量。已知基因型和环境都会影响卡布里鹰嘴豆的罐装特性⁹。通常，相关物种之间的基因型效应较大，而同一物种内不同品种之间的基因型效应较小。通过保持品种的可追溯性，可以选择具有理想特性的栽培品种，从而最小化其物理和化学性质的变异。环境因素的影响也可能很大，可通过质量评估以及在特定测试中进行调配以达到标准性能来加以管理¹⁰。

在商业生产中存在许多遗传上不同的鹰嘴豆品种。例如，萨斯喀彻温大学作物开发中心是商业鹰嘴豆种质资源的主要来源，自1980年以来已发布了23个鹰嘴豆品种，其中6个目前推荐在加拿大种植。尽管科学论文通常会描述研究中所使用的品种，但被调查的专利和网页并未指明所使用的鹰嘴豆品种或其来源。品种和处理方式的标准化可能有助于用户更成功地利用鹰嘴豆，但此类信息在罐装鹰嘴豆产品上无法获得。

本研究的目的是确定贡献于水性豆汁起泡特性的组分。本文比较了来自不同市售鹰嘴豆品牌的水性豆汁的流变特性，并通过核磁共振（NMR）、电泳和肽质量指纹图谱技术研究其化学性质。据我们所知，这是首次描述水性豆汁增稠组分的化学组成及其功能特性的研究。

方案

从鹰嘴豆中分离水性豆液

1. 从当地杂货店购买鹰嘴豆罐头，并使用手动开罐器打开。
2. 将罐头从 A 到 J 进行标记。
3. 使用不锈钢网筛将鹰嘴豆与豆汁（aquafaba）分离，并分别称量分离后的鹰嘴豆和豆汁。

获取鹰嘴豆和豆液的代表性样品用于化学分析。

4. 沥干水后，随机选取十颗鹰嘴豆以测定其水分含量。
5. 将选好的鹰嘴豆放入干燥罐中，在干燥烘箱中于100 ± 2 °C下加热16–18小时。
6. 干燥后，将鹰嘴豆研磨成粉末以供进一步使用（例如 蛋白质和碳含量分析）。
7. 将各来源的鹰嘴豆液和鹰嘴豆泡沫在-20 °C下冷冻，然后在冷冻干燥机中干燥。干燥后的鹰嘴豆液将用于氮和碳含量的测定。

蛋清水解物的功能特性

8. 使用2号贝壳杯在25 °C下测定蛋清水的黏度。
   1. 将贝壳杯浸入蛋清水中。
   2. 记录杯子排空所需的时间¹¹。当杯子从蛋清水中提起时启动计时器，当从杯子流出的液流中断时停止计时。
   3. 通过随杯附带的黏度-排空时间关系图表确定蛋清水的黏度。
9. 起泡能力
   1. 将蛋清水溶液（100 mL）倒入不锈钢碗中，使用手持式搅拌器以10档速度搅拌2分钟。
   2. 搅拌完成后立即用量筒测量泡沫体积，记为V_f100。
   3. 让泡沫静置并随时间干燥，以观察泡沫稳定性，并获取干燥泡沫样品。

鹰嘴豆种子的颜色参数

10. 从每个罐头中随机选取鹰嘴豆种子进行颜色测定。
11. 使用白色、黑色和参考标准对Hunter lab色差仪进行校准，然后进行测量。
12. 颜色坐标值由CIE Lab系统确定¹²，包括 L （正值代表白色，0 代表黑色） a （阳性为红色，阴性为绿色），以及 b （阳性为黄色，阴性为蓝色）在日光65°条件下进行三份平行实验。

蛋白质和碳含量

13. 使用元素分析仪通过燃烧法测定蛋白质和碳含量¹³。蛋白质含量估算为氮含量乘以6.25¹⁴。

水分含量

14. 将样品置于干燥箱中，在 100 ± 2 °C 下加热 16–18 小时，测定种子和豆类浸泡液的水分含量¹⁵。

核磁共振波谱法

15. 样品制备
    1. 在进行波谱分析之前，将水相豆渣提取液（aquafaba）样品在9200 × g条件下离心10分钟。离心后，将上清液通过0.45 µm的一次性注射器滤器（25 mm，聚四氟乙烯（PTFE）膜）。取0.4 mL aquafaba样品加入含有50 mg氘代水的核磁共振（NMR）样品管中，用于NMR分析。
    2. 对于先前所述的干燥泡沫样品，取样品（25 mg）溶于500 mg氘代水中，所得溶液用于NMR分析。
    3. 将所有样品装入带盖的5 mm NMR样品管中，用于¹³C-NMR和¹H-NMR分析。向每根NMR样品管中加入氘代水和3-(三甲基硅基)丙酸-2,2,3,3-d₄钠盐（TMSP），分别提供溶剂锁场信号并作为内标物。
16. NMR测试条件
    1. 使用500 MHz NMR或类似的高场NMR波谱仪采集质子NMR谱图，每张谱图至少累积16次扫描，并采用水峰抑制程序，例如双脉冲场梯度自旋回波质子NMR（DPFGSE-NMR）脉冲序列¹⁶。
    2. 调整化学位移，使TMSP峰位于0 ppm，然后使用积分软件确定样品中各化合物的相对含量。

电泳

注意：此步骤选用产生最稳定泡沫的水性豆汁（品牌 H）。该品牌不含盐。

17. 样品制备
    1. 将鹰嘴豆水相提取物分别加入三个具有不同分子量截留值（MWCO）的离心式再生纤维素超滤装置的上层储液室中，其截留分子量分别为 3、10 或 50 kDa。
    2. 将离心过滤单元置于合适的离心机中，在 4 °C 下以 3900 × g 离心 2 小时，获得上清液和截留液组分。上清液组分用于¹H-NMR 分析不含高分子量（MW）物质的小分子。3 kDa 膜的截留液组分用于电泳分离，因为该膜被认为可保留大部分蛋白质。
    3. 采用改良的 Bradford 法测定上清液和截留液中的蛋白质含量，以牛血清白蛋白作为标准品¹⁷。
    4. 将上清液和截留液组分的样品置于 Eppendorf 管中，在合适的振荡器中以每秒 25 次的频率振荡 10 分钟¹⁸。观察振荡后的溶液，判断是否因振荡形成泡沫。
    5. 向超滤装置中加入 2.0 mL 蒸馏水以溶解截留物，并进行第二次离心处理，实现透析过滤。将超滤装置在 4 °C 下以 3900 × g 离心 2 小时。
    6. 将截留物（0.025 g）与 1 mL 0.02 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）或磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）混合，以溶解蛋白质。
    7. 将混合物在 21000 × g 下离心 1 分钟。
    8. 取上清液，采用前述改良 Bradford 法测定蛋白质含量。
18. 电泳分离
    注意：上述 3 kDa MWCO 膜的截留液组分将采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行电泳分离。
    1. 使用 15% 聚丙烯酰胺分离胶和 5% 聚丙烯酰胺浓缩胶制备聚丙烯酰胺凝胶。
    2. 在凝胶的一个泳道中加入 20 µg 蛋白质样品，在另一独立泳道中加入 PageRuler 预染蛋白质分子量标准（范围为 10–170 kDa）。
    3. 使用 Mini-Protein Tetra Cell 系统对凝胶施加电流，方法参照 Laemmli（1970）的改进方案¹⁹。电泳操作条件、凝胶染色及脱色步骤请参照 Ratanapariyanuch et al.（2012）²⁰。

肽质量指纹图谱

注意：根据 Ratanapariyanuch et al. (2012)²⁰ 的方法，从 3 kDa 截留液的 SDS-PAGE 凝胶中切取相应条带（分子量约为 8、10、13、14、15、20、22、31、37、55 和 100 kDa），用于胰蛋白酶消化，并进行质谱分析。

19. 凝胶内消化
    1. 将凝胶条带浸入 100 µL 含 200 mM 碳酸氢铵（NH₄HCO₃）的 50% 乙腈（ACN）溶液中，重复脱色两次，每次在 30 °C 下孵育 20 分钟。
    2. 脱色完成后，将凝胶样品用 100 µL 乙腈（ACN）处理 10 分钟，然后在室温下使用离心式真空浓缩仪真空干燥 15 分钟。
    3. 将干燥的凝胶样品浸入 100 µL 含 10 mM 二硫苏糖醇（DTT）的 100 mM NH₄HCO₃ 溶液中，在 56 °C 下孵育 1 小时。
    4. 去除多余的还原缓冲液，并替换为 100 µL 烷基化缓冲液 [100 mM 碘乙酰胺溶于质谱（MS）级水中]。
    5. 将凝胶样品在室温下避光孵育 30 分钟。
    6. 用 200 mM NH₄HCO₃ 溶液（100 µL）洗涤凝胶样品两次，通过加入乙腈（ACN，100 µL）使凝胶收缩，再用 200 mM NH₄HCO₃ 溶液（100 µL）重新溶胀，随后再次用乙腈（ACN，100 µL）处理使其收缩。
    7. 吸除乙腈，并在离心式真空浓缩仪中真空干燥凝胶样品 15 分钟。
    8. 用 20 µL 胰蛋白酶缓冲液（50 ng/µL 胰蛋白酶溶于 1:1 的 200 mM NH₄HCO₃ 与胰蛋白酶储存液）重新溶胀干燥的凝胶样品，随后向每个样品中加入 30 µL 200 mM NH₄HCO₃ 溶液。
    9. 将样品置于 Thermomixer 中，在 30 °C 下以 300 rpm 振荡过夜孵育。
    10. 通过加入终体积（第 8 步后混合液体积）1/10 的 1% 三氟乙酸终止胰蛋白酶消化反应，并用 100 µL 含 0.1% 三氟乙酸的 60% 乙腈溶液从凝胶样品中提取胰蛋白酶肽段，随后使用离心式真空浓缩仪真空干燥。
    11. 在进行质谱分析前，将胰蛋白酶肽段储存于 -80 °C。
20. 质谱分析
    1. 加入 12 µL 质谱级水:乙腈:甲酸（97:3:0.1, v/v）溶液重悬胰蛋白酶肽段，涡旋 1 至 2 分钟以充分溶解。
    2. 将所得溶液在 4 °C 下以 18,000 g 离心 10 分钟。
    3. 取 10 µL 上清液转移至质谱小瓶中，用于在配备液相色谱仪和 LC-MS 接口的四极杆飞行时间（QTOF）质谱仪上进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。
    4. 使用高容量 HPLC 芯片进行肽段的色谱分离：该芯片包含一个 360 nL 富集柱和一根 75 µm × 150 mm 分析柱，两根色谱柱均填充 C18-A、180 Å、3 µm 固定相。
    5. 以含 0.1% 甲酸的水溶液为流动相，以 2.0 µL/min 的流速将样品加载至富集柱。
    6. 将样品从富集柱转移至分析柱。
    7. 肽段分离条件如下：采用线性梯度洗脱系统，流动相 A 为含 0.1% 甲酸的水溶液，流动相 B 为含 0.1% 甲酸的乙腈溶液。线性梯度从 3% 流动相 B 开始，在 50 分钟内升至 25% 流动相 B；随后在 10 分钟内从 25% 升至 90% 流动相 B，流速为 0.3 µL/min。
    8. 采用电喷雾正离子模式采集质谱数据，毛细管电压设为 1900 V，碎片离子电压设为 360 V，干燥气体（氮气）温度设为 225 °C，流速为 12.0 L/min。
    9. 在质量/电荷比（m/z）250–1700 范围内以每秒 8 张谱图的速率采集全扫描数据；在 m/z 50–1700 范围内采集 MS/MS 数据，隔离宽度设为 1.3 原子质量单位；每次 MS 扫描选择信号最强的前 20 个前体离子进行串联质谱分析，并设置 0.25 分钟的动态排除时间。
21. 蛋白质鉴定
    1. 使用 Agilent MassHunter 定性分析软件将质谱数据转换为质量/电荷比数据格式。
    2. 以 SpectrumMill 作为数据库搜索引擎，将数据与 UniProt Cicer arietinum（鹰嘴豆）数据库进行比对分析。
    3. 搜索参数包括：碎片离子质量误差 50 ppm，母离子质量误差 20 ppm，胰蛋白酶特异性切割，以及半胱氨酸残基的固定修饰（羧氨甲基化）。

结果

每罐鹰嘴豆均贴有标签，标明罐装过程中添加的成分。成分包括水、鹰嘴豆、盐和乙二胺四乙酸二钠（EDTA）。此外，有两个罐头标注“可能含有氯化钙”。观察到三种不同的内衬颜色：白色、透明黄色和金属色（表1）。

...

品牌代码	盐	乙二胺四乙酸二钠	氯化钙	罐内涂层
A	+	–	–	白色
B	+	–	–	白色

讨论

本研究发现，来自不同商业来源的鹰嘴豆水（aquafaba）所产生的泡沫在性质（泡沫体积和稳定性）和化学组成上均存在差异。鹰嘴豆水的黏度与其水分含量之间存在正相关关系。然而，泡沫体积的增加（V_f100）与这些参数无关。盐和乙二胺四乙酸二钠等添加剂可能会抑制黏度和泡沫稳定性，因为含这些添加剂的罐装鹰嘴豆所得鹰嘴豆水黏度较低，且产生的泡沫稳定性较差。该结果与 Behera et al.（2014）²² 的报道不同，后者指出盐的存在会减少胶束泡沫体积，但能减缓泡沫破裂速率。与罐装过程中添加盐的鹰嘴豆所得鹰嘴豆水相比，烹饪时额外加盐的样品所获得的鹰嘴豆水具有更高的水分含量和更低的碳含量。在烹饪鹰嘴豆前添加盐可能限制了淀粉和蛋白质的溶胀²³。

通过膜过滤分离蛋白质，随后进行SDS-PAGE及肽质量指纹图谱分析表明，洋豆汁中的蛋白质主要为已知的耐热可溶性亲水蛋白。令人意外的是，还检测到胰蛋白酶消化片段，提示该材料可能受到壳球孢菌枯病（ascochyta blig...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冷冻干燥机
压塞托盘干燥器	Labconco Inc.	7948040
混合器
不锈钢手动搅拌器	Loblaws	PC2200MR
黏度测定
2号壳杯	Norcross Corp.
颜色测定
Colorflex HunterLab 分光光度计	Hunter Associates Laboratory Inc.
蛋白质和碳含量测定
元素分析仪	LECO Corp.	CN628
NMR 波谱法
Spectrafuge 24D	Labnet International Inc.
注射器滤器	VWR International	CA28145-497	25 mm，带 0.45 µm PTFE 膜
重水	Cambridge Isotope Laboratories Inc.	7789-20-0
3-(三甲基硅基)丙酸-2,2,3,3-d4 钠盐	Sigma-Aldrich	169913-1G
Bruker Avance 500 MHz NMR 波谱仪	Bruker BioSpin
TopSpin 3.2 软件	Bruker BioSpin GmbH
电泳
再生纤维素膜	Millipore Corp.		3、10、50 kDa（MWCO）
离心过滤装置	Millipore Corp.
台式离心机	Allegra X-22R, Beckman Coulter Canada Inc.
Mixer Mill MM 300 珠磨机	F. Kurt Retsch GmbH & Co. KG
Eppendorf 离心机 5417C	Eppendorf
磷酸盐缓冲液，pH 7.4	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK
Tris-HCl 缓冲液，pH 7.4	Sigma-Aldrich	T6789-10PAK
PageRuler 预染蛋白质分子量标准	Fisher Scientific
Mini-Protein Tetra Cell 系统	BioRad
肽质量指纹图谱
Thermo-Savant SpeedVac	BioSurplus		离心真空浓缩仪
胰蛋白酶缓冲液			20 µL 胰蛋白酶溶于 1 mM 盐酸和 200 mM NH4HCO3
碘乙酰胺	Sigma-Aldrich	I1149-5 g
三氟乙酸	Fluka	BB360P050
乙腈	Fisher Scientific	L14734
甲酸	Sigma-Aldrich	33015-500mL
质谱小瓶	Agilent Technologies Canada Ltd.
Agilent 6550 iFunnel 四极杆飞行时间质谱仪	Agilent Technologies Canada Ltd.		Agilent 1260 系列液相色谱仪和 Agilent Chip Cube LC-MS 接口
HPLC-Chip II：G4240-62030 Polaris-HR-Chip_3C18			360 nL 富集柱和 75 µm × 150 mm 分析柱，均填充 Polaris C18-A，180Å，3 µm 固定相。
Agilent MassHunter 定性分析软件	Agilent Technologies Canada Ltd.
SpectrumMill 数据提取器	Agilent Technologies Canada Ltd.