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方法文章

开发一种人源前临床破骨细胞生成模型：外周血单核细胞与乳腺癌细胞系共培养

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DOI：

10.3791/56311

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2017年9月13日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST), IRCCS

本文内容

摘要

本方案描述了一种方法的开发过程 体外 利用乳腺癌细胞系与外周血单核细胞共培养，建立模拟癌细胞与破骨细胞相互作用的人类临床前破骨细胞生成模型。该模型可用于深入理解骨转移形成的机制，并改善治疗策略。

摘要

肿瘤细胞与骨细胞在骨微环境中的相互作用对于理解骨转移形成机制至关重要。我们开发了一种 体外 一种完全人源的乳腺癌细胞与单核细胞共培养的临床前模型，其中单核细胞向破骨细胞方向分化。我们优化了一种破骨细胞生成模型，起始于从健康供体采集的外周血样本。首先通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs），将其高密度接种，并通过添加两种生长因子（GFs）诱导其分化：核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子 （MCSF）。细胞培养14天后，进行固定并进行后续分析。在溶骨性骨转移中，癌细胞到达骨骼后的效应之一是诱导破骨细胞生成。因此，我们通过将乳腺癌细胞与单核细胞共培养，以研究癌细胞相对于生长因子（GFs）的分化诱导能力。研究癌细胞与破骨细胞相互作用的一种直接方法是采用间接共培养体系，即收集乳腺癌细胞培养的条件培养基，与新鲜培养基混合后用于诱导破骨细胞分化。我们还优化了一种直接共培养方法，使癌细胞与正在分化的单核细胞共享培养基并交换分泌因子。相较于原始的间接共培养方法，该方法具有显著优势，研究人员可观察两种细胞间的双向相互作用，并对癌细胞和破骨细胞同时进行后续分析。该模型使我们能够研究药物对转移性骨微环境的影响，并可接种非乳腺癌来源的其他细胞系。此外，该模型还可用于研究骨质疏松症或其他骨骼相关疾病。

引言

骨骼是多种原发性肿瘤（如前列腺癌、肺癌和乳腺癌）常见的转移部位，约有20%至25%的患者在病程中会发生骨转移1,2,3。特别是乳腺癌患者，在死亡时有70%可发现骨转移的证据4。肿瘤细胞与基质细胞之间的相互作用对于原发癌和继发性病灶中的癌症进展均至关重要。在骨微环境中，乳腺癌引起的溶骨性骨转移依赖于癌细胞、骨细胞及骨微环境之间形成的一种病理性恶性循环。癌细胞破坏骨稳态，导致骨吸收增加5,6,7。

在生理和病理条件下，破骨细胞是负责骨吸收的细胞，而成骨细胞通过沉积新的基质，负责新骨的形成8。成骨细胞通过表达RANKL调控破骨细胞的活性，RANKL可与其在前体破骨细胞表面的受体RANK结合，诱导前体破骨细胞融合，这是分化为成熟破骨细胞所必需的过程。破骨细胞生成的诱导会增加骨吸收。大量in vivo研究显著加深了我们对骨转移形成的理解9,10,11。原发性肿瘤来源的乳腺癌细胞以及存在于骨微环境中的癌细胞会破坏骨稳态，促进破骨细胞生成和骨吸收8。在此背景下，癌细胞与破骨细胞之间发生的所有分子相互作用均具有关键意义。如前所述，骨转移形成的机制已在in vivo小鼠模型中得到阐明。然而，除了所有in vivo动物实验均需获得伦理委员会批准外，开展in vivo实验还存在其他多种局限性，包括成本高昂和耗时较长。多位研究者已将in vivo和in vitro的破骨细胞生成前临床模型相结合，使用一种名为RAW246.7的小鼠前体破骨细胞系9,10,11。该模型的局限性在于这些细胞已定向分化为前体破骨细胞，且非人源细胞。因此，转化医学研究将极大受益于可获得完全人源的in vitro前临床模型，以研究骨癌细胞间的相互作用。

我们优化了一种破骨细胞生成方法 体外 从人外周血样本开始12,13破骨细胞来源于单核细胞，后者在外周血样本中仅少量存在。首先通过Ficoll密度梯度离心法将单个核细胞从全血中的红细胞和粒细胞中分离；随后利用单核细胞能够贴附于塑料基质而淋巴细胞不能的特性进行筛选。接种后，细胞培养14天。MCSF和RANKL是单核细胞分化为巨噬细胞、进而分化为破骨细胞所必需的生长因子。14,15在整个实验过程中都需要MCSF，而RANKL则用于在成骨细胞生成的后期阶段诱导分化过程。在分化的早期阶段，MCSF有助于单核细胞的增殖和存活。14,15在破骨细胞生成的第二阶段，细胞相互融合并成熟为破骨细胞，呈现出肌动蛋白F以环状分布的特征，并表达特定标志物，如抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）和降钙素受体（CTR）。14,15本方法包括在实验的前7天向单核细胞培养物中添加MCSF，从第7天到第14天则联合使用MCSF和RANKL。实验结束时，通过计数已分化的细胞来分析破骨细胞生成情况，具体步骤如下所述。

通过生长因子（GFs）诱导分化的单核细胞培养体系构成了我们临床前模型的基础。为了更深入地理解乳腺癌细胞的成骨细胞生成能力，我们优化了一种不含生长因子的共培养系统。我们首先建立了一种间接共培养模型，即将培养基（80% α-最低必需培养基（α-MEM）和20% 条件培养基）加入正在分化的细胞中，其中条件培养基取自约90%融合度的乳腺癌细胞培养体系12。该条件培养基（未在无血清条件下收集）在培养24小时后收集，并以1:4的比例与新鲜培养基混合。与阴性对照相比，该条件培养基显著诱导了破骨细胞的分化。然而，由于间接共培养会丢失癌细胞与骨细胞之间相互作用的信息，因此我们进一步改进了体系，采用直接共培养方法。我们将癌细胞接种于0.4 µM的插入式培养小室中，并将其置于已接种单核细胞的孔板中。通过该方法，细胞共享同一培养基并交换分泌蛋白。由此，我们建立了一种完全由人源细胞构成的、由癌细胞诱导的破骨细胞生成临床前模型13。

该系统具有极强的多功能性，可用于不同的研究目的，例如，在药理学研究中探讨药物在骨转移中的作用。我们的模型使得研究骨靶向治疗药物和/或抗肿瘤药物在癌细胞存在条件下对骨微环境中的疗效及作用机制成为可能13。在实验设计中设置正确的对照组，即，将癌细胞和破骨细胞单独培养，有助于更清晰地理解共培养对药物活性的影响。当所研究的药物同时靶向癌细胞和破骨细胞时，这一方法更具意义，例如，依维莫司16。该模型还可用于发现癌细胞与骨细胞之间相互作用的新通路。

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方案

人破骨细胞由健康供体的外周血单个核细胞（PBMC）分化而来，这些供体均签署了书面知情同意书，同意参与本研究。研究方案经当地伦理委员会批准，符合1964年《赫尔辛基宣言》所规定的伦理标准。

1. 破骨细胞分化

注意：使用含EDTA的抗凝管采集健康人外周血或血沉棕黄层。外周血采集量不得少于20 mL。优先选用血沉棕黄层，因其单个核细胞含量更丰富。所有后续操作均须在无菌细胞培养操作台中进行。

  1. 将EDTA全血与1×磷酸盐缓冲液（PBS）按1:1比例稀释，充分重悬。
  2. 在50 mL离心管中加入淋巴细胞分离介质（血液PBS：淋巴ocyte separation media，2:1）。
    1. 将用 PBS 稀释的 30 mL 血液移入 50 mL 离心管中。
    2. 轻轻将15 mL淋巴细胞分离液沿50 mL离心管管壁加入管底。
  3. 在室温下以 757 × g 离心 10 分钟（不使用刹车）。
  4. 收集单个核细胞：
    1. 用5 mL移液管收集单个核细胞的白色层，避免扰动，转移至新的50 mL离心管中。
    2. 用20 mL PBS稀释收集的PBMCs。
  5. 洗涤PBMCs：
    1. 在室温下以 225 × g 离心 5 分钟。
    2. 倒置离心管弃去上清液，重复一次。
  6. 红细胞裂解：
    注意：如果细胞沉淀呈红色，则用红细胞裂解缓冲液处理细胞（参见 材料表).
    1. 将50 mL离心管置于冰上。
    2. 加入5 mL红细胞裂解缓冲液。
    3. 等待3 - 5分钟以完成红细胞裂解。具体时间根据红细胞污染程度而定。
    4. 通过加入 20 mL PBS 终止反应。
    5. 在室温下以225 × g离心5分钟。将管子倒置以弃去上清液。
      注意：可选步骤：如果进行了红细胞裂解，则按以下所述洗涤PBMCs。
  7. 洗涤外周血单个核细胞（PBMCs）：
    1. 加入20 mL PBS，室温下以225 × g离心5分钟。
    2. 将试管倒置，弃去上清液。
  8. 用完全α-MEM培养基（添加1%谷氨酰胺（初始浓度100倍）和10%胎牛血清）重悬细胞。
  9. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
    1. 将样品用冰醋酸按1:100稀释，取10 µL稀释液进行细胞计数。
    2. 至少重复计数两次，计算重复样本的平均值，以获得收集细胞的总平均数。
  10. 铺板细胞：
    1. 以每平方厘米750,000个PBMCs的浓度接种细胞2.
    2. 将培养的细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中保存2 大气
      注意：实验设计应包含阴性对照，即用不含MCSF或RANKL生长因子的正常完全α-MEM培养基处理的细胞。每种条件至少进行3次技术重复，并至少完成3次生物学重复。
  11. 更换添加生长因子（GFs）的培养基：
    1. 细胞接种后约等待3小时，然后用移液器（200 - 1,000 µL）吸除培养基，以去除碎片、未贴壁细胞和红细胞。
      注意：更换培养基时需小心，以避免细胞脱落。
    2. 加入新的完全α-MEM培养基，补充20 ng/mL M-CSF（每孔500 µL）。
      注意：与癌细胞共培养时，应在接种外周血单个核细胞（PBMC）的次日接种癌细胞。
  12. 每2-3天更换一次培养基（α-MEM，添加20 ng/mL MCSF）：
    1. 用 200 - 1,000 µL 移液器弃去培养基。
    2. 使用 200–1,000 µL 移液器加入新鲜培养基。
  13. 细胞接种后6-7天，向完全α-MEM+MCSF培养基中加入20 ng/mL RANKL。
  14. 每隔 2–3 天更换一次培养基（完全 α-MEM + MCSF + RANKL）：
    1. 使用 200 - 1,000 µL 移液器弃去培养基。
    2. 使用200–1,000 µL移液器加入新鲜培养基。在细胞接种后14天终止分化诱导。
    3. 弃去培养基，用 PBS 洗涤两次。
  15. 用多聚甲醛固定细胞：
    1. 让细胞自然干燥。
    2. 加入4%多聚甲醛（见 材料表).
    3. 室温孵育20分钟。
  16. 弃去多聚甲醛，用500 µL PBS洗涤两次。
    警告：多聚甲醛有毒，请佩戴手套、口罩和护目镜。
  17. 让细胞自然干燥。
  18. 按照制造商说明书进行TRAP染色（参见 材料表).
  19. 在显微镜下以10倍物镜（NA 0.30）手动计数破骨细胞样细胞。
    注：破骨样细胞定义为 TRAP 阳性且含有至少 4 个细胞核的多核巨细胞。

2. 肿瘤细胞培养

注意：实验可使用不同类型的乳腺腺癌细胞系进行，例如SCP217（一种源自三阴性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的嗜骨性细胞系）以及激素受体阳性细胞系MCF7。

  1. 在75 cm2培养瓶中以单层形式培养细胞。
    1. 在75 cm2培养瓶中接种1,000,000个癌细胞。
    2. 将细胞置于含1%谷氨酰胺和10%胎牛血清的完全α-MEM培养基中，在37 °C、5% CO2的培养箱中培养。
  2. 当细胞融合度达到约90%时进行消化收集：
    1. 弃去培养基，用PBS洗涤一次，加入2–3 mL含1X胰蛋白酶的PBS溶液。
    2. 在37 °C孵育3–5分钟。
    3. 用10 mL移液管从75 cm2培养瓶中收集脱落的细胞，并加入8 mL完全培养基以终止酶反应。
    4. 以225 × g离心5分钟。
  3. 洗涤癌细胞：
    1. 加入10 mL PBS。
    2. 以600 × g离心5分钟。
  4. 使用血细胞计数板（Neubauer计数室）对癌细胞进行计数。
    1. 至少重复计数两次，取重复样本的平均值，得到收集的细胞总数。

3. 癌细胞与单核细胞向破骨细胞分化过程中的直接共培养

  1. 将癌细胞接种到小室中（孔径 0.4 µm）：
    1. 以每 cm2 4,000 个细胞的浓度接种癌细胞。
    2. 在 37 °C 和 5% CO2 条件下培养。
      注意：在共培养实验中，应在接种 PBMC 的次日接种癌细胞至 0.4 µm 小室中。
  2. 静置 24 小时，使细胞充分贴壁。
  3. 将接种了癌细胞的小室置于单个核细胞培养物上方，开始共培养（参见方案第 1.10 节）。
  4. 每隔 2 - 3 天更换一次完全 α-MEM 培养基。
    1. 使用 200 - 1,000 µL 移液器弃去旧培养基。
    2. 加入 500 µL 新鲜培养基。
      注意：共培养的主要目的是评估癌细胞的破骨细胞生成能力，因此 α-MEM 中不添加生长因子（GFs）。每次共培养实验均应设置阴性对照（参见方案第 1.10 步注释）和由 RANKL 与 MCSF 诱导分化的破骨细胞阳性对照（不含癌细胞）。接种于小室中但未置于单个核细胞上方的癌细胞作为共培养的阴性对照。
  5. 终止共培养，并对癌细胞进行后续分析：
    1. 在 PBMC 接种后第 13 天、癌细胞接种后第 12 天，将小室转移至新培养板中。
    2. 根据拟进行的下游分析类型终止癌细胞培养（参见 讨论 部分）。
  6. 第 14 天时，终止破骨细胞分化并固定细胞，操作方法见第 1.15 步。
  7. 立即或在 14 - 30 天内进行 TRAP 染色。
    注意：可选染色：为确认 TRAP+ 多核细胞为破骨细胞，研究人员可进一步进行降钙素受体（CTR）染色，CTR 是破骨细胞特异性标志物。F-肌动蛋白环的检测是另一种破骨细胞特异性染色方法12,13,14。

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结果

已优化一种方法，可轻松将人外周血单核细胞诱导分化为破骨细胞。将单核细胞与癌细胞共培养，证实了文献中所述的观点18，即癌细胞能够在骨转移灶中维持破骨细胞的生成。由癌细胞和成纤维细胞（GFs）诱导生成的破骨细胞如图1所示。破骨样细胞定义为含有4个或更多细胞核且抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色阳性（紫色细胞）的细胞。目前公认的用于定义破骨细胞的细胞核数量阈值为3个18，但本研究采用4个细胞核作为标准，以最大程度降低假阳性结果的风险。

该模型显示，乳腺癌细胞能够持续促进破骨细胞生成，因为癌细胞诱导的培养孔中破骨细胞数量与阳性对照组相当（图2）。如图2A所示，在阴性对照组中也有一定数量的细...

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讨论

临床前 体外 需要建立研究癌细胞与骨细胞间相互作用机制的模型，以揭示可用于制定新治疗策略的骨转移机制。我们开发了一种完全人源的 体外 人外周血破骨细胞生成模型（图3）。在方法优化过程中，我们识别并解决了若干关键问题。第一个问题是接种单个核细胞的数量。通过显微镜计数获得的细胞数量仅为粗略估算，因为难以区分淋巴细胞与单核细胞，而后者才是破骨细胞生成实验中需要接种的目标细胞。我们能够识别单核细胞，是因为淋巴细胞不贴附于塑料培养基质，因此在首次更换培养基时大部分已被去除。细胞接种密度较高，因为细胞间相互作用对于分化至关重要，尤其是在破骨细胞生成的第二阶段，前体破骨细胞必须彼此靠近才能融合形成成熟的破骨细胞。当存在多个实验条件时，会带来进一步困难，因为这需要大量细胞和较大量的血液。一种可能的解决方案是使用富含外周血单个核细胞（PBMCs）的血沉棕黄层（buffy coats）。 例如，4 × 105-6 × 106 单个核细胞通常从50 mL的血沉棕黄层样本中收集，而收集量少于1 x 10<...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢Yibin Kang提供了SCP2细胞系，并感谢Cristiano Verna在编辑方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
αMEMEuropcloneBE12-169F
谷氨酰胺Life-technologiesECB3000D
胎牛血清Life-technologiesECS0180DPR
hMCSFPeprotech300-25必须遵守储存说明
hRANKLPeprotech310-01必须遵守储存说明
白细胞酸性磷酸酶（TRAP）检测试剂盒Sigma Aldrich387 A
淋巴细胞分离液BiowestL0560-100
红细胞裂解缓冲液Sigma11814389001
ROCHE
胰蛋白酶EuroCloneCOD.
ECB3052D
4% 甲醛水溶液，电镜级Electron Microscopy Sciences157-4-100
MDA-MB-231 细胞系ATCCCRM-HTB-267
MCF7ATCCHTB-22
Transwell 小室Corning3470-Clear这些插入式小室适用于 24 孔板；
直径 6.5 mm，孔径 0.4 μm；
孔径大小

参考文献

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