开发一种人源前临床破骨细胞生成模型：外周血单核细胞与乳腺癌细胞系共培养

摘要

本方案描述了一种方法的开发过程 体外 利用乳腺癌细胞系与外周血单核细胞共培养，建立模拟癌细胞与破骨细胞相互作用的人类临床前破骨细胞生成模型。该模型可用于深入理解骨转移形成的机制，并改善治疗策略。

摘要

肿瘤细胞与骨细胞在骨微环境中的相互作用对于理解骨转移形成机制至关重要。我们开发了一种 体外 一种完全人源的乳腺癌细胞与单核细胞共培养的临床前模型，其中单核细胞向破骨细胞方向分化。我们优化了一种破骨细胞生成模型，起始于从健康供体采集的外周血样本。首先通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs），将其高密度接种，并通过添加两种生长因子（GFs）诱导其分化：核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子 （MCSF）。细胞培养14天后，进行固定并进行后续分析。在溶骨性骨转移中，癌细胞到达骨骼后的效应之一是诱导破骨细胞生成。因此，我们通过将乳腺癌细胞与单核细胞共培养，以研究癌细胞相对于生长因子（GFs）的分化诱导能力。研究癌细胞与破骨细胞相互作用的一种直接方法是采用间接共培养体系，即收集乳腺癌细胞培养的条件培养基，与新鲜培养基混合后用于诱导破骨细胞分化。我们还优化了一种直接共培养方法，使癌细胞与正在分化的单核细胞共享培养基并交换分泌因子。相较于原始的间接共培养方法，该方法具有显著优势，研究人员可观察两种细胞间的双向相互作用，并对癌细胞和破骨细胞同时进行后续分析。该模型使我们能够研究药物对转移性骨微环境的影响，并可接种非乳腺癌来源的其他细胞系。此外，该模型还可用于研究骨质疏松症或其他骨骼相关疾病。

引言

骨骼是多种原发性肿瘤（如前列腺癌、肺癌和乳腺癌）常见的转移部位，约有20%至25%的患者在病程中会发生骨转移^1,2,3。特别是乳腺癌患者，在死亡时有70%可发现骨转移的证据⁴。肿瘤细胞与基质细胞之间的相互作用对于原发癌和继发性病灶中的癌症进展均至关重要。在骨微环境中，乳腺癌引起的溶骨性骨转移依赖于癌细胞、骨细胞及骨微环境之间形成的一种病理性恶性循环。癌细胞破坏骨稳态，导致骨吸收增加^5,6,7。

在生理和病理条件下，破骨细胞是负责骨吸收的细胞，而成骨细胞通过沉积新的基质，负责新骨的形成⁸。成骨细胞通过表达RANKL调控破骨细胞的活性，RANKL可与其在前体破骨细胞表面的受体RANK结合，诱导前体破骨细胞融合，这是分化为成熟破骨细胞所必需的过程。破骨细胞生成的诱导会增加骨吸收。大量in vivo研究显著加深了我们对骨转移形成的理解^9,

方案

人破骨细胞由健康供体的外周血单个核细胞（PBMC）分化而来，这些供体均签署了书面知情同意书，同意参与本研究。研究方案经当地伦理委员会批准，符合1964年《赫尔辛基宣言》所规定的伦理标准。

1. 破骨细胞分化

注意：使用含EDTA的抗凝管采集健康人外周血或血沉棕黄层。外周血采集量不得少于20 mL。优先选用血沉棕黄层，因其单个核细胞含量更丰富。所有后续操作均须在无菌细胞培养操作台中进行。

1. 将EDTA全血与1×磷酸盐缓冲液（PBS）按1:1比例稀释，充分重悬。
2. 在50 mL离心管中加入淋巴细胞分离介质（血液PBS：淋巴ocyte separation media，2:1）。
   1. 将用 PBS 稀释的 30 mL 血液移入 50 mL 离心管中。
   2. 轻轻将15 mL淋巴细胞分离液沿50 mL离心管管壁加入管底。
3. 在室温下以 757 × g 离心 10 分钟（不使用刹车）。
4. 收集单个核细胞：
   1. 用5 mL移液管收集单个核细胞的白色层，避免扰动，转移至新的50 mL离心管中。
   2. 用20 mL PBS稀释收集的PBMCs。
5. 洗涤PBMCs：
   1. 在室温下以 225 × g 离....

结果

已优化一种方法，可轻松将人外周血单核细胞诱导分化为破骨细胞。将单核细胞与癌细胞共培养，证实了文献中所述的观点¹⁸，即癌细胞能够在骨转移灶中维持破骨细胞的生成。由癌细胞和成纤维细胞（GFs）诱导生成的破骨细胞如图1所示。破骨样细胞定义为含有4个或更多细胞核且抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色阳性（紫色细胞）的细胞。目前公认的用于定义破骨细胞的细胞核数量阈值为3个¹⁸，但本研究采用4个细胞核作为标准，以最大程度降低假阳性结果的风险。

该模型显示，乳腺癌细胞能够持续促进破骨细胞生成，因为癌细胞诱导的培养孔中破骨细胞数量与阳性对照组相当（图2）。如图2A所示，在阴性对照组中也有一定数量的细.......

讨论

临床前 体外 需要建立研究癌细胞与骨细胞间相互作用机制的模型，以揭示可用于制定新治疗策略的骨转移机制。我们开发了一种完全人源的 体外 人外周血破骨细胞生成模型（图3）。在方法优化过程中，我们识别并解决了若干关键问题。第一个问题是接种单个核细胞的数量。通过显微镜计数获得的细胞数量仅为粗略估算，因为难以区分淋巴细胞与单核细胞，而后者才是破骨细胞生成实验中需要接种的目标细胞。我们能够识别单核细胞，是因为淋巴细胞不贴附于塑料培养基质，因此在首次更换培养基时大部分已被去除。细胞接种密度较高，因为细胞间相互作用对于分化至关重要，尤其是在破骨细胞生成的第二阶段，前体破骨细胞必须彼此靠近才能融合形成成熟的破骨细胞。当存在多个实验条件时，会带来进一步困难，因为这需要大量细胞和较大量的血液。一种可能的解决方案是使用富含外周血单个核细胞（PBMCs）的血沉棕黄层（buffy coats）。 例如，4 × 10⁵-6 × 10⁶ 单个核细胞通常从50 mL的血沉棕黄层样本中收集，而收集量少于1 x 10<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
αMEM	Europclone	BE12-169F
谷氨酰胺	Life-technologies	ECB3000D
胎牛血清	Life-technologies	ECS0180DPR
hMCSF	Peprotech	300-25	必须遵守储存说明
hRANKL	Peprotech	310-01	必须遵守储存说明
白细胞酸性磷酸酶（TRAP）检测试剂盒	Sigma Aldrich	387 A
淋巴细胞分离液	Biowest	L0560-100
红细胞裂解缓冲液	Sigma	11814389001 ROCHE
胰蛋白酶	EuroClone	COD. ECB3052D
4% 甲醛水溶液，电镜级	Electron Microscopy Sciences	157-4-100
MDA-MB-231 细胞系	ATCC	CRM-HTB-267
MCF7	ATCC	HTB-22
Transwell 小室	Corning	3470-Clear	这些插入式小室适用于 24 孔板； 直径 6.5 mm，孔径 0.4 μm； 孔径大小