方法文章

乳腺癌细胞系外周血单核细胞破的人前临床模型的建立

DOI：

10.3791/56311

⸱

2017年9月13日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST), IRCCS

本文内容

摘要

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该协议描述了一个体外的发展, 从外周血单核细胞中培养的乳癌细胞系破人前模型, 模拟癌细胞-破骨细胞的相互作用。该模型可用于进一步了解骨转移形成和改善治疗方案。

摘要

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骨微环境中肿瘤细胞与骨细胞之间的串扰是了解骨转移形成机制的关键。我们开发了一个体外完全人前模型的乳腺癌细胞共培养和单核化的分化为破骨病。我们优化了一个模型的破开始从一个样本的外周血从健康的捐助者收集。外周血单个核细胞 (PBMCs) 首先通过密度梯度离心分离, 在高密度下播种, 并通过增加两种生长因子诱导分化 (GFs): 核因子-nf-配体 (RANKL) 和巨噬细胞的受体激活剂集激发因子 (MCSF). 细胞被留在培养14天, 然后通过下游分析固定和分析。在骨骨转移, 肿瘤细胞到达骨的影响之一是诱导破。因此, 我们挑战我们的模型与 co-cultures 乳腺癌细胞, 以研究的分化能力的癌细胞与 GFs 有关。一个直接的方法研究癌细胞-破骨细胞相互作用是执行间接 co-cultures 的基础上, 利用条件培养基收集的乳腺癌细胞培养和混合新鲜培养基。这种混合物用于诱导破骨细胞分化。我们还优化了直接共培养的方法, 其中癌细胞和单核细胞的分化分享媒介和交换分泌的因素。这是一个显著的改进, 在原来的间接共培养方法, 因为研究人员可以观察两个细胞类型的相互作用, 并执行下游分析的癌细胞和破骨细胞。这种方法使我们能够研究药物对转移性骨微环境的影响, 以及除乳腺癌以外的种子细胞株。该模型还可用于研究其他疾病, 如骨质疏松症或其他骨骼条件。

引言

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骨是一种常见的转移为不同类型的原发性肿瘤, 如前列腺癌, 肺癌和乳腺癌, 20-25% 的病人发展骨转移在疾病过程中1,2,3。特别是, 70% 的乳腺癌患者携带骨转移的证据在死亡4。肿瘤和基质细胞的相互作用是癌症进展的主要癌症和继发性病变。在骨骼微环境中, 乳腺癌的骨骨转移依赖于肿瘤细胞、骨细胞和骨微环境之间的病理恶性循环的建立。肿瘤细胞破坏骨平衡, 增加骨吸收5,6,7。

在正常和病理条件下, 破骨细胞是负责骨质吸收的单元, 而骨细胞, 在沉积新的基质, 负责新骨形成8。破骨细胞的活性通过 RANKL 的表达来调节, 这与其受体在 pre-osteoclast 表面的排列有关, 诱导 pre-osteoclast 融合, 这是分化为成熟破骨的必要过程。诱导破增加骨吸收。大量的体内研究显著提高了我们对骨转移形成的认识9,

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方案

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人破骨细胞与 PBMCs 的健康献血者有区别, 他们书面知情同意参与研究。根据1964《赫尔辛基宣言》中规定的道德标准, 该研究方案得到地方道德委员会的批准.

1. 破骨细胞分化

注意: 在 EDTA 中收集健康的人类捐献者的外周血或棕黄色大衣。不要使用少于20毫升的外周血。巴比大衣更可取, 因为它们有更丰富的单核细胞。在无菌组织培养罩中执行以下步骤.

  1. 稀释 EDTA 全血1:1 与1x 磷酸缓冲盐水 (PBS)。重新挂起.
  2. 淋巴细胞分离培养基上的层 (血液 PBS: 淋巴细胞分离培养基, 2:1) 在50毫升管。
    1. 吸管30毫升血液稀释到50毫升管.
    2. 将15毫升的淋巴细胞分离培养基轻轻地放在50毫升的管子底部.
  3. 757 和 #215 离心机; g 为10分钟的室温 (无刹车).
  4. 收集单个核细胞:
    1. 用5毫升吸管收集单个核细胞的白色层, 无需搅拌, 并将其放入新的50毫升管中.
    2. 用20毫升 PBS 稀释收集的 PBMCs.
  5. 清洗 PBMCs:
    1. 在室温下以 225 x g 离心5分钟。
    2. 通过倒置管丢弃上清。重复一次.

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结果

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优化了一种从人外周血单核细胞中易分化破骨的方法。单核细胞培养与癌细胞, 证实 (如文献中所描述的18), 癌细胞能够维持破骨转移。在图 1中显示了与癌细胞和 GFs 区分的破骨细胞。破骨样细胞是具有4或更多核的细胞, 对诱捕染色 (紫色细胞) 是阳性的。用于定义破骨细胞的细胞核数量的被接受的截止值是 318, 但我们决定使用4来减少误报的风险。

该模型显示, 乳腺癌细胞持续破, 因为癌细胞诱导的破骨细胞数量与阳性对照 (图 2) 相似。如图 2A所示, 许多细胞也在负控制中自发地分化成破骨。为了证实该模型的实用性, 该系统受到抗肿瘤药物的挑战12.......

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讨论

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临床前体外模型研究肿瘤细胞与骨细胞之间的串扰机制, 需要确定骨转移的机制, 以建立新的治疗策略。我们开发了一个完全人的体外模型的人外周血破 (图 3)。在方法优化过程中, 确定和解决了一些关键点。第一个是关于单个核细胞数量的种子。通过显微镜计数获得的细胞数量只是一个粗略的定量, 因为它很难区分淋巴细胞和单核细胞, 后者是破实验中的靶体细胞。我们能够识别单核细胞, 因为淋巴细胞不坚持塑料基质, 因此大多数被淘汰的第一次改变的培养基。细胞被播种在高密度, 因为它是必要的细胞能够相互作用, 以区别, 特别是在第二阶段的破, 其中 pre-osteoclasts 需要密切结合, 以融合和成为成熟的破骨细胞当有多个实验条件, 因为这些需要大量的细胞和大量的血液时, 就会出现进一步的困难。一个可能的解决方案是使用具有高浓度的 PBMCs,例如, 4 x 105-6 x 106单个核细胞通常从50毫升的棕黄色大衣样本中收集, 而少于 1 x 105 PBMCs 从20毫升血.......

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披露

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作者没有利益冲突透露。

致谢

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我们要感谢宜宾康提供 SCP2 细胞系和罗纳尔多佛娜的编辑协助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
&MEMEurocloneBE12-169F
谷氨酰胺Life-technologiesECB3000D
胎牛血清Life-technologiesECS0180DPR
hMCSFPeprotech300-25必须遵守储存指示
hRANKLPeprotech310-01必须遵守储存指示
性磷酸酶，白细胞 （TRAP） 试剂盒Sigma Aldrich387 A
淋巴细胞分离培养基BiowestL0560-100
红细胞裂解缓冲液SIgma11814389001
ROCHE
胰蛋白酶EuroCloneCOD.
ECB3052D
多聚甲醛 4% 水溶液，EM 级电子显微镜科学157-4-100
MDA-MB-231 细胞系ATCCCRM-HTB-267
MCF7ATCCHTB-22
TranswellCorning3470-Clear这些小室用于 24 孔板;
6.5 mm， 0.4 μM;
孔径
酸

参考文献

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  1. Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. Bone and cancer: the osteoncology. Clin Cases Miner Bone Metab. 10 (2), 121-123 (2013).
  2. Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. Br J Cancer. 55 (1), 61-66 (1987).
  3. Ibrahim, T., Mercata....

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OsteoclastogenesisPeripheral Blood MonocytesBreast Cancer Co cultureRANKL MCSF DifferentiationDensity Gradient CentrifugationTRAP StainingConditioned MediumDirect Co cultureGene Expression AnalysisWestern Blot

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