本文报道了一种用于操控G-四链体的单分子磁镊平台，该平台可用于研究G4的稳定性及其受多种蛋白质调控的机制。
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本文内容
摘要
摘要
非经典的核酸二级结构G-四链体（G4）参与多种细胞过程，如DNA复制、转录、RNA加工以及端粒延长。在这些过程中，多种蛋白质会结合并解旋G4结构以执行其功能。由于G4的功能通常依赖于其折叠结构的稳定性，因此研究G4结合蛋白如何调控G4的稳定性具有重要意义。本文介绍了一种利用磁力镊子操控单个G4分子的方法，可实现实时研究G4结合蛋白对单个G4分子的调控作用。总体而言，该方法适用于广泛的研究领域，可用于蛋白质/配体与各种DNA或RNA二级结构之间相互作用及调控的分析。
引言
四链DNA或RNA的G4结构在许多重要的生物学过程中发挥着关键作用1。多种蛋白质参与G4的结合与调控，包括端粒结合蛋白（端粒酶、POT1、RPA、TEBPs、TRF2）1,2、转录因子（核仁素、PARP1）3、RNA加工蛋白（hnRNP A1、hnRNP A2）4、解旋酶（BLM、FANCJ、RHAU、WRN、Dna2、Pif1）5，以及DNA复制相关蛋白（Rif1、REV1、PrimPolymerase）6。蛋白质的结合可稳定或破坏G4结构，从而调控其后续的生物学功能。G4的稳定性通常通过紫外（UV）或圆二色光谱（CD）法测定其热变性来评估7。然而，这些条件缺乏生理相关性，且难以用于研究结合蛋白的影响7。
单分子操控技术的快速发展使得能够在纳米级空间分辨率下实时研究生物大分子（如DNA或蛋白质）的折叠与去折叠过程8。原子力显微镜（AFM）、光镊和磁镊是最常用的单分子操控方法。与AF....
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方案
1. 单分子拉伸用G4 DNA的制备
- 使用DDNA聚合酶，以λ噬菌体DNA为模板，分别采用5'-巯基和5'-生物素标记的引物通过PCR制备5'-巯基标记和5'-生物素标记的双链DNA接头14（图1）。这两种双链DNA接头均具有较高的GC含量（> 60%），以防止在高拉力下或DNA过度拉伸转变过程中发生DNA熔解15。
- 使用商业纯化试剂盒纯化PCR产物，并按照生产商说明书使用BstXI限制性内切酶进行消化。
- 使用T4 DNA连接酶，按照生产商说明书将可形成G4结构的单链DNA与侧翼单链DNA及双链DNA接头进行连接。按照生产商说明书，使用商业纯化试剂盒通过凝胶回收法纯化连接产物。
2. 流通通道的制备
- 盖玻片清洗与表面功能化
- 将底部盖玻片（#1.5，22 mm × 32 mm）和顶部盖玻片（#1.5，20 mm × 20 mm）放入盖玻片染色缸中（每缸可容纳7片盖玻片，体积约为20 mL）。用蒸馏水在染色缸中冲洗盖玻片2至5次。
- 加入约 20 mL 的 5–40% 去垢剂溶液至每个广口瓶中，然后置于超声波清洗仪中清洗 30 分钟。用蒸馏水冲洗 > 重复10次以去除去垢剂。
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结果
拉伸单个G4分子的实验装置如图4所示。一段位于两个双链DNA手柄之间的单链G4形成序列，被固定在盖玻片与顺磁性微球之间。为找到单个双链DNA锚定的微球，通过以恒定加载速率增加作用力来进行过伸展实验。研究生物分子折叠与去折叠过程通常采用三种测量方式：(i) 恒力测量，(ii) 力- ramps 测量，以及 (iii) 力-跃变测量。由于该G4结构的去折叠速率极慢，其平衡态的折叠-去折叠转变仅在数天以上的时间尺度下才可能发生，因此采用力- ramps 测量和力-跃变测量来表征G4结构的去折叠动力学及其稳定性。
存在或不存在RHAU蛋白时G4解折叠的力-递增测量：
图 4B 显示了在加载速率为 0.2 pN/s 的条件下进行力.......
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讨论
如上所述，本文报道了一种利用单分子磁镊研究G4 DNA机械稳定性及其与蛋白质相互作用的平台。与该平台配套，开发了高效寻找G4 DNA连接分子、并以纳米级空间分辨率测量G4结构折叠-去折叠动力学及稳定性的实验方案。该平台采用焦平面锁定技术，实现了高度稳定的抗漂移控制，这对于在缓冲液交换实验中检测微小结构变化（如G4的步长约为7 nm）以及蛋白质相互作用至关重要。该平台最近已被用于端粒G414和c-Myc启动子G412的折叠与去折叠动力学研究，以及G4结合蛋白RHAU解旋酶的研究13。
常见的实验误差包括DNA和磁珠在盖玻片上的非特异性结合，或多个DNA分子结合到磁珠上。为减少非特异性结合，首先应定期检查APTES和SMCC等化学试剂的储存情况；其次，选择合适类型的磁珠并阻断非特异性结合至关重要。使用10 mg/mL BSA缓冲液或短DNA寡核苷酸（如poly T）封闭磁珠的疏水表面，可显著降低非特异性结合。最后，可通过DNA特征性的拉伸过渡态.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢孟盼对稿件的校对。本工作获得新加坡教育部学术研究基金第三层次（MOE2012-T3-1-001）对J.Y.的资助；新加坡机械生物学研究所通过新加坡国家研究基金会对J.Y.的资助；新加坡国家研究基金会总理办公室研究员计划（NRF研究员奖编号NRF-NRFI2016-03）对J.Y.的资助；中央高校基本科研业务费专项资金（2017KFYXJJ153）对H.Y.的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DNA PCR 引物 | IDT | DNA 样品制备 | |
| DNA PCR 化学试剂 | NEB | DNA 样品制备 | |
| 限制性内切酶 BstXI | NEB | R0113S | DNA 样品制备 |
| 盖玻片（#1.5，22*32 mm 和 20*20 mm） | BMH.BIOMEDIA | 72204 | 流动通道制备 |
| Decon90 | Decon Laboratories Limited | 流动通道制备 | |
| APTES | Sigma | 440140-500ML | 流动通道制备 |
| Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | 流动通道制备 |
| M-280 磁性微珠，链霉亲和素包被 | ThermoFisher Scientific | 11205D | 流动通道制备 |
| Polybead 氨基微球 3.00 μm | Polysciences, Inc | 17145-5 | 流动通道制备 |
| 2-巯基乙醇 | Sigma | M6250-250ML | 流动通道制备 |
| Olympus 显微镜 IX71 | Olympus | IX71 | 磁镊装置搭建 |
| 压电 Z 轴平台 P-721 | Physik Instrumente | P-721 | 磁镊装置搭建 |
| Olympus 物镜 MPLAPON-油 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | 磁镊装置搭建 |
| CCD/CMOS 相机 | AVT | Pike F-032B | 磁镊装置搭建 |
| 线性平移平台 | Physik Instrumente | MoCo DC | 磁镊装置搭建 |
| LED 光源 | Thorlabs | MCWHL | 磁镊装置搭建 |
| 立方磁铁 | Supermagnete | 磁镊装置搭建 | |
| Labview | National Instruments | 磁镊装置搭建 | |
| OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | 数据分析 |
参考文献
- Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
- Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
- Gonzalez, V., Hurley....
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重印与许可
