Method Article

改善斑马鱼幼虫实验操作的长期活体成像装置

DOI:

10.3791/56340

⸱

October 27th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, 3Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison, 4Cellular and Molecular Pathology Graduate Program, University of Wisconsin-Madison, 5Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Wisconsin-Madison, 6Department of Pediatrics, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

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这份手稿描述了 zWEDGI (斑马鱼伤人和诱捕装置的增长和成像), 这是一个条块分割的装置, 旨在定位和抑制斑马鱼幼虫。该设计允许尾部横断面和长期收集高分辨率的荧光显微图像的伤口愈合和再生。

Abstract

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斑马鱼幼虫是发育生物学和创面愈合的重要模型机体。此外, 斑马鱼幼虫是一个有价值的系统, 用于实时高分辨率显微成像的动态生物现象在空间和时间与细胞分辨率。然而, 传统的琼脂糖封装的实时成像方法可能会阻碍幼虫的发育和组织再生。因此, 这份手稿描述了 zWEDGI (斑马鱼伤人和诱捕装置的增长和成像), 这是设计和制作的功能分割装置, 以定位幼虫的高分辨率显微镜, 同时允许尾鳍横断在装置内, 随后无节制的尾部发展和再生。这种装置允许受伤和长期成像, 同时保持生存能力。鉴于 zWEDGI 模具是3D 打印, 其几何的可, 使其易于修改, 为不同的斑马鱼成像应用。此外, zWEDGI 提供了许多好处, 例如, 在实验中对幼虫的伤害或试剂的应用, 多个幼虫的平行定位, 以简化成像和设备的可重用性。

Introduction

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斑马鱼幼虫的再生能力斑马鱼使它们成为检查伤口反应的理想模型生物体以及愈合和再生1、2、3、4。进入一系列的转基因斑马鱼线和斑马鱼的解剖透明度进一步提高他们的效用在体内伤口反应事件的研究以及 longer-term 再生过程4。对这些生物过程的研究使用高分辨率的延时荧光显微镜, 因此需要一个活成像斑马鱼的设备, 允许高稳定性和最小的斑马鱼幼虫的运动, 同时保持生存能力。这是关键, 该设备允许有效的伤人, 而愈合和再生发生不受设备的影响。

活体成像中植入琼脂糖中幼虫的标准活成像稳定方法限制生长和伤口再生5 , 并且可能会增加死亡率, 因为幼虫开始显示四后的心脏应激和组织坏死的迹象小时4。因此, 从感兴趣的区域去除琼脂糖通常是必要的, 以允许正常的发育和再生6, 当琼脂糖被切断时, 将幼虫暴露在潜在的损伤中。此外, 使用琼脂糖嵌入技术, 用户必须在琼脂糖固化5

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Protocol

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注意: 根据威斯康星大学-麦迪逊分校研究动物资源中心的指导原则, 为2到4天胚乳 (dpf) 的斑马鱼幼虫制定了基本的 zWEDGI 设计.

1. 模具的设计和3D 打印

  1. 模型在3D 建模软件 5 中具有所需几何图形和属性的设备的该组件创建一个毛坯模具和该零件的组件, 并通过在与 PDSM 部件对应的模具中创建一个空腔来生成该零件的负模。将模具保存为用于3D 打印的. stl 文件 ( 图 2 , 步骤 1.1).
    注意: 此处提供的模具设计的光格式 (. stl) 文件 ( 图 1 ) 可在 https://morgridge.org/designs/上下载.
  2. 使用光3D 打印机打印模具 ( 图 2 , 步骤 1.2)。在一个单一的印刷, 如果可能的话, 使多个模具, 因此, 一个以上的设备可以塑造一个单一的一批硅橡胶.
    注: 所示的例子是用光树脂 5 在高分辨率模式下打印的, 其直径为 0.075 mm、0.05 mm 的层厚。
    1. 使用细刷子、喷雾瓶中的变性酒精和压缩空气轻轻擦洗和除去未树脂....

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Results

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zWEDGI 微流控芯片是一种功能性的分割装置, 旨在容纳四主要功能 (如下所示) 与活成像的尾鳍伤愈合和再生在斑马鱼幼虫。由于它不仅是现成的, 而且是生物相容性的行业标准, 而且在模具中也很管用, 因此选择了 zWEDGI 制造。此外, 在设备形成后, 该设备可可重复使用并使其失效。zWEDGI 具体地允许 1) 幼虫的装载入设备, 2) 克制在适当的方向为成像, 3) 损伤尾鳍和 4) 显微成像, 详细描述如下。

加载

zWEDGI 设计由3个通道组成, 每个信道都设计用于抑制一个幼虫 (图 1B)。对于幼虫的装填和初始方向, 打开的装货室是3毫米宽 (图 1A) 容纳一个大孔吸管末端为存放幼虫 (

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Discussion

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zWEDGI 装置的目的是通过在高分辨率显微镜物镜的小工作距离内稳定和定位鱼来捕捉3D 的延时成像。在满足这些设计规范的同时, 它也是对传统 agar-based 的实时成像准备的一种改进。在制造 zWEDGI 的过程中有三关键步骤 (以下), 如果不能正确完成, 可能会导致设备出现故障:

准备工作 (图 5A)

为了防止气泡, 德加德的模具后, 已增加。检查所有气泡在脱气后是否已被消除, 并注意玻璃盘的应用。玻璃盘必须在一个斜面上应用, 以确保空气不会被困在和内部。在过程的大多数步骤中, 灰尘可能是一个问题。为了防止灰尘, 彻底完成每个清洁步骤, 并在步骤之间的一个干净的遮光罩存储部件。检查模具的过剩树脂, 可能会创建一个粗糙表面之前, 紫外线固化。当打磨时, 请确保砂纸接触所有的几何图形, 以确保所有曲面都是齐平的 (图 2, 步骤 1.3)。在用异丙醇填充模具前, 应先将酒精和空气清洗干净。当挤出模具中.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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作者希望承认 Morgridge 研究所和光学和计算仪器实验室的主要项目资金。我们也承认来自 NIH 的 R01GM102924 (AH 和 KWE) 的资金。KWE 构思并设计了这项研究。在 DL、KP 和 RS 的支持下进行了所有的实验。KWE、JS、RS、AH 和对手稿的撰写贡献良多。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
制造模具
Solidworks 专业 Accedemic Research 3D 建模软件Dassault SystemesSPX0117-01Fisher Unitech
Viper Si2 SLA 3D 打印机3D Systems Inc.23200-9023D Systems 公司
Accura 60 光敏树脂3D Systems Inc.24075-9023D Systems 公司
变性酒精Sunnyside5613735Menards
紫外线后固化设备3D Systems Inc.23363-101-003D Systems Inc. 公司
TouchNTuff 丁腈手套Ansell92-600McMaster Carr
220B， 400B， 600 粒度 T414 蓝巴克砂纸 Norton66261139359， 54， 52MSC
硼硅酸盐玻璃盘，直径 2 英寸McMaster-CarrMIL-G-47033McMaster-Carr
超声波清洁剂Branson1510R-MTH
异丙醇外用酒精 70%Hydrox54845T43McMaster-Carr
10盎司透明塑料杯WNA Masterpiece557405亚马逊
6"工艺棒Perfect StixCraft WTD-500亚马逊
名称公司目录号评论
制造zWEDGI PDMS设备
Sylgard 184硅弹性套件 道康宁4019862Ellworth 胶粘剂 
10mL注射器Becton Dickinson305219Vitality Medical Inc
器Bel-Art SciencewareF42027-0000亚马逊
4英寸棘轮杆夹匹兹堡68974Harbor
Freight实验室烤箱Quincy Lab Inc.20GCGlobal Industrial
镊子套装Aven549825McMaster-Carr
压缩空气过滤喷嘴InnotechTA-N2-2000FT洁净室供应
真空台虎钳Wilton Tool Group63500MSC 工业
55mm 玻璃底盘;30mm 微孔 #1.5 盖玻片CellvisD60-30-1.5-NCellvis
等离子清洗剂Harrick PlasmaPDC-001Harrick Plasma
名称Company目录号评论
加载幼虫
Pipetteman，P200GilsonF123601
100% 乙醇（使用前用水稀释至 70%）Pharmco-aaper111000200
移液管Fisherbrand13-711-5AFisher Scientific
脱脂奶粉2902887MP Biomedicals
双蒸水
N-苯硫脲Sigma-AldrichP7629Sigma-Aldrich
三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯）C-FINQ-UEWestern Chemical
低熔点琼脂糖Sigma-AldrichA0701Sigma-Aldrich
加热块（干浴培养箱）Fisher Scientific11-718-2Fisher Scientific
E3 缓冲液 
大口径移液器吸头，200 μLFisherbrand02-707-134Fisher Scientific
通用移液器吸头，200 μLFisherbrand21-197-8EFisher Scientific
#15 手术刀刀片 Feather2976Amazon
25G 注射器针头BD BD305122Fisher Scientific
名称Company目录号评论
成像
倒置显微镜
Imaris成像软件Bitplane
干燥

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
  2. Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H.

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