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方法文章

用于改进斑马鱼幼鱼实验操作的长期活体成像装置

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DOI：

10.3791/56340

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2017年10月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, 3Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison, 4Cellular and Molecular Pathology Graduate Program, University of Wisconsin-Madison, 5Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Wisconsin-Madison, 6Department of Pediatrics, University of Wisconsin-Madison

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了 zWEDGI（斑马鱼损伤与固定装置，用于生长与成像），这是一种分区装置，旨在对斑马鱼幼体进行定向和固定。该设计允许进行尾部横切，并可长期采集伤口愈合与再生过程的高分辨率荧光显微图像。

摘要

斑马鱼幼体是发育生物学和伤口愈合研究中的重要模式生物。此外，斑马鱼幼体也是在时空维度上以细胞分辨率进行动态生物学现象活体高分辨率显微成像的宝贵系统。然而，传统的琼脂糖包埋活体成像方法可能阻碍幼体发育和组织再生。因此，本文介绍了一种名为 zWEDGI（斑马鱼伤口与固定装置，用于生长与成像）的装置，该装置经过设计与制造，具有功能分区结构，可固定幼体以进行高分辨率显微镜观察，同时允许在装置内完成尾鳍截断操作，并支持尾部后续不受限制的发育与再生。该装置可在维持幼体存活的同时实现伤口处理和长期成像。由于 zWEDGI 模具采用 3D 打印技术制造，其几何结构具有可定制性，可根据多种斑马鱼成像应用需求进行便捷修改。此外，zWEDGI 具备多种优势，包括实验过程中可接触幼体以进行造伤或试剂添加、多个幼体平行排列以实现高效成像，以及装置的可重复使用性。

引言

斑马鱼幼虫的再生能力 斑马鱼 使其成为研究伤口反应以及愈合与再生的理想模式生物1,2,3,4获得多种转基因斑马鱼品系以及斑马鱼在解剖结构上的透明性进一步增强了其在 体内 伤口反应事件以及长期再生过程的研究4因此，利用高分辨率延时荧光显微镜研究这些生物学过程需要一种活体成像斑马鱼装置，该装置可在维持斑马鱼幼体存活的同时，提供高稳定性并最大限度减少其运动。该装置的关键在于能够有效造伤，同时确保愈合与再生过程不受装置干扰。

标准的活体成像稳定方法是在活体成像过程中将幼虫包埋于琼脂糖中，但该方法会限制幼虫生长和伤口再生5 并且可能增加死亡率，因为幼虫在四小时后开始出现心脏应激和组织坏死的迹象4因此，通常需要去除目标区域的琼脂糖，以允许正常的发育和再生6，这会使幼虫在切除琼脂糖时面临潜在损伤。此外，使用琼脂糖包埋技术时，操作者必须在琼脂糖凝固前的短时间内完成幼虫的定位。5,6,7快速操作幼虫不仅需要操作者具备熟练技巧，还可能对幼虫造成损伤。尽管已有用于稳定幼虫以进行活体成像的方法被提出以克服这些缺点，例如带脊状结构的琼脂孔3 或凹痕8，使用硅基真空润滑脂与PVC管材或其他材料构建成像室6，以及旋转培养管9，这些方法中的许多都费时费力、操作繁琐、通常不可重复使用，并且无法实现环境操控（如药物处理、损伤） 等等鱼被固定后。

因此，zWEDGI 装置（图 1）被设计用于克服琼脂糖包埋法在斑马鱼幼鱼长期活体成像中存在的一些缺点，同时允许对样本进行操作。zWEDGI 包含三个半开放的分隔腔室（图 1A），可用于装载、固定、造伤及对受精后 2 至 4 天的斑马鱼幼鱼进行成像。该装置由聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane, PDMS）制成，并放置于 60 mm 玻底成像培养皿的盖玻片上。本文所述设计主要用于伤口愈合研究，但由于采用了模块化设计和标准化制造技术，zWEDGI 的设计可进行修改，适用于多种实验操作，尤其适用于需要在最小限制条件下进行实验干预和长期成像的实验流程。

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方案

注意：zWEDGI 基础设计适用于受精后 2 至 4 天（dpf）的斑马鱼幼鱼，并遵循威斯康星大学麦迪逊分校实验动物资源中心的指导原则。

1. 模具的设计与3D打印

  1. 使用3D建模软件对装置的PDMS部件进行所需几何形状和属性的建模5。创建一个空白模具与PDMS部件的装配体，并通过在模具中生成与PDMS部件相对应的空腔，从而为PDMS部件制作负模。将模具保存为用于3D打印的.stl文件（图2，步骤1.1）。
    注意：此处展示的模具设计（图1）的立体光刻格式（.stl）文件可从 https://morgridge.org/designs/ 下载。
  2. 使用光敏树脂3D打印机打印模具（图2，步骤1.2）。如有可能，在一次打印中制作多个模具，以便单批PDMS可同时成型多个装置。
    注意：示例中采用高分辨率模式打印，光束直径为0.075 mm，层厚为0.05 mm，使用光敏树脂材料5。
    1. 使用细毛刷、喷瓶中的变性酒精和压缩空气轻轻刷洗并去除未固化的树脂，清除微通道区域内的任何残留物。
    2. 将模具在紫外后固化装置中每侧各后固化60分钟，因为未固化的树脂对斑马鱼幼体具有毒性10。
  3. 在平整表面上使用200目砂纸打磨模具的空腔面，直至所有密封面均与砂纸接触（包括加样通道结构和模具边缘）。随后依次使用400目和600目砂纸轻柔打磨，使所有结构表面形成平滑齐平的表面（图2，步骤1.3）。打磨后使用百分表测量空腔深度，以确认其接近设计深度。
    1. 将模具和盖片（直径1¾英寸、厚度¼英寸的硼硅酸盐玻璃或丙烯酸材质；每个模具配一个玻璃盖片）放入盛有水的超声波清洗机中清洗30分钟，或用流动水冲洗进行清洁。
    2. 用压缩空气吹干，并用异丙醇和过滤后的压缩空气清洁模具和盖片。在洁净台中进行装置制备操作，以最大限度减少空气中颗粒物的污染。将清洗后的模具和玻璃盖片置于洁净台内或加盖培养皿中，待用。

2. zWEDGI 装置的 PDMS 制备

  1. 将PDMS（聚二甲基硅氧烷）按5:1（基础剂与活化剂比例）的比例，取184型硅弹性体基础剂和活化剂倒入塑料杯中。用木制搅拌棒充分混合2分钟，搅拌时将凝胶反复翻转，如同揉面。制作5个模具时，使用10 g基础剂和2 g活化剂。
    1. 将混合物置于真空干燥器中脱气25–45分钟，直至所有气泡完全消失。
    2. 使用10 mL注射器向每个3D打印模具的型腔中注入约0.75 mL PDMS，注至模具略微溢出并形成弯月面为止（图2，步骤2.1）。
    3. 将注满PDMS的模具再次置于真空环境中脱气45分钟，以去除填充过程中可能产生的额外气泡。
  2. 将玻璃盖片覆盖在装有PDMS的模具上，以一定角度按压盖片，防止夹入气泡（图2，步骤2.2）。在放置玻璃盖片时，允许多余的PDMS被挤出。
  3. 使用小型棘轮夹具将盖片紧密固定在模具上。
    注意：此操作可在PDMS固化后形成平整表面，并在3D打印结构与玻璃盖片齐平处形成通孔。或者，为增加一次可固化的器件数量，可构建多夹具装置（例如，图2，步骤2.3）。
  4. 将夹紧后的PDMS器件置于100 oC烘箱中固化90分钟（图2，步骤2.4）。从烘箱中取出模具，冷却至可安全操作的温度。若夹具为金属材质，应将模具与盖片组件从夹具中取出，以防金属残留热量持续加热导致PDMS过度固化。
    注意：器件在仍微热且未完全固化时最容易脱模。然而，一旦模具从烘箱中取出并移除盖片，器件可在脱模前静置数天。若在从固化烘箱取出后立即进行脱模，应将器件置于带盖培养皿中，以减少污染，同时允许其完全固化。

3. 将 zWEDGI 等离子体键合至玻璃培养皿

  1. 将含有PDMS装置的模具用台钳夹紧，使模具的结构面朝上，与工作台面平行。
    1. 使用平头镊子从模具上松开PDMS拉片，开始取出PDMS装置。用镊子沿模具边缘操作（类似于将蛋糕从烤盘中取出）（图2，步骤3.1）。
    2. 用过滤的压缩空气和镊子轻轻抓住拉片，并向装置下方吹气，将装置从模具中缓慢取出。操作时应缓慢进行，让空气帮助PDMS与模具分离，特别注意在薄壁隧道区域操作镊子时要格外小心。
  2. 将PDMS装置倒置放置在玻璃底培养皿盖的内侧，使限位隧道楔形部分接触塑料表面（图2，步骤3.2）。
  3. 将带有倒置zwedgi装置的培养皿盖及其对应的玻璃底培养皿放入等离子清洗仪中，使内侧玻璃面朝上（图2，步骤3.3）。
    1. 抽真空至等离子清洗腔室压力达到500 mTorr。
    2. 将射频（RF）功率设为高，使装置和培养皿暴露于射频下约2分钟。缓慢释放腔室压力，然后将装置和培养皿移回洁净工作台。
  4. 从培养皿盖上取下PDMS装置。将PDMS zwedgi装置翻转至正确方向，小心地将其对准玻璃底培养皿的中心孔位放置（图2，步骤3.4）
    1. 使用镊子尾部轻轻按压PDMS装置，确保其下方无气泡残留。在微通道的微小结构周围施加压力，并将PDMS平滑地压向边缘（图5C）。
      注：PDMS与玻璃之间的完全接触可确保等离子键合更牢固。zwedgi装置也可通过等离子键合固定于其他类型的玻璃底培养皿，例如玻璃底6孔板（图2C）。
    2. 在将装置培养皿从洁净工作台取出前，先在其上方盖上盖子。
      注：一旦装置固定于玻璃表面，该实验流程可暂停，直至准备使用时再继续。

4. 通道准备与幼虫装载

注意：斑马鱼的一般饲养操作按照《斑马鱼手册》进行，该手册可在线获取，网址为 http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html。成年斑马鱼及胚胎的培养条件如前所述1。实验使用野生型 AB 品系。有关活体幼鱼成像的具体要求，请遵循所在机构的动物护理规程。

  1. 使用微量移液器通过固定隧道，以每通道至少 100 µL 70%乙醇冲洗通道。吸除乙醇后，用双蒸水冲洗2至3次。静置晾干。
  2. 将脱脂牛奶（以水稀释至1%浓度）加入通道中，室温孵育10分钟，以减少幼鱼与培养皿玻璃盖玻片之间的黏附。随后，将装置轻轻浸入双蒸水中数次进行冲洗。倒置静置晾干。
    注意：本步骤可暂停。zwedgi装置的此步预处理可在使用前数天完成。请在室温下加盖保存。
  3. 通过混合100 µL已熔化的2%低熔点（LMP）琼脂糖与100 µL 2x Tricaine（0.4 mg/mL Tricaine - 乙基-3-氨基苯甲酸酯）溶于E3缓冲液11中，制备1%低熔点琼脂糖溶液，并预先将混合液加热至38 oC。将1%琼脂糖/Tricaine溶液置于加热金属块中维持在38 oC，防止凝固。
    注意：进行多光子显微成像11时，应使用无色素斑马鱼品系（如casper12），或在E3培养基中添加0.2 mM N-苯基硫脲培养幼鱼，以抑制色素形成11，从而减少色素对近红外波长的吸收。
    警示：N-苯基硫脲具有毒性。请遵循所在机构的废弃物处理规定。
  4. 将幼鱼置于含0.2 mg/mL Tricaine（Tricaine/E3）的E3缓冲液中麻醉11。等待幼鱼完全静止且对触碰刺激无反应。
  5. 用数微升Tricaine/E3预润湿通道。
    1. 使用宽口移液器吸头吸取单个幼鱼，将其放入加样通道（图3A）。用移液器吸头或类似工具调整幼鱼在加样腔中的方向，使其背侧朝向加样腔较平直的一侧，尾部朝向固定隧道（图3B）。
    2. 小心从损伤腔中抽出液体，使幼鱼流入固定隧道（图3C）。在保持幼鱼周围湿润的同时，吸除大部分液体（图3D）。可轻微倾斜培养皿朝向损伤腔，以辅助该过程。
  6. 将约38 oC的含Tricaine/E3的1% LMP琼脂糖覆盖幼鱼头部，并填满加样腔（图3E）。待琼脂糖凝固，使幼鱼保持在正确位置。根据需要向损伤腔中补充Tricaine/E3以维持湿润。对剩余两个通道重复上述加样过程。
  7. 使用注射器针头小心去除从固定隧道渗入损伤腔的多余琼脂糖（图3F）。根据实验需求，在琼脂糖上方添加Tricaine/E3（用于损伤操作、短期成像或伤口处理隔离），或加满整个培养皿（用于长期成像）。盖上培养皿盖以防止蒸发。此时可对幼鱼进行成像（未损伤状态）或实施损伤处理。

5. 幼虫的造伤与成像

  1. 使用无菌手术刀片，在脊索后方横切尾鳍11 在伤口室中（图3G，H）。根据需要添加额外的三卡因/E3，并盖上培养皿盖。
    注意：或者，根据所关注的发育时间窗口，可对幼虫进行损伤处理，随后将其置于 E3 溶液中恢复，并在 28.5 °C 培养箱中继续培养 oC）直至达到所需的成像时间，然后按照上述方法将其载入通道中。
  2. 将麻醉后的幼虫安装到 zWEDGI 装置中，并置于倒置显微镜的载物台插件上，该插件可容纳 60 mm 玻璃底培养皿。将幼虫尾部定位至最上方的通道中，根据需要旋转培养皿，使尾部处于理想位置。根据具体实验要求进行成像。
    注意：zwEDGI 可广泛应用于高分辨率光学显微成像，包括宽场荧光显微镜和激光扫描显微镜。在对斑马鱼幼鱼进行成像时需考虑多项参数，但具体的成像参数取决于所用仪器、样本及实验条件。本文中，幼鱼尾部在自行搭建的多光子显微镜上进行成像5,11 使用以下参数：40倍长工作距离水浸物镜，890 nm 激光激发，445/20 nm 发射滤光片，分辨率为 512 × 512。

6. 实验结束

  1. 从显微镜上取下 zWEDGI 培养皿。通过将 zWEDGI 置于冰水浴中或 4 oC 环境下至少 20 分钟，处死幼鱼，并确认其心跳和循环已停止。
    注意：由于幼鱼被维持在独立的隔间中，可通过镊子或移液器轻轻牵拉琼脂，单独回收每条幼鱼。可将琼脂从头部区域移除，幼鱼可用于后续操作，如固定后进行抗体染色，或用于 RNA 或蛋白质提取。
  2. 在取出幼鱼和琼脂后，按照步骤 4.1 所述方法，用乙醇和蒸馏水清洗 zWEDGI，并倒置晾干。将其存放于阴凉干燥处并加盖保存。下次使用前根据需要重新涂布脱脂牛奶（步骤 4.2）。
    注意：zWEDGI 可重复使用多次，直至 PDMS 开始从玻璃表面剥离。

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结果

zWEDGI PDMS 微流控装置是一种功能分区装置，专为斑马鱼幼鱼尾鳍损伤修复与再生过程的活体成像所需的四项主要功能（如下所列）而设计。选择 PDMS 用于 zWEDGI 的制备，不仅因为其易于获取且是生物相容性方面的行业标准材料，还因其在模具成型中具有良好的加工性能。此外，PDMS 在装置成型后可实现重复使用，并避免产生坚硬或锋利的边缘。zWEDGI 装置具体可实现以下功能：1）将幼鱼装载入装置中，2）以适合成像的正确方向固定幼鱼，3）对尾鳍进行损伤处理，以及 4）显微成像，下文将对这些步骤进行详细描述。

加载中

zwedgi 设计包含 3 个通道，每个通道用于固定一条幼虫图1B）。对于幼虫的装载和初始定位，开放的装载室宽度为 3 mm（

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讨论

zWEDGI 装置的目的是通过稳定和定向斑马鱼，使其位于高分辨率显微镜物镜的小工作距离内，从而实现三维时间序列成像。在满足这些设计要求的同时，该装置也改进了传统的基于琼脂的活体成像制备方法。zWEDGI 的制备包含三个关键步骤（如下所述），若任一步骤操作不当，均可能导致装置缺陷：

PDMS 制备（图 5A）

为防止产生气泡，在向模具中加入PDMS后应对模具进行脱气处理。脱气完成后，需检查所有气泡是否均已消除，并特别注意玻璃圆片的放置方式。放置玻璃圆片时必须倾斜操作，以确保PDMS内部及下方不会截留空气。在整个操作过程中，灰尘可能带来干扰。为防止灰尘污染，每一步清洁操作都应彻底执行，并在各步骤之间将部件存放于洁净罩内。在进行紫外固化前，应检查模具是否存在多余的树脂，以免形成粗糙表面。打磨时，应确保砂纸接触所有几何区域，使所有表面保持平整（图2，步骤1.3）。在将PDMS注入模具前，务必先用异丙醇清洁并用空气吹干...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢莫格里奇研究所（Morgridge Institute for Research）和光学与计算仪器实验室（Laboratory for Optical and Computational Instrumentation）对本项目的主要资助。我们还感谢美国国立卫生研究院（NIH）基金编号 R01GM102924（AH 和 KWE）的资助。KH、JMS、RS、AH 和 KWE 构思并设计了本研究。KH 和 JMS 在 DL、KP 和 RS 的支持下完成了所有实验。KH、JS、RS、AH 和 KWE 对论文的撰写作出了贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
制备模具
Solidworks Professional Accedemic Research 三维建模软件Dassault SystemesSPX0117-01Fisher Unitech
Viper Si2 SLA 3D 打印机3D Systems Inc.23200-9023D Systems Inc.
Accura 60 光敏树脂3D Systems Inc.24075-9023D Systems Inc.
变性酒精Sunnyside5613735Menards
紫外后固化装置3D Systems Inc.23363-101-003D Systems Inc.
TouchNTuff 丁腈手套Ansell92-600McMaster Carr
220B、400B、600 目 T414 蓝背砂纸 Norton66261139359, 54, 52MSC
硼硅酸盐玻璃圆片，直径 2"McMaster-CarrMIL-G-47033McMaster-Carr
超声波清洗器Branson1510R-MTH
70% 异丙醇擦拭酒精Hydrox54845T43McMaster-Carr
10 盎司透明塑料杯WNA Masterpiece557405Amazon
6" 工艺棒Perfect StixCraft WTD-500Amazon
名称公司目录编号备注
制备 zWEDGI PDMS 装置
Sylgard 184 硅橡胶弹性体套件 Dow-Corning4019862Ellworth Adhesives 
10 mL 注射器Becton Dickinson305219Vitality Medical Inc
干燥器Bel-Art SciencewareF42027-0000Amazon
4 英寸棘轮式条形夹具Pittsburgh68974Harbor Freight
实验室烘箱Quincy Lab Inc.20GCGlobal Industrial
镊子套装Aven549825McMaster-Carr
压缩空气过滤喷嘴InnotechTA-N2-2000FTCleanroom Supply
真空台钳Wilton Tool Group63500MSC Industrial
55 mm 玻璃底培养皿；30 mm 微孔 #1.5 盖玻片CellvisD60-30-1.5-NCellvis
等离子清洗仪Harrick PlasmaPDC-001Harrick Plasma
名称公司目录编号备注
装载幼虫
Pipetteman P200GilsonF123601
100% 乙醇（使用前用水稀释至 70%）Pharmco-aaper111000200
移液管Fisherbrand13-711-5AFisher Scientific
脱脂奶粉粉末2902887MP Biomedicals
双蒸水
N-苯基硫脲Sigma-AldrichP7629Sigma-Aldrich
三卡因（乙基-3-氨基苯甲酸酯）C-FINQ-UEWestern Chemical
低熔点琼脂糖Sigma-AldrichA0701Sigma-Aldrich
加热块（干浴孵育器）Fisher Scientific11-718-2Fisher Scientific
E3 缓冲液 
大孔移液枪头，200 µLFisherbrand02-707-134Fisher Scientific
通用移液枪头，200 µLFisherbrand21-197-8EFisher Scientific
#15 手术刀片 Feather2976Amazon
25G 注射器针头BD BD305122Fisher Scientific
名称公司目录编号备注
成像
倒置显微镜
Imaris 成像软件Bitplane

参考文献

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